人内皮抑素基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 :克隆人内皮抑素 (hES)全长cDNA ,并进行其在大肠杆菌表达的研究。方法 :用RT PCR从胎肝RNA中扩增hEScDNA片段 ,构建重组其克隆和融合蛋白表达载体 ,并进行克隆基因的DNA序列分析。结果 :克隆了hEScDNA ,其序列和国外报道一致 ;构建了重组hES融合蛋白表达菌株 ,表达目的蛋白达菌体总蛋白的5 0 %以上。结论 :通过hES基因克隆和表达的研究 ,获得了hES的基因克隆和高效表达菌株     

人膜联蛋白V的原核表达和鉴定

目的：构建人膜联蛋白V的原核表达载体并诱导其表达。方法：利用RT-PCR技术从人胎盘组织总RNA扩增膜联蛋白V基因的编码序列，将扩增产物克隆至GST融合表达载体pGEX-2T,以ITPG诱导GST融合人膜联蛋白V的表达。结果：凝胶电泳显示人胎盘组织RT-PCR扩增产物的分子量大小与目的片段大小相符。对重组质粒分析表明，插入片段的序列与发表的人膜联蛋白V基因编码序列一致。在IPTG的诱导下，BL21重组菌高效表达出一个分子量约为61kDa产物。结论：人膜联蛋白V编码序列已被克隆至GST融合表达载体pGEX-2T。     

具有自激活切割活性肠激酶轻链基因设计、表达及活性研究

目的获得Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列+牛EKL的cDNA序列,实现EKL基因在大肠杆菌中的融合表达和自切割。方法用Trizol法从牛十二指肠组织中提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增其cDNA片段,将此片段克隆于表达载体pGEX-2T,并在其前引入肠激酶(EK)识别序列。结果所表达蛋白经SDS-PAGE分析,相对分子质量约为61 000,经GST-Sepharose亲和色谱柱纯化后得到单一蛋白,SDS-PAGE显示单一条带,用微量EK引发自切割,切断GST标签蛋白和Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列,采用对氨基苯甲脒-Sepharose亲和色谱获得了轻链EK的单体。结论成功地克隆、表达了牛EK轻链基因,采用自激活、切割获得了EK单体,每1 L培养基获得EK5 mg,为进一步进行重组牛EK活性的研究及应用奠定了基础。     

WWOX基因真核细胞表达载体的构建与鉴定

目的 构建人WWOX基因真核细胞表达载体.方法 采用RT-PCR方法 ,从人新鲜卵巢组织的总RNA中扩增出1245 bp的人WWOX cDNA片段, 然后用Hind III和Eco RI双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA 3.1中,用限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒.结果 WWOX基因的序列测定结果 与文献报道完全一致,其真核细胞表达载体被成功构建.结论 成功克隆出WWOX基因,并成功构建其真核细胞表达载体.     

内源性血管生成抑制因子Arresten的序列测定及在E.coli BL21中的表达

目的构建内源性血管生成抑制因子Arresten基因的原核表达载体,并对其进行序列测定和在E.coli BL21中进行表达。方法从健康产妇的胎盘组织中提取总RNA,经反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出Arresten基因,对其序列测定后构建重组质粒pBV220-Arr转化E.coli BL21进行原核表达。结果成功筛选出Arresten基因,并将基因序列和蛋白序列提交基因库,成功构建了重组质粒pBV220-Arr,重组质粒在菌株中获得表达。结论构建的原核表达重组体pBV220-Arr能高效表达重组Arresten蛋白。     

Persephin基因克隆及在大肠杆菌中的表达

目的 :获取Persephin(PSP)基因并实现其高效表达。 方法 :利用PCR方法以染色体DNA为模板 ,扩增编码人PSP成熟蛋白的基因片段 ,将其克隆于 pUC19质粒 ,进行序列分析 ,将基因重组于硫氧还蛋白融合表达载体pThioHisA并进行表达。结果 :序列分析结果与文献报道一致 ,表达的hPSP占菌体总蛋白质 15 %左右。结论 :人PSP基因在大肠杆菌Top10中获得了高效、稳定表达 ,为进一步的基础研究与临床应用奠定了基础。     

