联合应用p38MAPK抑制剂对降低结肠癌阿霉素耐药性的影响

目的:探讨p38 MAPK抑制剂通过Akt(蛋白激酶B)有关的信号途径对结肠癌细胞阿霉素(Doxorubicin)化疗敏感性的影响.方法:应用阿霉素(Dox)和p38 MAPK特异性抑制剂SB203580及两者联合应用去处理结肠癌HCT-116细胞株.采用MTT[3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐]法检测化疗药物对肿瘤细胞的生存抑制率,Western blot蛋白免疫印迹技术检测化疗药物处理后癌细胞Akt和磷酸化Akt的表达水平.结果:MTT显示阿霉素和抑制剂SB203580对结肠癌细胞均有抑制作用(26.60%,33.87%),后者大于前者,两者相同用量联合后癌细胞抑制率更明显(56.04%).Western blot显带说明阿霉素处理组较联合组的Akt表达水平并无明显差异,而磷酸化的Akt水平较SB203580组和联合组显著升高.亦即抑制剂组和联合组方案可降低结肠癌细胞磷酸化Akt的表达水平.结论:p38 MAPK抑制剂SB203580可能通过阻断P13K/Akt信号途径或其他有关Akt的通路以提高结肠癌细胞阿霉素化疗的敏感性.     

黄连素逆转人结肠癌细胞奥沙利铂耐药性的作用及机制

［摘要］　目的　探究黄连素（Ber）逆转人结肠癌细胞奥沙利铂(OXA)耐药性的作用及机制。方法　选用人结肠癌耐OXA细胞THC-8307/OXA进行实验,分为对照组、OXA组和Ber（5、10、20 μg/ml）+OXA组。采用倒置相差显微镜观察细胞形态,MTT法检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡率,RT-qPCR检测MDR-1 mRNA的表达,Western blot检测P-gp、PI3K、Akt和p-Akt蛋白的表达。结果　与OXA组比较,Ber（5、10、20 μg/ml）+OXA组的细胞存活率显著降低（P<0.05）,凋亡率显著升高（P<0.05）;MDR-1 mRNA、P-gp蛋白、p-Akt蛋白、PI3K蛋白的表达水平及p-Akt/Akt值均显著降低（P<0.05）。其中Ber（10、20 μg/ml）+OXA组的效应显著高于Ber（5 μg/ml）+OXA组,Ber（20 μg/ml）+OXA组的效应显著高于Ber（10 μg/ml）+OXA组。OXA组与对照组的检测结果比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论　Ber可显著逆转THC-8307/OXA细胞对OXA的耐药性,其作用机制可能与PI3K/Akt信号通路抑制,P-gp蛋白表达下调有关。     

AKT抑制剂对结肠癌细胞生物活性及β-catenin信号的影响

目的 分析丝氨酸/苏氨酸激酶(AKT)抑制剂对结肠癌细胞生物活性及β-catenin信号的影响。方法 取对数生长的5×10³的SW480细胞,分别加入0.0、2.5、5.0、10.0μmol/L的MK2206干预24 h,采用显微镜观察SW480细胞形态;CCK-8检测存活率;克隆实验检测细胞克隆数目;采用Hoechst荧光染色检测凋亡率;分别采用Western印迹及聚合酶链反应(PCR)检测细胞中β-catenin、p-AKT蛋白及mRNA表达。结果 2.5、5.0、10.0μmol/L处理下的SW480细胞均与0.0μmol/L组相比差距较大(P<0.05),5.0μmol/L处理下的SW480存活率低于2.5μmol/L(P<0.05),10.0μmol/L处理下的SW480存活率最低,且具有时间剂量依赖性,2.5μmol/L组SW480细胞克隆数目显著低于0.0μmol/L组(t=3.080,P<0.05),5.0μmol/L组显著低于2.5μmol/L组(t=5.385,P<0.05),10.0μmol/L组显著低于5.0μmol...     

