高糖后低糖过程通过ERK1/2信号途径增强H9c2心肌细胞自噬的功能

目的 研究高糖后低糖H9c2心肌细胞自噬活性的影响及ERK1/2在此过程中对自噬的调节作用。方法 用25mmol/L葡萄糖浓度的培养基培养H9c2细胞后用2.5mmol/L葡萄糖浓度培养基处理细胞2h作为低糖组（LG组）,高糖组（HG组）维持25mmol/L的葡萄糖浓度,空白对照组（Con组）维持5.5mmol/L的葡萄糖浓度;低糖组加入ERK抑制剂U0126作为抑制剂组。采用MTT法检测H9c2细胞增殖能力;LDH检测试剂盒检测细胞毒性;Western blot法检测 ERK、p-ERK、LC3、Beclin-1的表达量。结果 与Con组和HG组相比,LG组细胞增殖能力降低,LDH活性增加;与Con组相比,HG组LC3-Ⅱ、Beclin-1表达量升高,p-ERK表达无显著改变;与Con组和HG组相比,LG组p-ERK、LC3-Ⅱ和Beclin-1表达显著增加;而与LG组比较,抑制剂组p-ERK明显降低,同时LC3-Ⅱ、Beclin-1表达以及细胞毒性降低,细胞活力增加。结论 ERK1/2信号途径促进了高糖后低糖过程中H9c2心肌细胞的自噬活性。     

鹦鹉热衣原体Ⅲ型分泌蛋白SINC通过激活MAPK/ERK信号通路促进宿主细胞自噬

目的 探讨鹦鹉热衣原体（Cps）SINC蛋白对宿主细胞自噬的影响,及MAPK/ERK信号通路在其中的调控作用。方法 用重组的SINC蛋白刺激小鼠单核巨噬细胞（RAW 264.7）,Western blot检测LC3-Ⅱ和Beclin-1的水平及ERK1/2的磷酸化程度,并用间接免疫荧光法检测SINC蛋白刺激后细胞LC3的水平,透射电镜检测自噬特殊结构。用50μmol MEK1/2抑制剂U0126预处理RAW 264.7细胞后1 h,再用不同浓度SINC蛋白刺激不同时间,用间接免疫荧光检测LC3的水平,并用Western blot检测LC3-Ⅱ和Beclin-1的表达水平。结果 Western blot检测结果显示,以2μg/mL SINC蛋白刺激RAW 264.7细胞12 h时,LC3-Ⅱ和Beclin-1的表达水平显著上调,并达到峰值;间接免疫荧光检测发现SINC刺激后可使细胞内LC3荧光斑点数明显增多,透射电镜下可见更多的自噬小体和自噬溶酶体。2μg/mL SINC蛋白刺激RAW 264.7细胞15 min时p-ERK1/2/ERK1/2比值明显上调;加入抑制剂U0126后,LC3...     

复智胶囊对血管性痴呆模型大鼠海马神经元细胞凋亡时效的影响

目的:观察复智胶囊对血管性痴呆大鼠海马区自噬正相关蛋白Beclin-1表达的影响及在海马神经元细胞凋亡中的作用。方法:雄性SD大鼠采用双侧颈总动脉分次结扎法,建立血管性痴呆大鼠模型。选取造模成功的大鼠,随机分为模型组、复智胶囊高剂量组、复智胶囊低剂量组及多奈哌齐组,并设假手术组。分别在第3天、第7天、第14天采用Western Blot法检测大鼠海马区脑组织中Beclin-1、Bcl-2和Caspase-3的表达,采用TUNEL法检测海马神经元细胞凋亡数。结果:术后3 d即对海马神经元细胞造成损害,与假手术组比较,造模后各组各时点的Beclin-1、Bcl-2和Caspase-3蛋白表达水平明显增高(P<0.05),海马神经元细胞大量凋亡(P<0.05)。与模型组比较,相同时点复智胶囊高剂量组、低剂量组Beclin-1和Bcl-2蛋白表达水平明显增高(P<0.05),Caspase-3蛋白表达水平明显下降(P<0.05),海马神经元细胞凋亡数目明显减少(P<0.05)。结论:复智胶囊对血管性痴呆模型大鼠海马神经元有一定保护作用,可能是通过上调Beclin-1蛋白表达水平、激活细胞自噬及抑制细胞凋亡来实现的。     

