札如病毒实时荧光RT-PCR的建立与应用

目的 建立一种可快速、全面、准确检测人感染札如病毒的TaqMan探针荧光实时RT-PCR方法。方法 利用Bioedit2.0、MAGE6.0软件对可感染人的GⅠ、GⅡ、GⅣ、GⅤ基因群札如病毒进行保守序列比对,应用Primer6.0、Primer Express 3.0进行引物和TaqMan探针的设计与评价,分别设计了两套引物及TaqMan探针,克隆相应靶基因并构建阳性标准品,建立及优化一步法实时荧光RT-PCR反应体系,并进行灵敏度、特异度、临床标本验证试验。结果 根据基因序列比对分析,札如病毒ORF1与ORF2连接区具有相对高保守序列,针对GⅠ、GⅡ、GⅣ及GⅤ设计了一条共用的下游引物、以及两套上游引物和TaqMan探针,能覆盖当前GenBank可见的感染人的札如病毒基因型,在同一反应管中建立了同时检测札如病毒四个基因群的实时荧光RT-PCR,并可将GⅤ与GⅠ、GⅡ、GⅣ进行初步分型,对人柯萨奇病毒、诺如病毒、轮状病毒、腺病毒等非靶标病原体无扩增,仅对札如病毒有特异扩增,最低检测下限为10拷贝/反应。结论 本研究建立了札如病毒一步法实时荧光RT-PCR反应体系,可将GⅤ与GⅠ、GⅡ、GⅣ区分开来,为腹泻疫情防控和风险评估提供快速、准确的病原学依据。     

常见腹泻病毒的多重荧光RT-PCR检测方法的建立及临床应用

目的：建立能同时检测病毒性腹泻病人粪便中星状病毒(Astrovirus)、A族轮状病毒(Group A Rotavirus)、肠道腺病毒(Enteric Adenovirus)、诺如病毒 GI/GII(Norovirus GI/GII)的多重荧光RT-PCR方法。方法：根据各病毒基因组保守性序列设计引物和探针,建立多重荧光RT-PCR检测方法。对建立的多重荧光RT-PCR方法进行特异性、敏感性、灵敏性实验,并使用该法对256份病毒性腹泻粪便标本进行检测,同时使用基因测序进行验证。结果：成功建立常见腹泻病毒的多重荧光RT-PCR检测方法,对星状病毒、轮状病毒、肠道腺病毒、诺如病毒以外的病原体不发生扩增反应。该法检测星状病毒、轮状病毒、肠道腺病毒、诺如病毒的灵敏度可达500copies/ml。256份标本中：星状病毒、轮状病毒、肠道腺病毒、诺如病毒阳性率分别为3.13%( 8/256),42.97%(110/256),9.38%( 24/256),10.16%(26/256),与基因测序方法检测结果符合率达到100%。结论：该多重荧光RT-PCR检测方法具有快速、灵敏、特异的的优点,可用于临床病原诊断。     

阿尼昂尼昂病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的 建立阿尼昂尼昂病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法.方法 针对阿尼昂尼昂病毒nsP1基因设计特异性引物和探针,以珠海国际旅行卫生保健中心之前构建的MS2病毒样颗粒为标准品,采用一步法建立实时荧光定量RT-PCR检测方法,并对该方法的检测下限、特异性、精密度、抗干扰能力、符合率进行评价.结果 建立的阿尼昂尼昂病毒实...     