miR-126在人结肠癌细胞中的表达及其对结肠癌细胞耐药性的影响

目的探讨miR-126在人结肠癌细胞中的表达及其对结肠癌细胞的耐药性影响。方法采集我院肿瘤科2010年7月至2013年8月收治的45例结肠癌患者的癌组织、癌旁组织及30例同期体检健康对象的正常结肠组织(正常组织),采用荧光PCR检测miR-126表达水平;体外培养HCT116细胞,通过转染抑制序列抑制miR-126的表达,检测抑制HCT116细胞miR-126的表达对结肠癌细胞耐药性的影响。结果结肠癌组织的miR-126阳性表达率显著低于癌旁组织、正常组织(P0.05);癌旁组织的miR-126阳性表达率低于正常组织但差异不显著(P0.05);miR-126表达在年龄、性别、分化程度、肿瘤大小间差异不显著(P0.05),不具统计学意义;miR-126表达与淋巴结转移、Dukes分期、临床分期具有显著的相关性,且miR-126表达水平在各个层之间差异显著(P0.05);在0、5、10、20 mg/L的奥沙利铂培养基中,miR-126阳性组的癌细胞活性(吸光度值)均显著低于miR-126阴性组且差异具有统计学意义(P0.05)。结论结肠癌组织中的miR-126阳性表达率较低,癌细胞组织中的miR-126阳性表达有利于降低癌细胞的耐药性,有利于对结肠癌的治疗效果。     

p38MAPK抑制剂增强人宫颈癌细胞对顺铂的敏感性

目的 探讨p38 MAPK抑制剂通过蛋白激酶B(Akt)有关的信号途径对人宫颈癌细胞顺铂(CDDP)化疗敏感性的影响.方法 应用CDDP和p38MAPK特异性抑制剂SB203580及两者联合应用处理人宫颈癌Hela细胞株.采用MTT法检测化疗药物对肿瘤细胞的生存抑制率,Western印迹技术检测化疗药物处理后Akt和磷酸化Akt的表达水平.结果 MTT显示CDDP和SB203580对人宫颈癌细胞均有抑制作用(24.34％,36.58％),两者相同用量联合后癌细胞抑制率更明显(58.76％).Western印迹结果说明CDDP处理组与联合处理组Akt表达水平无明显差异,而pAkt水平较SB203580组和联合组显著升高.结论 p38 MAPK抑制剂SB203580可能通过阻断PI3K/Akt途径或其他有关Akt的通路提高人剧颈癌细胞CDDP化疗的敏感性.     

环氧合酶-2抑制剂降低结肠癌细胞血管内皮生长因子表达的影响及机制

目的探讨选择性环氧合酶(COX)-2抑制剂celecoxib影响结肠癌HT-29细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达的机制。方法体外培养结肠癌HT-29细胞,采用MTT法检测celecoxib对HT-29细胞增殖的影响。同时针对Sp1和Sp4进行RNA干扰,应用RT-PCR和Western印迹法联合检测celecoxib组和干扰组对HT-29细胞Sp1、Sp4和VEGF m RNA和蛋白表达的影响。结果随着药物浓度的增加(5、10、20、40和80μmol/L)和作用时间的延长(2、4、8、16和32 h),celecoxib对HT-29细胞的增殖具有显著抑制作用,在2、4、8、16和32 h时的半数抑制浓度(IC50)分别为40.36、33.15、31.67、30.94和31.54μmol/L。RT-PCR和Western印迹检测显示,celecoxib可显著降低HT-29细胞Sp1、Sp4和VEGF m RNA和蛋白的表达水平,同时经RNA干扰Sp1(Sp4)后,HT-29细胞Sp1(Sp4)和VEGF m RNA和蛋白的表达水平明显降低,但Sp4(Sp1)m RNA和蛋白表达变化不明显。结论 celecoxib可抑制结肠癌HT-29细胞增殖,其作用机制可能是通过下调Sp1和Sp4表达水平而降低结肠癌细胞中VEGF的表达水平。     

联合应用活性氧抑制剂对降低胃癌顺铂耐药性的影响

目的探讨活性氧抑制剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)通过Akt(蛋白激酶B)有关的信号途径在胃癌细胞中对顺铂化疗敏感性的影响。方法应用化疗药物顺铂以一系列梯度浓度处理对数期生长的胃癌BGC-823细胞,通过MIT法检测顺铂对BGC-823细胞增殖抑制率的影响,应用顺铂和活性氧抑制剂NAC单独及联合应用处理胃癌BGC细胞后测定细胞的活性氧水平以及Akt及磷酸化Akt的表达水平。结果顺铂对胃癌细胞有明显的抑制作用,呈浓度依赖性。单用顺铂组活性氧水平高于联合用药组;顺铂联合应用活性氧抑制剂NAC组与单用顺铂或活性氧抑制剂组的Akt表达无统计学意义(P>0.05),而磷酸化Akt的表达下调(P<0.05)。结论活性氧抑制剂NAC可能通过阻断P13K/Akt信号途径或其他有关Akt的信号通路以提高癌细胞对顺铂化疗的敏感性。     