BQ-123 对蛛网膜下腔出血大鼠神经功能的保护作用研究

目的 探讨BQ-123 对蛛网膜下腔出血（SAH）的治疗作用及其机制。方法 160 只雄性SD 大鼠,随机分为假手术（Sham）组、SAH 组、雷帕霉素组、低剂量BQ-123 组、高剂量BQ-123 组。2 次 注血法复制SAH 大鼠模型;光镜观察海马区形态结构变化;免疫组织化学法检测海马区雷帕霉素靶蛋白 （mTOR）、自噬相关基因Beclin-1 和微管相关蛋白1 轻链（LC3）- Ⅱ的表达;实时逆转录聚合酶链反应 （real-time RT-PCR）检测mTOR、Beclin-1 和LC3 的mRNA 表达;抓力测定实验评价各时间点大鼠前肢 拉力情况;穿梭箱实验测试动物的学习功能。结果 与Sham 组比较,SAH 组海马区mTOR、Beclin-1 和 LC3 mRNA 表达增加,存活神经元细胞数量减少,大鼠的学习功能和拉力值下降,差异有统计学意义（P < 0.05）;与SAH 组比较,雷帕霉素组海马区mTOR mRNA 表达降低、Beclin-1 和LC3 mRNA 表达增高,存活神经元细 胞数量增多,大鼠的学习功能和拉力值改善,差异有统计学意义（P <0.05）;与SAH 组比较,BQ-123 组海马区 mTOR mRNA 降低、Beclin-1 和LC3 mRNA 表达增高,存活神经元细胞数量增多,动物学习功能指标和拉力值 改善,差异有统计学意义（P <0.05）,且上述变化在高剂量BQ-123 更为明显。结论 BQ-123 可改善SAH 大鼠 神经功能缺陷,抑制mTOR 激活,从而提高海马区神经细胞自噬程度。     

脓毒症相关性脑病大鼠海马区神经细胞自噬

目的：探讨脓毒症相关性脑病(sepsis-associated encephalopathy，SAE)大鼠海马区神经细胞自噬现象及微管相关蛋白1轻链3(LC3)的表达。方法：盲肠结扎穿孔术(cecal ligation and puncture，CLP)建立脓毒症大鼠模型。60只30日龄健康雄性Wistar大鼠被随机分为假手术组(10只)和CLP组(50只)。CLP后12 h监测大鼠脑电图(electroencephalogram，EEG)及体感诱发电位(somatosensory evoked potential，SEP)，并进行神经生物学评分。根据大鼠是否发生SAE将CLP组大鼠再分为SAE(+)组和SAE(–)组。HE染色观察大鼠海马区病理学改变；电子显微镜观察大鼠海马区神经细胞自噬的超微结构；Western印迹检测LC3-I和LC3-II蛋白的表达。结果：50只大鼠在CLP后12 h内死亡5只，存活45只大鼠中有16只出现神经行为学、EEG及SEP改变，诊断为SAE，其发病率为35.56%(16/45)。与假手术组和SAE(–)组比较，SAE(+)组大鼠在CLP后12 h时α波的频率明显减少，δ波增加，P1振幅下降，P1波和N1波潜伏期延长(P<0.05)。CLP后12 h时SAE(+)组大鼠海马区细胞明显水肿，锥体细胞明显减少，甚至溶解，细胞排列紊乱，而假手术组和SAE(–)组大鼠海马区细胞形态正常、层次清楚。透射电子显微镜观察表明：SAE(+)组大鼠海马区细胞结构紊乱，可见自噬泡、颗粒状基质和方形或长方形晶体，自噬泡内含有溶酶体等细胞器，假手术组和SAE(–)组大鼠海马区组织细胞无自噬泡形成。SAE(+)组大鼠在CLP后12 h，海马区神经细胞LC3-II/LC3-I值明显高于假手术组和SAE(–)组(P<0.05)。结论：SAE大鼠海马区神经细胞存在细胞自噬现象，LC3-II/LC3-I值明显升高。     