东莞市2012年病毒性腹泻监测结果分析

目的分析东莞市病毒性腹泻中轮状病毒和诺如病毒的感染情况。方法收集2012年1月至2012年12月东莞市人民医院、高埗医院、寮步医院腹泻门诊病人粪便标本,采用ELISA法检测轮状病毒,采用Realtime RT-PCR方法检测诺如病毒。结果检测粪便样品共831份,轮状病毒和诺如病毒的检出率分别为15.64%和17.57%。轮状病毒感染有明显的季节特征,秋冬季为发病高峰;诺如病毒感染则无特殊的季节特征,阳性样品以GⅡ型为主。0~3岁年龄组患者的感染率显著高于3岁以上年龄组患者。结论病毒性腹泻全年均可发生,冬季的感染率较高。各年龄组男女性人群都可感染。应加强对病毒性腹泻,尤其是婴幼儿病毒性腹泻的监测。     

东莞市病毒性腹泻病原学分析

目的了解东莞市病毒性腹泻的病原学分布情况。方法收集2010年7月至2012年9月东莞市东华医院感染性腹泻患者的粪便样品,采用ELISA方法检测轮状病毒,采用Realtime RT-PCR方法检测诺如病毒,采用RT-PCR方法检测星状病毒,采用Realtime PCR方法检测腺病毒。结果检测粪便样品共224份,诺如病毒、轮状病毒、腺病毒、星状病毒检测阳性率分别为17.9%、11.6%、4.5%,0.4%,总检测阳性率为31.3%。对其中22份轮状病毒阳性样品进行血清分型,结果G血清型中,G1型10株,G2型1株,G3型8株,G9型3株。P血清型中,P6型1株,P8型12株,9株未能分型。40株诺如病毒全部为GⅡ型。1株星状病毒经测序分析为1型。结论东莞市腹泻病毒主要感染3岁以下的婴幼儿,诺如病毒和轮状病毒为主要病原体,轮状病毒的分布呈多样性,以G1型为主。     

柯萨奇病毒B5巢式RT-PCR检测方法的建立

目的:建立一种快速、灵敏、特异的柯萨奇病毒B5(CVB5)检测方法。方法:根据GenBank发表的CVB5河南分离株全基因组序列,在其VP1区设计并合成巢式RT-PCR引物,优化PCR反应条件,建立检测CVB5的巢式RT-PCR方法。将已测得TCID50的病毒标准株进行10倍梯度稀释后用上述方法检测,以评价该方法的灵敏性;将5株不同的CVB5毒株和EV71等4株其他肠道病毒毒株及阴性对照用该方法进行扩增,以检测其特异性。用建立的巢式RT-PCR方法对52份病毒性脑炎病例样本进行检测。结果:该方法对CVB5的两轮PCR扩增敏感性分别为10TCID50和10-4TCID50;所有CVB5毒株用该方法扩增结果均为阳性,所选其他肠道病毒扩增结果均为阴性。52份临床病例样本中检出10份CVB5阳性,阳性率为19.23%。结论:所建立的CVB5巢式RT-PCR检测方法具有良好的灵敏度和特异度。     

ELISA法、荧光免疫法及PCR检测婴幼儿腹泻常见病毒

目的 了解不同方法学检测婴幼儿腹泻常见病毒的检测结果差异及一致性情况.方法 采用酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫荧光法(四联法)及聚合酶链式反应(PCR)技术筛查深圳市福田区引起临床婴幼儿急性腹泻的轮状病毒(RV)、肠道腺病毒(EAdV)、诺如病毒(NV)和星状病毒(AstV)的抗原,并将检测结果数据进行对比.结果酶免法与荧光免疫法检测数据对比:对RV,NV,EAdV的抗原阳性检出率差异有统计学意义(P＜0.05),对AstV抗原阳性检出率差异无统计学意义(P＜0.05);两种方法对RV的检测结果具有较好的一致性(Kappa值为0.558),对NV,EAdV和AstV的检测结果一致性较差(Kappa值分别为0.142,-0.025和0.361);ELISA法和PCR检测数据对比:ELISA法除对EAdV阳性检出率低于PCR外,对其他3种病毒的阳性检出率均高于PCR,且经x2检验显示两种方法对4种病毒的阳性检出率差异均有统计学意义(P＜0.05).两种方法对RV,NV,AstV的检测结果具有很好的一致性(Kappa值均＞0.75),对EAdV的检测结果一致性较好(Kappa值为0.537);荧光免疫法(四联法)和PCR检测数据对比:除AstV外,两种方法对其他3种病毒的阳性检出率差异均有统计学意义(P＜0.05).对RV的检测结果具有很好的一致性(Kappa值为0.764),对EAdV的检测结果一致性较好(Kappa值为0.452),NV和AstV的检测结果一致性差(Kappa值分别为0.181和-0.017).结论 ELISA法和荧光免疫法(四联法)对腹泻病毒的检测,除轮状病毒外,其它病毒检测结果的一致性较差,只可用于腹泻病原的初步筛查,确认必须进一步做培养或分子诊断;ELISA法、荧光免疫法(四联法)与PCR三者间的阳性检出率差异均有统计学意义,ELISA法与PCR检测结果的一致性明显较好.以PCR检测结果作为评估标准,ELISA法对四种腹泻病毒抗原的检测灵敏度、特异性及准确性均优于荧光免疫法,荧光免疫法检测结果的假阳性率较高.     