siRNA沉默ERCC1基因表达对结肠癌细胞奥沙利铂耐药的影响和机制

目的 采用小干扰RNA(siRNA)技术作用于人结肠癌细胞HCT116中的ERCC1,探讨其对结肠癌铂类耐药细胞株增殖、凋亡的影响。方法 体外培养结肠癌奥沙利铂耐药细胞株HCT116/L-OHP并验证其耐药性;qRT-PCR和蛋白印迹技术检测细胞和组织中ERCC1表达量的变化;采用siRNA-NC和siRNA-ERCC1转染细胞,CCK-8法检测耐药细胞的增殖能力,流式细胞术检测耐药细胞的凋亡变化。结果 结肠癌耐药组织和人结肠癌耐药细胞HCT116/L-OHP ERCC1的表达水平明显升高(P<0.05);转染siRNA ERCC1后,HCT116/L-OHP细胞中的ERCC1 mRNA和蛋白水平明显降低(P<0.05);奥沙利铂联合处理后,siRNA ERCC1转染使HCT116/L-OHP细胞的增殖活性下降、凋亡率升高。结论 siRNA能有效下调ERCC1基因表达,抑制细胞增殖,增加细胞凋亡,增强奥沙利铂对耐药细胞株HCT116/L-OHP的杀伤作用。     

蛋白酶体抑制剂MG132对结肠癌细胞lovo侵袭力的影响

目的探讨小剂量蛋白酶体抑制剂MG132对结肠癌细胞(lovo)侵袭能力的影响。方法采用不同浓度MG132不同时间点分别作用于lovo细胞,用四甲基偶氮盐比色法(MTT法)检测lovo细胞抑制率;设定MG132浓度为0.5μmol/L、1μmol/L,分别作用lovo细胞24 h,倒置显微镜观察细胞形态学变化,Transwell小室检测MG132对lovo细胞的穿透基底膜能力的影响。结果低剂量MG132对lovo细胞生长无明显抑制,而细胞侵袭力较未处理组明显减弱(P<0.05)。结论低剂量MG132可使结肠癌lovo细胞侵袭能力减弱。     

奥沙利铂对人结肠癌细胞凋亡及FADD的影响

以不同浓度（0、25、50和100μg/ml）的奥沙利铂干预体外培养的人结肠癌细胞株（SW480）,分别于12、24和48 h后,应用四甲基偶氮唑盐比色法检测细胞的增殖活性,流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡率,半定量RT-PCR检测Fas相关死亡结构域蛋白（FADD）mRNA水平,Western blotting检测FADD蛋白水平。结果奥沙利铂对SW480生长增殖具有明显抑制作用,其效应呈浓度和时间依赖性,SW480细胞呈G2/M期阻滞;SW480细胞的凋亡率呈浓度依赖性的增加（P〈0.05）。不同浓度的奥沙利铂处理SW480细胞株24 h后,FADD mRNA和蛋白水平呈浓度依赖性增加。提示奥沙利铂能诱导SW480细胞凋亡,其作用机制可能与其激活凋亡死亡受体途径使FADD表达上调有关。     

应用芯片技术筛查人结肠癌羟基喜树碱多药耐药相关微RNA的研究

目的 探讨新一类调控分子微RNA(miRNA)在人结肠癌羟基喜树碱多药耐药中的作用,为逆转肿瘤化学治疗的多药耐药性提供新的靶点.方法 运用miRCURYTM LNA Array V8.1版芯片检测人结肠癌细胞SW1116和人结肠癌羟基喜树碱多药耐药细胞SW1116/HCPT的miRNA表达谱,筛选出具有表达差异的miRNA(2倍以上).通过PiTcar,Targetscan,MIRanda等算法在线搜寻差异表达miRNA的靶基因.利用茎环特异miRNA引物反转录特异的miRNA,并采用荧光定量PCR法对个别差异表达的miRNA进行验证.结果 用于芯片分析的总RNA的吸光度比值分别为1.93(SW1116)和1.94(SW1116/HCPT).琼脂糖变性凝胶电泳进一步验证总RNA质量符合芯片要求.通过芯片检测后发现SW1116/HCPT相比SW1116表达下调的miRNA共有28条,表达上调的有36条.根据靶基因预测结果,我们选取其中2条表达下调hsa-miR-452,hsa-miR-373*和1条表达上调hsa-miR-506进行荧光定量PCR验证,hsa-miR-452和hsa-miR-506的结果与芯片相符合,但hsa-miR-373*表达量不足以由荧光定量PCR检测出.结论 miRNA表达量的改变可能在人结肠癌羟基喜树碱多药耐药中起有关键作用.     