复智胶囊对血管性痴呆模型大鼠海马神经元细胞凋亡时效的影响

目的:观察复智胶囊对血管性痴呆大鼠海马区自噬正相关蛋白Beclin-1表达的影响及在海马神经元细胞凋亡中的作用。方法:雄性SD大鼠采用双侧颈总动脉分次结扎法,建立血管性痴呆大鼠模型。选取造模成功的大鼠,随机分为模型组、复智胶囊高剂量组、复智胶囊低剂量组及多奈哌齐组,并设假手术组。分别在第3天、第7天、第14天采用Western Blot法检测大鼠海马区脑组织中Beclin-1、Bcl-2和Caspase-3的表达,采用TUNEL法检测海马神经元细胞凋亡数。结果:术后3 d即对海马神经元细胞造成损害,与假手术组比较,造模后各组各时点的Beclin-1、Bcl-2和Caspase-3蛋白表达水平明显增高(P0.05),海马神经元细胞大量凋亡(P0.05)。与模型组比较,相同时点复智胶囊高剂量组、低剂量组Beclin-1和Bcl-2蛋白表达水平明显增高(P0.05),Caspase-3蛋白表达水平明显下降(P0.05),海马神经元细胞凋亡数目明显减少(P0.05)。结论:复智胶囊对血管性痴呆模型大鼠海马神经元有一定保护作用,可能是通过上调Beclin-1蛋白表达水平、激活细胞自噬及抑制细胞凋亡来实现的。     

商陆皂苷甲对IL-1β诱导的肾小球系膜细胞ERK1/2-AP-1通路活化的影响

目的 观察商陆皂苷甲(EsA)含药血清对大鼠肾小球系膜细胞(rGMC)增殖及其对IL-1β诱导rGMC的ERK1/2-AP-1通路活化的影响.方法 用不同剂量EsA(5、10、20、40 mg/kg)将SD大鼠灌胃后获取含药血清,并设对照组(0.5％羧甲基纤维素钠灌胃);用上述各组浓度的EsA含药血清处理rGMC,并设对照组血清组.四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测各组EsA含药血清对rGMC增殖的影响;将rGMC分为空白对照组、IL-1β单独作用组、IL-1ββ+ EsA双重作用组、IL-1β+U016双重作用组、IL-1β+U0126+EsA共同作用组,同步化后培养48 h,Western Blot法检测p-ERK1/2、AP-1的表达并成像分析.结果 EsA(5～10 mg/kg)含药血清抑制了细胞增殖(P＜0.05或P＜0.01);ILqβ组促进了rGMC的p-ERK1/2、AP-1表达(P＜0.05),IL-1β+EsA组、IL-1β+ U0126组,IL-1β+U0126+EsA组作用rGMC后,其p-ERK1/2、AP-1表达均降低(P＜0.05).结论 EsA含药血清(5～10 mg/kg)显著抑制了rGMC的增殖;EsA通过下调p-ERK1/2、AP-1表达,抑制了IL-1β诱导的rGMC增殖,EsA作用于ERK1/2-AP-1通路是其抑制rGMC增殖的机制之一.     