登革热病毒RNA实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的 建立TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR方法,测定登革热病毒(DV)及DV病毒的RNA拷贝数.方法 利用TaqMan探针,建立实时荧光定量RT-PCR方法,通过对登革热病毒RNA定量外标准品的定量分析,优化反应体系.检测TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR方法的灵敏度、特异性和重复性.结果 该方法检测灵敏度可达1×103 copies/mL,特异性及重复性良好,对同一样品进行5次重复检测,其循环阈值的平均标准偏差为O.792.结论 TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定登革热病毒及DV RNA载量.     

2018年德州市病毒性腹泻监测分析

目的研究德州市2018年病毒性腹泻感染情况,为病毒性腹泻的预防及控制工作提供科学依据。方法采用实时荧光PCR技术对2018年德州市病毒性腹泻常规监测病例全部588份粪便标本,进行轮状病毒和诺如病毒的核酸检测,并使用SPSS 20.0软件分析。结果 588份标本总阳性率为29.25%(172/588),其中轮状病毒阳性率为18.20%(107/588),诺如病毒阳性率为11.05%(65/588),混合感染15份,占总阳性检出的8.72%。病毒阳性率最高的为0～<1岁组,阳性率为32.26%,10～<50岁组检出率最低,为14.78%。轮状病毒流行高峰期为1至3月份,其中2月阳性率最高,为52.83%;诺如病毒无明显季节特征,3月份阳性率较高,为22.73%。阳性率最高的3个地区依次是禹城、夏津和陵城,分别为43.48%、42.86%和42.00%;阳性率最低的3个地区依次是乐陵、齐河和武城,分别为6.66%、14.28%和15.00%。结论 2018年德州市病毒性腹泻感染的主要病原体为轮状病毒,高危人群为<1岁的婴幼儿,1至3月为流行高峰期。     

东莞市2010—2016年病毒性腹泻监测及分析

目的 了解东莞市病毒性腹泻的病原体谱构成及流行情况,为东莞市病毒性腹泻防治提供资料依据。方法 2010年7月开始,每周从监测点医院采集感染性腹泻患者的粪便样品,采用 ELISA方法检测轮状病毒抗原,荧光PCR方法检测诺如病毒、腺病毒、星状病毒核酸。结果 2010—2016年共检测粪便样品5 026份,全部检测轮状病毒和诺如病毒,其中600份检测腺病毒和星状病毒。4种病原体的阳性率分别为15.96%(802/5 026)、14.56%(732/5 026)、5%(30/600),1.33%(8/600),总检测阳性率为 30.18%。轮状病毒、诺如GⅡ型病毒、腺病毒、星状病毒发病集中在2岁以下低龄儿童,各病原体2岁以下儿童感染比例分别为69.10%、62.26%、82.14%、71.43%。轮状病毒每年有1个流行高峰,每年12月份至次年1月达高峰。诺如GⅡ型病毒每年有2个流行高峰,3月和8月达高峰。结论 监测的4种病原体中,轮状病毒和诺如病毒为病毒性腹泻的主要病原体,两者的阳性率相近。诺如病毒以GⅡ型为主。轮状病毒、诺如GⅡ型病毒、腺病毒和星状病毒主要感染2岁以下的婴幼儿,轮状病毒和诺如GⅡ型病毒感染有较强的季节性。     