Apoptosis induction by p38 MAPK inhibitor in human colon cancer cells

BACKGROUND/AIMS: The p38 mitogen-activated protein kinases (p38 MAPKs) function in a wide variety of signaling pathways. However, the role of p38s is cell type- and stimulus-dependent. The present study aimed to evaluate the effects of p38 MAPK inhibitor on human colon cancer cells. METHODOLOGY: The effect of p38 MAPK inhibitor, FR167653, on DLD-1 and SW480 was investigated related to cell proliferation, apoptosis induction and caspase activity. Additionally, the effect of FR167653 on colon cancer cell migration, MMPs production and ability to adhere to extracellular matrix was investigated. RESULTS: Inhibitor of p38 MAPK dose-dependently suppressed the proliferative activity of both cell lines, and increased the induction of cell apoptosis. The caspase-3, 8, and 9 activities were accompanied in the pathway. Neither cell migration, MMPs production, nor the ability to adhere extracellular matrix were affected by FR167653. CONCLUSIONS: Inhibitor of p38 MAPK suppressed the proliferation of colon cancer cells by induction of cell apoptosis through the caspase activation. The present results suggest the pro-oncogenic role ofp38 in colon cancer, and its inhibition would be a novel strategy for the prevention and treatment of colon cancer.     

白介素-18上调大肠癌细胞Fas配体表达与功能

目的 探讨细胞因子白介素－18（IL－18）对大肠癌细胞Fas配体（FasL)蛋白表达水平的调控，及其对肿瘤细胞反向杀伤T淋巴细胞作用的影响。方法 应用Western蛋白印迹法，检测IL－18作用后的人大肠癌SW620细胞FasL蛋白表达水平的变化；应用流式细胞术分析IL－18处理后肿瘤细胞所诱导的Jurkat淋巴细胞凋亡率的变化。结果 10μg/L和100μg/L两种浓度的IL－18作用9h后，SW620细胞FasL蛋白开始上调，分别于作用18和36h后达到峰值，持续72h后，FasL表达水平恢复到初始状态。随着FasL表达水平的上调，肿瘤细胞所诱导的Jurkat细胞凋亡率上升。结论 细胞因子IL－18具有上调大肠癌细胞FasL蛋白表达水平，增强肿瘤细胞反向杀伤T淋巴细胞的作用。     

人结肠癌细胞中抑制Akt活化下调c-FLIP基因的表达

目的本实验旨在探讨结肠癌细胞中磷酸化蛋白激酶B（pAkt）对细胞FLICE抑制蛋白（c—FLIP）基因表达的调控作用。方法取对数生长期的HT-29细胞系。分别采用10nM、20nM和40nM的Akt抑制剂wortmannin对其进行干预，收集不同干预时间点的细胞，运用MTT法检测细胞的增殖抑制情况。采用40nM的wortmannin干预HT-29细胞0、3、6、12、24h后分别收集等量细胞．提取细胞总蛋白及总RNA，采用Western blot检测pAkt和c—FLIP蛋白表达水平，RT—PCR检测c—FLIP基因的转录水平。结果 三个浓度的wortmannin都对HT-29细胞的生长具有抑制作用，随着浓度、时间的递增，其抑制效应逐渐增强（P〈0．01或0．05），而对照组未见明显变化（P〉0．05）。随着wortmannin的干预时间延长，磷酸化Akt蛋白的表达水平明显降低，同时c—FLIP蛋白的表达水平也随之下降．3h后其表达水平已明显降低。wortmannin干预HT-29细胞3h后，与对照组相比其c—FLIP mRNA表达水平已明显下降到40％，24h后其表达水平下降到25％。结论Akt活化的特异性抑制剂wortmannin可抑制体外培养的结肠癌HT-29细胞的生长，结肠癌中可能存在Akt／c-FLIP信号通路调节c—FLIP基因的表达。     