人胎盘TRAIL基因的克隆和在大肠杆菌中的表达

从人胎盘中提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增了可溶性TRAIL(凋亡素配体2)基因片段.序列分析表明该基因序列与国外发表的可溶性TRAIL基因片段的序列完全相同.将该基因片段插入到含T7启动子的质粒pET-28c(+)上,构建表达质粒pET-28c(+)TRAIL,转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选获得表达菌株BL-pET-28c(+)TRAIL.表达菌经1 mmol/L的IPTG诱导表达4h后,产生大量的重组人TRAIL蛋白,SDS-PAGE扫描计算机灰度分析表明,表达的重组蛋白占菌株可溶性蛋白的40%以上.     

人肠三叶因子毕赤酵母表达载体的构建与鉴定

目的构建人肠三叶因子(hITF)的毕赤酵母表达载体。方法从人结肠黏膜提取总RNA,经RT-PCR得到hITF cDNA,用PCR方法扩增hITF基因,并将其克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9中,构建含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的重组表达质粒pPIC9/hITF。结果通过酶切和基因序列分析确定插入pPIC9中的片段为hITF基因片段。结论重组质粒pPIC9/hITF的成功构建,为在真核细胞中高效表达hITF。并制备其抗体的进一步研究提供基础。     

人神经营养素-3基因克隆及原核表达

目的通过基因工程的方法克隆人神经营养素-3成熟蛋白(hNT-3)的基因,并在大肠杆菌中进行表达,为研究hNT-3的生物学作用提供材料。方法以人胎脑cDNA为模板,采用PCR方法扩增hNT-3基因,并将其克隆在pGEM-T载体上,将经过序列分析确定的hNT-3基因插入原核表达载体pGEX-6p-1中,构建了重组表达载体pGEX-6p-1-NT-3,用SDS-PAGE法测定其在大肠杆菌中的表达。结果经序列测定分析,所克隆DNA片断与文献发表序列(GenBank,MW002527)同源性为99.7%,并获得了高效表达hNT-3蛋白的重组菌株。结论体外成功扩增hNT-3基因,并在原核细胞中高效表达。     

TOPO克隆构建SARS-CoV M蛋白基因裂殖酵母表达载体及其稳定性

目的 利用TOPO克隆法构建SARS-CoV M蛋白基因的裂殖酵母重组表达载体，并验证重组载体在宿主细胞中的稳定性。方法 运用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术从SARS-CoV RNA中扩增出M蛋白基因,AT克隆构建出序列正确的pMD18-T-M重组载体。设计含Kozak序列的引物从pMD18-T-M载体上亚克隆出M蛋白基因，与裂殖酵母表达载体pNMT1-TOPO进行TOPO克隆,构建出重组表达载体pNMT1-M,转化TOP10感受态细胞，菌落PCR鉴定阳性转化子后进行测序鉴定。将序列正确的pNMT1-M重组载体电转化入裂殖酵母TCP1菌株中,在EMM培养基中诱导表达,连续传代100代，在EMM+T培养基中验证其稳定性。结果 RT-PCR获得666 bp的片段,pMD18-T-M重组载体经测序验证序列正确；重组表达载体pNMT1-M经菌落PCR和测序鉴定均正确;重组裂殖酵母菌经诱导后，SDS-PAGE检测出了表达条带;重组表达载体连续传代后,未发现丢失现象。结论 成功地构建出了SARS-CoV M蛋白基因的裂殖酵母表达载体，验证了其在裂殖酵母中能稳定地进行遗传,为下一步的表达优化、活性和功能研究垫定了基础.     