广州市医院成人病毒性腹泻的分子流行病学研究

目的了解广州市医院门诊成人病毒性腹泻的感染情况和分子流行病学特征。方法2011年6月至2012年5月在广州市两家哨点医院收集门诊18岁以上腹泻患者粪便标本127份。采用酶联免疫技术检测A群轮状病毒,逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测粪便标本中的诺如病毒、星状病毒和札幌病毒,聚合酶链反应（PCR）检测腺病毒。结果共127份腹泻患者粪便标本,其中男性占54．33％（69／127）,女性占45．67％（58／127）,年龄以60岁以上所占比例最高,为25％（7／28）。127份粪便标本中,单一腹泻病毒感染25份,阳性率19．69％,其中检出轮状病毒阳性7份,阳性率5．52％（7／127）;诺如病毒阳性11份,阳性率8．66％（11／127）;札幌病毒3份,腺病毒阳性3份,阳性率均为2．36％（3／127）;星状病毒1份,阳性率0．79％（1／127）。未见混合感染,发病具有明显的秋冬季节升高现象,诺如病毒、札幌病毒、腺病毒、星状病毒流行株为别为GII-4型、GI-2型、AD41和HAstV-1。结论医院就诊成人腹泻病例中约I／4为病毒性腹泻．其中诺如病毒是最重要的病原体,感染对象主要是60岁以上人群。     

脑心肌炎病毒（EMCV）RT-PCR检测方法的建立及初步应用

目的 建立脑心肌炎病毒（EMCV）RT-PCR检测方法,应用于长爪沙鼠、小鼠等实验动物EMCV的检测.方法 根据已发表的EMCV VP1基因序列设计合成引物.建立RT-PCR方法,并对方法的特异性、敏感性、稳定性等进行验证.用该方法检测62只长爪沙鼠、12只小鼠.结果 建立的EMCV RT-PCR检测方法特异、敏感、稳定.以EMCV RNA逆转录产物为模板,所能检测RNA最小模板浓度为4.1 pg/μL,可检测病毒最小滴度为10-7mL-1.经RT-PCR检测,62只沙鼠均为阴性;12只小鼠中有1只EMCV核酸阳性,测序结果与GenBank中EMCV标准株核苷酸序列进行比对,其同源性为85%.结论 建立的脑心肌炎病毒（EMCV）RT-PCR检测方法特异、敏感、稳定,可用于长爪沙鼠、小鼠等实验动物EMCV的检测.     

双重实时荧光RT-PCR法检测肠道病毒方法的建立及应用

目的 建立检测肠道病毒(EV)和肠道病毒71型(EV71)的双重实时荧光RT-PCR法.方法 设计特异性引物和探针,建立双重实时荧光RT-PCR反应体系,绘制标准曲线,对该方法的灵敏度、精密度等进行评价.收集109例临床手足口病患者粪便和咽拭子标本用该法进行检测,并与EV71商品化试剂盒检测结果进行比较.结果 双重荧光PCR法建立的EV和EV71标准曲线相关系数(r)均为0.998;该法检测EV和EV71的灵敏度分别达到0.5 TCID50/mL和0.05 TCID50/mL;检测EV和EV71的批内精密度均小于3％,总精密度均小于或等于4％;对肠道病毒及其他人类非肠道病毒进行检测,显示了良好的特异性.109例临床样本用该法检测出84例EV病毒阳性样本,其中EV71阳性56例,EV71总阳性率为51.4％;与单重荧光PCR商品化试剂盒的检测结果完全一致(P=1.000).结论 建立的双重实时荧光RT-PCR法灵敏度高、稳定性好,对手足口病的早期高通量快速诊断具有重要意义.     