七氟烷诱导大鼠海马HO-1基因表达机制的研究

目的:研究七氟烷诱导神经元血红素氧合酶-1(HO-1)基因表达的信号转导通路,探讨七氟烷脑保护机制.方法:40只Wis'ar大鼠[年龄(3～4)个月,体重120g～220g]随机分为对照组(C组)、脑缺血-再灌注组(D组)、0.3MAC七氟烷+脑缺血-再灌注组(S1组)、0.6MAC七氟烷+脑缺血-再灌注组(S2纽)和0.6MAC七氟烷+U-0126+脑缺血一再灌注组(U组).测定大鼠海马组织中HO-1-mRNA和ERK1/2、Nri2、AP-1、HO-1蛋白的表达水平,电镜下观察海马线粒体的变化.结果:D组大鼠海马组织中HO-1基因表达增加,ERK1/2、Nrl2和AP-1蛋白表达增加(P均<0.05),海马神经细胞线粒体变性率升高(P<0.01).S1组和s2组HO-1基殿表达增加,ERK1/2和Nrf2蛋白表达增加,线粒体变性率降低(P<0.01),AP-1蛋白表达变化不明旺(P>0.05).u组HO-1基因表达降低,ERK1/2和Nrf2蛋白表达降低,线粒体变性率升高(P<0.01),AP-1蛋白表达表达变化不明显(P>0.05).结论:七氟烷通过ERK1/2/Nrf2信号通路诱导大鼠海马神经细胞HO-1基因表达,保护了海马神经细胞.     

BQ-123对蛛网膜下腔出血大鼠神经功能缺陷的改善作用及其机制

目的：探讨内皮素受体拮抗剂（BQ-123）对蛛网膜下腔出血（SAH）神经功能损伤的影响,阐明其作用机制。方法：120只雄性SD大鼠分为假手术组、SAH模型组、低剂量（50 μg·kg^-1）BQ-123组和高剂量（75 μg·kg^-1）BQ-123组。采用二次注血法制作SAH大鼠模型;HE染色观察各组大鼠海马区神经细胞的形态变化;免疫组织化学法和RT-PCR法检测海马区磷酸化雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、自噬相关基因beclin-1和微管相关蛋白1轻链（LC3）-Ⅱ的表达;穿梭箱实验检测各组大鼠学习记忆功能,抓力测定实验评价各时间点各组大鼠前肢拉力情况。结果：与假手术组比较,SAH组大鼠海马区神经细胞结构损伤,神经细胞存活率降低（P<0.05）,磷酸化mTOR、beclin-1和LC3-Ⅱ mRNA表达水平升高（P<0.05）,大鼠学习记忆功能和拉力值降低（P<0.05）;与SAH组比较,BQ-123组大鼠海马区神经细胞结构损伤减轻,神经细胞存活率升高（P<0.05）,磷酸化mTOR mRNA表达水平降低（P<0.05）,beclin-1和LC3-Ⅱ mRNA表达水平升高（P<0.05）,动物学习记忆功能和拉力值增加（P<0.05）;与低剂量BQ-123组比较,高剂量BQ-123组上述变化更为明显（P<0.05）。结论：BQ-123可显著改善SAH大鼠神经功能缺陷,其机制与调控mTOR-自噬通路信号途径有关。     