重组人内皮抑素在大肠杆菌中表达及其生物学活性鉴定

目的 利用大肠杆菌原核表达系统表达重组人内皮抑素Endostatin，并对其进行生物学活性鉴定。方法 采用RT—PCR方法从人胚肝中钓取人内皮抑素cDNA，将其克隆入pGEM—T Easy克隆载体中；经全自动序列分析仪测序确证后，将人内皮抑素cDNA亚克隆入原核表达载体pWR450—1，构建含人内皮抑素cDNA的重组质粒；将该重组质粒转化入大肠杆菌TG1中进行诱导表达，表达产物经SDS-PAGE鉴定；表达产物初步纯化复性后以鸡胚尿囊膜血管生成抑制实验和小鼠伤口愈合实验对其进行生物学活性鉴定。结果 成功获得549bp 人 endostastin基因，测序证实序列正确。经IPTG诱导的重组原核表达质粒表达出重组人内皮抑素的融合蛋白，此蛋白在SDS-PAGE凝胶上显示出一条约75KD的阳性条带。重组人内皮抑素融合蛋白的初纯物在体外能抑制鸡胚尿囊膜血管生成及延长小鼠伤口愈合时间。结论 人内皮抑素融合蛋白在大肠杆菌原核表达系统中高水平表达，并具有抗血管生成活性，为采用抗血管生成方法治疗恶性实体肿瘤的研究奠定了基础。     

重组大鼠pEGFP-N1-IGF-1基因表达质粒的构建

目的构建胰岛素样生长因子1基因的真核表达质粒(pEGFP-N1IGF-1),为基因治疗脊髓损伤(SCI)提供前提。方法应用反转录聚合酶链反应(RTPCR)方法从大鼠肝脏组织总RNA中提取并扩增胰岛素样生长因子1(IGF1)基因的全长cDNA,并将该基因连接克隆到含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的真核表达载体pEGFPN1上,以构建重组质粒pEGFPN1IGF1。结果实验从大鼠肝脏组织中提取总RNA,以RTPCR方法获取编码IGF1基因的全序列cDNA。构建IGF1cDNA真核表达质粒时将能发出绿色荧光的EGFP报告基因融合在IGF1基因,并经酶切后DNA电泳鉴定及DNA测序证实结果。结论构建重组质粒pEGFPN1IGF1成功,实验中将能发出绿色荧光的EGFP报告基因融合在IGF1基因的3′端,并以编码柔软肽段的核苷酸连接,既保留了IGF1的神经营养活性,又便于基因治疗中可检测到蛋白表达。     

肿瘤抗原基因MAGE-A9的克隆及原核表达

目的扩增和克隆人黑色素瘤抗原MAGE-A9cDNA,构建原核表达载体,表达并纯化MAGE-A9蛋白。方法从人肝癌组织提取总RNA,用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从中扩增出MAGE-A9 cDNA,插入载体pMD18-T中,测序正确后,构建重组表达载体pBAD/gⅢ-MAGE-A9,转化大肠杆菌TOP10株。以L-Arabi-nose进行诱导表达,并纯化。结果获得MAGE-A9cDNA,测序结果与GenBank一致。成功构建表达载体,表达可溶重组蛋白,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析其相对分子质量为35 000。结论成功地构建了pBAD/gⅢ-MAGE-A9原核表达质粒,获得了MAGE-A9蛋白,为该蛋白应用于肿瘤免疫治疗奠定了基础。     

MAGE-A9基因原核表达系统的构建及其在肝细胞癌中的表达

目的扩增和克隆人黑色素瘤抗原MAGE-A9(melanom a antigen A9)cDNA,构建原核表达载体,制备抗MAGE-A9单抗,观察其在肝细胞癌中的定位。方法从人肝癌组织提取总RNA,用RT-PCR从中扩增出MAGE-A9cDNA,插入载体pMD18-T中,测序正确后,构建重组表达载体pBAD/gI-II-MAGE-A9,转化大肠杆菌TOP10株进行表达。重组蛋白经L-Arabinose诱导表达纯化后,制备抗MAGE-A9单抗,免疫组化检测MAGE-A9在肝细胞癌中的表达和定位。结果获得AGE-A9cDNA,测序结果与GenBank一致。成功构建表达载体,表达可溶重组蛋白,SDS-PAGE分析其相对分子质量为35Kd。获得抗MAGE-A9单抗,MAGE-A9在肝细胞癌中的阳性表达率为21%(8/39),主要表达于胞浆,未见肿瘤异质性,统计学分析MAGE-A9的表达与患者年龄、性别、肿瘤大小和分化程度没有相关性。结论有相当部分肝癌患者的肿瘤表达MAGE-A9抗原,且其表达与患者年龄、性别、肿瘤大小和分化程度没有相关性,MAGE-A9可能成为肝癌特异性免疫治疗的靶点。     