I型鸭肝炎病毒TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立及初步应用

目的 建立快速诊断I型鸭肝炎病毒的荧光定量RT-PCR方法。方法 根据NCBI下载的20个来自我国不同省份的的I型鸭肝炎病毒的基因序列,找出其保守序列,设计合成一对引物和一条TaqMan探针,进行条件优化,检测其特异性,敏感性,稳定性。结果 该方法敏感性达20拷贝,比常规PCR敏感性高。其特异性强,对番鸭细小病毒(MDPV),鹅细小病毒(GPV),新城疫病毒(NDV)和禽流感(AIV),鸭减蛋综合征病毒(EDSV),禽网状内皮组织增生症病毒(REV),鸭坦布苏病毒(DTMUV),禽呼肠弧病毒(ARV)8种病毒的检测均为阴性,I型鸭肝炎病毒检测结果为阳性。用建立的方法检测了江苏徐州采集100份样品,阳性率为92%。说明I型鸭肝炎病毒在江苏徐州地区的鸭群中普遍存在。结论 建立了I型鸭肝炎病毒荧光定量PCR方法。     

实时荧光RT-PCR法快速检测流感病毒的应用研究

目的应用实时荧光RT-PCR快速检测2009～2012年河池市流感病毒核酸,为流感的预防控制提供科学依据。方法采集河池市哨点医院的流感样病例和暴发疫点现患病例的咽拭子标本,采用实时荧光RT-PCR方法进行流感病毒核酸检测分型。结果以实时荧光RT-PCR法检测2 090份标本,流感病毒核酸阳性801份,总阳性率为38.28%。其中甲型H1N1流感468份,B型126份,季节性流感H1亚型14份,季节性流感H3亚型109份。结论实时荧光RT-PCR法检测流感病毒具快速、操作方便、特异性强、灵敏度高等优点,值得推广应用。     

广州流动儿童病毒性腹泻监测

目的了解广州流动儿童病毒性腹泻的感染情况。方法收集2010年5月至2011年4月广州市白云区某社区卫生服务站241例流动儿童腹泻患者的人口资料学以及粪便标本,利用酶联免疫技术(ELISA)检测轮状病毒(RV),采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测标本中诺如病毒(NVs)、星状病毒(AstV),聚合酶链反应(PCR)法检测腺病毒(AdV)。结果 241例患者粪便标本中RV、NVs、AdV、AstV4种病毒总检出率为56.0%(135/241),各病毒检出率分别为43.6%(105/241)、11.2%(27/241)、7.9%(19/241)、6.6%(16/241)。27株NVs阳性毒株均为GII-4;19株AdV中14株为AdV-41型,并有AdV1、2、3、31型的散在感染;AstV感染15株,均为AstV-1型。结论病毒为流动儿童腹泻的重要病因,其中轮状病毒是最主要的病原体,其他依次为NVs、AdV和AstV。     

韶关市哨点医院病毒性腹泻病原学特征分析

目的 了解本地区病毒性腹泻的病原体分布情况,为制订防控对策提供依据.方法 2012年1月至2013年12月从韶关市粤北人民医院收集感染性腹泻患者的粪便标本,采用ELISA方法检测轮状病毒(RV),采用荧光定量RT-PCR方法检测诺如病毒(NV).结果 共检测粪便标本431例,阳性数为242例,总阳性率为56.15％,其中轮状病毒和诺如病毒阳性率分别为29.7％、36.19％,两种病毒阳性率差异有统计学意义(x2=4.12,P＜0.05);轮状病毒流行主要在秋冬季,诺如病毒则主要在夏秋季;0～岁组阳性率最高,各年龄组间阳性率差异无统计学意义(x2=0.01～1.39,P＞0.05).结论 病毒性腹泻病原体以诺如病毒和轮状病毒为主,诺如病毒感染以GⅡ型为主,;婴幼儿和老年人应该加强病毒性腹泻的监测.