酸敏感离子通道1a在酸诱导的大鼠膝关节滑膜成纤维细胞自噬中的作用及其机制研究

目的:探讨酸敏感离子通道1a(ASIC1a)在酸诱导的大鼠膝关节滑膜成纤维细胞(SFs)自噬中的作用和机制。方法:分离大鼠膝关节SFs,在不同胞外酸化条件处理后检测软骨自噬蛋白(LC3-Ⅱ)的表达。观察ASIC1a阻断剂对自噬小体数量、自噬基因(Beclin-1)mRNA的表达,自噬相关蛋白(RRK1/2、p38MAPK)磷酸化的影响;观察RRK1/2、p38MAPK磷酸化抑制剂对Beclin-1 mRNA、LC3-Ⅱ蛋白表达的影响。结果:HE染色结果证实符合SFs的特征;pH 7.4组LC3-Ⅱ蛋白表达pH 7.0组pH 6.5组pH 6.0组/pH 5.5组,pH 6.0组与p H 5.5组组间比较差异无统计学意义(P0.05),其余每两组间比较,差异均有统计学意义(P0.05);pH 7.4组细胞器完整且形态规则,pH 6.0组可见线粒体肿胀,且双层膜包裹的细胞自噬小体较多,pH 6.0+Amiloride组细胞质自噬小体数量稍少,细胞器形态有所恢复,pH6.0+PcTX1组细胞质自噬小体数量更高,细胞器接近正常;pH 7.4组Beclin-1 mRNA表达pH 6.0+PcTX1组pH 6.0+Amiloride组pH 6.0组,每两组间比较差异均有统计学意义(P0.05);pH 7.4组ERK1/2、p38MAPK磷酸化水平pH 6.0+PcTX1组pH 6.0+Amiloride组pH 6.0组,每两组间对比差异均有统计学意义(P0.05);pH 7.4组Beclin-1 mRNA和LC3-Ⅱ蛋白表达pH 6.0+PD98059组pH 6.0+PcTX1组pH6.0+SB203580组/pH 6.0组,pH 6.0+SB203580组的Beclin-1 mRNA和LC3-Ⅱ蛋白与pH 6.0组比较,差异均无统计学意义(P0.05),其余每两组间对比,差异均有统计学意义(P0.05)。结论:胞外酸化条件可诱导大鼠膝关节SFs自噬,阻断ASIC1a能明显弱化此作用,且特异性阻断剂的效果更佳,其机制可能与调控Beclin-1基因表达,抑制ERK1/2磷酸化有关。     

异氟醚对Aβ25-35诱导大鼠PC12细胞自噬和凋亡的影响

目的：探讨吸入麻醉药异氟醚对β淀粉样蛋白（Aβ）25-35诱导的大鼠PC12细胞自噬和凋亡的影响,阐明其可能的作用机制。方法：将PC12细胞随机分为正常对照组（C组）、10   μmol•L-1Aβ25-35 处理组（Aβ组）、2%异氟醚处理组（Iso组）和2%异氟醚与10   μmol•L-1Aβ25-35联合处理组（Iso+Aβ组）。各组PC12细胞药物处理6 h后应用透射电镜观察自噬体,Western blotting法检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、p62和自噬信号调控基因p-mTOR、Beclin-1表达;药物处理24 h后应用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测细胞存活率,Western blotting法检测凋亡相关蛋白Bcl-2和caspase-3表达。结果：与C组比较,Aβ组PC12细胞中可见大量的自噬体,LC3-Ⅱ、Beclin-1和caspase-3表达量升高（P<0.05）,p62、p-mTOR和Bcl-2表达量降低（P<0.05）,细胞存活率降低（P<0.05）;Iso组PCI2细胞未见自噬体,LC3-Ⅱ
表达量降低（P<0.05）,p62、p-mTOR和caspase-3表达量升高（P<0.05）,细胞存活率降低（P<0.05）;与Aβ组比较,Iso+Aβ组PC12细胞仅见少量自噬体,LC3-Ⅱ表达量降低（P<0.05）,p62、p-mTOR、Beclin-1和caspase-3表达量升高（P<0.05）,细胞存活率降低（P<0.05）,Bcl-2表达无明显变化（P>0.05）。结论：异氟醚能够抑制Aβ25-35诱导大鼠PC12细胞自噬的活化,促进凋亡蛋白的表达,其作用机制与激活自噬信号调控基因mTOR、抑制Beclin-1的表达有关。     