Zebularine联合丁酸钠对结肠癌细胞系LOVO增殖、凋亡以及P16基因表达的影响

目的探讨Zebularine和丁酸钠对结肠癌LOVO细胞增殖、凋亡及P16基因表达的影响。方法培养人结肠癌细胞系LOVO,分为4组:阴性对照组、Zebularine组、丁酸钠组、Zebularine+丁酸钠组。四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞处理24 h、48 h、72 h后的增殖状况,Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测P16基因的表达。结果 Zebula-rine组和丁酸钠组LOVO细胞的抑制率和凋亡率与对照组相比显著增高,Zebularine+丁酸钠组细胞抑制率和凋亡率均显著高于单独用药组(P<0.05);Zebularine组和丁酸钠组P16 mRNA相对表达量显著高于对照组(P<0.05),Zebularine+丁酸钠组P16 mRNA相对表达量显著高于各单独用药组和对照组(P<0.05)。结论与单独用药相比,Zebularine联合丁酸钠可以明显促进P16 mRNA的表达,抑制结肠癌细胞生长。     

胃泌素对结肠癌细胞株HT-29水通道蛋白4表达的影响

目的: 观察胃泌素对人结肠癌细胞株HT-29水通道蛋白4表达的影响,探讨胃泌素促进结肠癌侵润转移的另一可能机制.方法: 体外培养结肠癌细胞株,采用不同浓度的胃泌素(10-6、10-7、10-8 mol/L)干预HT-29细胞12 h,同时用10 mmol/L的胃泌素受体拮抗剂丙谷胺处理细胞1 h,再给予10-7 mol/L的胃泌素干预相同时间.采用免疫细胞化学和流式细胞技术的方法检测水通道蛋白4表达的变化.结果: 各浓度胃泌素干预后,细胞水通道蛋白4的表达与空白组和丙谷胺处理组相比均明显增加(16.08%±1.93%,17.00%±2.72%,16.48%±2.22% vs 9.28%±2.74%,8.52%±2.72%,均P＜0.01);丙谷胺处理组的表达与空白组无差别,胃泌素各浓度组间亦无差别.结论: 胃泌素能够增加结肠癌细胞水通道蛋白4的表达,丙谷胺能够阻断胃泌素的作用.     

桩蛋白表达下调对结直肠癌细胞SW480侵袭力的影响

目的:探讨下调桩蛋白(paxillin)的表达对结直肠癌细胞SW480体外侵袭的影响.方法:筛选常见结直肠癌细胞株中paxillin 的表达,发现SW480中表达最多.构建干扰paxillin表达的特异性短发夹RNA(shRNA),转染结直肠癌细胞SW480.将SW480细胞分为3组:正常SW480组、阴性对照组及pa...     

ERbeta is a potent inhibitor of cell proliferation in the HCT8 human colon cancer cell line through regulation of cell cycle components

Several strands of evidence indicate that oestrogens exert a protective role against the development of colon cancer through indirect and direct effects on colonic epithelium. Oestrogen receptor beta (ERbeta), the predominant ER subtype in human colon, is significantly decreased in colonic tumours compared with normal mucosa suggesting a potential role in the regulation of colon tumour growth. To investigate this hypothesis we engineered human colon cancer ERalpha-negative HCT8 cells in order to obtain ERbeta protein over-expression. Stably transfected cells were cloned and ERbeta expression and functionality were monitored by RT-PCR, Western blotting and transactivation in an assay using oestrogen-responsive reporter constructs. Over-expression of ERbeta inhibited cell proliferation and increased cell adhesion in a ligand-independent manner. Its constitutive activation is possibly due to cross-talk with intracellular signalling pathways, as epidermal growth factor and IGF-I were able to induce ERbeta transactivation. A possible mechanism by which ERbeta over-expression inhibits proliferation in HCT8 cells is by modulation of some key regulators of the cell cycle; there is a decrease in cyclin E and an increase in the cdk inhibitor p21CIP1. In fact, flow cytometry analysis provided evidence for blocking of the G1-S phase progression induced by ERbeta over-expression. The magnitude of this effect was affected by the level of ERbeta expression. These results provide the first direct evidence that ERbeta plays an important role in colon cancer as a regulator of cell proliferation through the control of key cell cycle modulators and arrest in G1-S phase transition. These findings are compatible with the hypothesis that the loss of ERbeta expression could be one of the events involved in the development or progression of colon cancer.