心肌肌钙蛋白Ⅰ的融合表达和分离纯化

目的研究人心肌肌钙蛋白(cTnⅠ)在大肠杆菌中稳定高效的融合表达和分离纯化,以满足临床诊断的需要。方法人cTnⅠDNA序列由pdf 5-cTnⅠ质粒经PCR亚克隆而得,然后将其插入pET32a(+)载体,构建成pET32a(+)-cTnⅠ表达质粒,以大肠杆菌BL21(DE3)为表达菌,在IPTG诱导下进行表达。结果硫氧还蛋白(TrxA)-cTnⅠ融合蛋白得到高效表达,并经金属螯合亲和色谱一步纯化得到目的蛋白质。试剂盒检测结果表明该重组蛋白质具有cTnⅠ免疫原活性。结论构建了pET32a(+)-cTnⅠ重组质粒,并在大肠杆菌中获得高效表达,为建立急性心肌梗死早期诊断试剂奠定了基础。     

人铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆表达及活性鉴定

目的获得高表达人铜锌超氧化物歧化酶（hCu／Zn—SOD）的工程菌方法采用RT—PCR技术从人胃组织总RNA中分离扩增了hCu／Zn—SOD的eDNA序列,将该基因重组到T7启动予控制下的分泌型表达载体pET22b（＋）中,构建了表达质粒pETSOD,并转化大肠杆菌B121（DE3）进行诱导表达采用SDS—PAGE、蛋白质免疫印迹分析其活性。结果该工程菌可高表达一相对分子质量大约16kD的蛋白,与抗人Cu／Zn-SOD多克隆抗体有特异的免疫反应,表达量可达菌体可溶性蛋白的20％以上,且具有特异性SOD酶活性。结论该菌株分泌表达了有天然酶活性的hCu／Zn—SOD,为大量制备HCuZn-SOD）和下一步研究工作奠定了基础．     

人PPARγ_1LBD融合蛋白表达质粒的构建和诱导条件优化

目的制备高纯度的人PPARγ1LBD融合蛋白,为筛选其配体奠定基础。方法以人脂肪组织总RNA为模板,利用RT-PCR方法扩增出人PPARγ1LBD基因的cDNA片段,将其插入表达载体pMAL-p2X的麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein,MBP)编码基因malE的下游,转化宿主菌E.coli.TB1。并对重组质粒在大肠杆菌TB1中的表达条件进行了优化。结果经BamHⅠ和HindⅢ双酶切,获得分子量为909bpDNA条带;当诱导剂IPTG浓度为0.4mmol.L-1,30℃振荡诱导培养6h时,重组菌TB1高效表达MBP-PPARγ1LBD融合蛋白,表达量可达胞质总蛋白的38.54%。结论成功构建了能在TB1中高效表达人PPARγ1LBD融合蛋白的重组质粒,获得了具有高生物活性的融合蛋白。     

脂多糖应激新分子融合蛋白的高表达及纯化

目的在原核表达系统中表达脂多糖应激新分子编码的蛋白质。方法PCR扩增HlrgcDNA编码区,克隆入表达载体pcTAT中,构建成融合6His的表达载体pcTAT-lrg,转化E.coli BL21(DE3),以IPTG诱导。表达产物用SDS-PAGE及凝胶光密度扫描分析,用Ni-NTA亲和层析柱纯化。结果经过IPTG诱导4 h,表达出相对分子质量(Mr)约25 000的蛋白,占菌体总蛋白的51%。表达产物为可溶性的,用Ni-NTA亲和层析柱纯化的表达蛋白达到电泳纯。加入培养液中的纯化蛋白,可在30 min内进入HEK293细胞。结论在E.coli中成功地高表达人Lrg融合蛋白,并对其进行初步纯化,为人Lrg功能的研究打下基础。