CD147通过Beclin-1抑制前列腺癌PC-3细胞自噬

目的: 通过建立饥饿诱导的自噬模型,探讨CD147对前列腺癌PC-3细胞自噬作用的影响,并阐明其作用机制。 方法: 通过饥饿诱导方式建立自噬细胞模型。实验分为阴性对照组和RNAi干扰CD147组(PC-3/shCD147组)。GFP-LC3质粒转染观察细胞自噬斑点形成情况,免疫印迹技术检测自噬蛋白LC3和Beclin-1表达,台盼蓝排斥实验检测细胞死亡率。 结果: 与阴性对照组比较,PC-3/shCD147组GFP-LC3斑点细胞数增加(P<0.01),自噬相关蛋白LC3-Ⅱ(P<0.01)和Beclin-1(P<0.05)表达水平升高;与阴性对照组(22.3%±3.5%)比较,PC-3/shCD147组细胞死亡率(38.4%±3.1%)明显升高(P<0.05)。 结论: 在前列腺癌PC-3细胞中,CD147通过Beclin-1抑制饥饿诱导的自噬过程,减少细胞自噬的发生。     

抑制ERK1/2通路激活改善大鼠心房纤维化和缝隙连接蛋白40重构

目的 探讨ERK1/2通路抑制剂U0126对盐酸异丙基肾上腺素(ISO)诱导的大鼠心房纤维化和缝隙连接蛋白40(Cx40)重构的影响。 方法 将32只雄性SD大鼠随机等分为空白对照组、DMSO组、ISO [5 mg/(kg·d) ]+DMSO组(模型组)和ISO [5 mg/(kg·d) ]+U0126 [0.5 mg/(kg·d) ]+DMSO组(干预组)。每组1次/d给予相关试剂,连续7 d后处死大鼠并取心肌组织。用放射免疫法测血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)含量;H-E和Masson染色法观察心肌纤维化程度;免疫组化法测定磷酸化丝裂原活化蛋白激酶激酶1/2(p-MEK1/2)、磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(p-ERK1/2)以及Cx40的表达。 结果 (1)空白对照组 [(242.133±4.870) ng/L ]与DMSO组 [(239.412±1.795) ng/L ]的AngⅡ含量差异无统计学意义,而模型组 [(500.250±8.869) ng/L ]和干预组 [(498.695±9.340) ng/L ]的AngⅡ含量较空白对照组与DMSO组均升高,差异有统计学意义(P均<0.01)。(2)空白对照组与DMSO组无心房纤维化,而干预组心房纤维化程度较模型组减弱(P<0.01)。(3)空白对照组与DMSO组中p-MEK1/2和p-ERK1/2的含量差异无统计学意义,模型组中两者含量较空白对照组与DMSO组均增加(P均<0.01),干预组中两者含量与空白对照组和DMSO组比较差异均无统计学意义,而与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)。(4)空白对照组与DMSO组中Cx40含量差异无统计学意义且呈线性分布于心肌细胞闰盘处,模型组中Cx40含量较空白对照组和DMSO组均减少(P均<0.01)且分布无规律性,而干预组中Cx40含量与空白对照组和DMSO组比较差异均无统计学意义且部分呈线性分布于心肌细胞闰盘处;干预组中Cx40含量减少程度较模型组减弱(P<0.01),且部分呈线性分布于心肌细胞闰盘处。 结论 心肌组织中AngⅡ含量长期升高可能参与了心房纤维化的形成和Cx40重构,U0126通过抑制ERK1/2通路激活可有效改善心房纤维化程度和Cx40重构。     

丙戊酸诱导前列腺癌自噬并促进SPARCL1蛋白的表达

目的 通过对丙戊酸（VPA）诱导前列腺癌发生自噬现象的观测及对SPARCL1蛋白表达的调节作用,探讨VPA对前列腺癌细胞抑制作用的可能机制。方法 选取3种常见前列腺癌细胞系PC3、DU145和LNCaP,经过不同浓度VPA处理,计算VPA对细胞的抑制率,采用透射电镜观察自噬的特异性超微结构,Western Blotting技术检测自噬特异性蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1以及SPARCL1蛋白的表达。结果 3组前列腺癌细胞系经过药物处理后,均产生抑制作用（P<0.05）,且呈药物浓度相关性。自噬蛋白的表达随药物浓度的提高而增加（P<0.05）。VPA还能诱导肿瘤细胞分泌SPARCL1蛋白。结论 VPA可使前列腺癌细胞发生自噬并调节SPARCL1表达,这可能是其发挥抗肿瘤作用的重要原因。     

Wnt3a在大鼠蛛网膜下腔出血后早期脑损伤中对神经细胞自噬和凋亡的影响

目的 探讨Wnt3a在大鼠蛛网膜下腔出血(SAH)后早期脑损伤中对神经细胞自噬和凋亡的作用及影响。 方法 将75只健康雄性SD大鼠按随机数字表法分为假手术组(Sham组)、蛛网膜下腔出血组(SAH组)及干预组(Wnt3a组),每组25只;采用枕大池自体注血方法建立SAH模型,各组于出血后0、12、24、48、72 h取脑。Western bloting检测LC3Ⅱ与LC3Ⅰ的比值、Beclin-1、Caspase-3的表达情况,免疫组化染色技术观察各组大鼠海马的自噬和凋亡情况。 结果 Western bloting结果显示,SAH组LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1出血后呈升高趋势,于24 h达高峰,24 h时间点Wnt3a组LC3Ⅱ、Beclin-1的表达较SAH组明显(P<0.05)。SAH组出血后Caspase-3升高,48h达高峰,Wnt3a组Caspase-3表达较SAH组减少(P<0.05)。免疫组化结果显示,与SAH组相比,Wnt3a组24 h时间点Beclin-1阳性神经元增多,48 h时Bax阳性神经元与凋亡细胞均减少(P<0.05)。 结论 Wnt3a可以促进大鼠蛛网膜下腔出血后神经元自噬,减少神经元细胞凋亡,对神经元具有保护作用。     

鞘内注射吗啡诱导脊髓背角自噬状态的改变

目的研究鞘内注射吗啡诱导吗啡耐受过程中大鼠脊髓背角自噬状态的变化。方法选择鞘内置管成功的成年雄性SD大鼠48只,随机分为M组和C组,每组24只。M组2次/d,连续7 d鞘内注射吗啡20μg;C组2次/d,连续7 d鞘内注射生理盐水。于鞘内注射前及第1、3、5、7天第2次鞘内注药后30 min采用电子VonFrey测痛仪测定机械缩足反射阈值,然后随机取6只大鼠L4～6脊髓背角采用Western blot测定自噬标记蛋白LC3Ⅱ、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及自噬调节信号相关蛋白Beclin-1的表达。结果鞘内注射吗啡7 d后,吗啡镇痛作用较第1天下降60.2%,提示出现吗啡耐受形成。C组各时点LC3Ⅱ及Beclin-1均有少量表达,各时点比较差异无统计学意义;与C组比较,M组各时间点脊髓背角Beclin-1、LC3Ⅱ表达量及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均显著上调(P<0.05);M组内不同时点比较,第1天LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值最高(P<0.05),随后逐渐下降;第1天Beclin-1表达最高(P<0.05),随后下降,在第5天后表达量趋于稳定。结论鞘内注射吗啡可诱导脊髓背角自噬增加,Beclin-1可能参与鞘内注射吗啡诱导所致的自噬状态改变。     

自噬在大蒜素减轻脓毒症小鼠急性肺损伤中的作用

目的：探讨自噬在大蒜素减轻脓毒症小鼠急性肺损伤中的作用及机制。方法：将152只20~25 g的8周龄雄 性Balb/c小鼠随机分为4组：假手术组(S组)、脓毒症组(CLP组)、大蒜素治疗组(Allicin组)及自噬抑制组(3-MA组)。脓 毒症模型采用盲肠结扎穿孔法;Allicin组于术后6和12 h用大蒜素(30 mg/kg,腹膜内注射)干预;3-MA组在大蒜素干预 之后0.5 h加用3-MA(15 mg/kg,腹膜内注射);S组和CLP组于同时间点给予等量生理盐水。每组随机取20只小鼠,观 察术后7 d生存率。每组各取12只小鼠,于术后24 h时收集肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fl uid,BALF)(n=6)及肺组织 (n=6),采用ELISA法测定BALF中TNF-α和IL-6水平;HE染色观察肺部病理变化,免疫组织化学法测定肺组织自噬蛋 白微管相关蛋白1轻链3B(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3B)和Beclin-1的表达;采用比色法检测肺组织 MDA含量及SOD活性。结果：与S组比较,CLP组7 d生存率降低(P<0.05),BALF中TNF-α及IL-6水平升高(P<0.05),肺 损伤评分增加(P<0.05),肺组织MDA含量增加、SOD活性下降(P<0.05),肺组织LC3B及Beclin-1表达升高(P<0.05);与 CLP组比较,Allicin组7 d生存率升高(P<0.05),BALF中TNF-α和IL-6水平降低(P<0.05),肺损伤评分下降(P<0.05),肺组 织MDA含量下降,SOD活性增加(P<0.05),肺组织LC3B和Beclin-1表达升高(P<0.05);与Allicin组比较,3-MA组小鼠7 d 生存率降低(P<0.05),BALF中TNF-α和IL-6水平升高(P<0.05),肺损伤评分增加(P<0.05),肺组织MDA含量增加、SOD 活性下降(P<0.05),肺组织LC3B和Beclin-1表达降低(P<0.05)。结论：大蒜素可能通过增强自噬水平减轻脓毒症小鼠急 性肺损伤。     

饥饿对Beclin-1依赖的Ana-1细胞自噬和凋亡的影响

目的：研究饥饿对Ana-1细胞自噬和凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法：体外培养Ana-1细胞,将细胞分为对照组（饥饿0h）和饥饿3、6、9、12、24h组（饥饿组）,观察饥饿对细胞自噬与凋亡的影响;将Ana-1细胞分为空白对照组、饥饿组、3-甲基腺嘌呤（3-MA）组、3-MA联合饥饿组,孵育24 h,采用Western blotting法检测各组细胞中自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及Beclin-1蛋白表达水平和凋亡相关蛋白Caspase-3蛋白水平,采用倒置显微镜观察饥饿6、12和24 h组细胞形态表现。结果：与对照组比较,饥饿6、12和24h组Ana-1细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值,饥饿3、6、9、12和24 h组Ana-1细胞中Beclin-1蛋白表达水平均明显升高（P<0.05或P<0.01）,饥饿3、6、9、12和24 h组Ana-1细胞中Caspase-3水平明显降低（P<0.01）,呈时间依赖性;倒置显微镜下观察,与对照组比较,不同时间饥饿组细胞形态发生改变,细胞皱缩、出现碎片,随着时间的延长,细胞变化更加明显。与饥饿组比较,3-MA联合饥饿组Ana-1细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Beclin-1蛋白表达水平及Caspase-3蛋白水平均明显降低（P<0.05或P<0.01）。结论：饥饿可诱导Beclin-1依赖的Ana-1细胞自噬并引起细胞凋亡。     

利福平通过促进自噬保护帕金森病模型细胞损伤

目的: 探讨利福平对α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)多聚体水平的影响及其与细胞自噬的关系。方法: 用不同浓度鱼藤酮、利福平、自噬抑制剂氯喹和自噬促进剂雷帕霉素处理SH-SY5Y细胞,MTT法检测细胞存活率,筛选最佳实验浓度;蛋白质印迹法检测氯喹和雷帕霉素处理后不同时间点细胞内Beclin-1表达水平,确定最佳作用时间;蛋白质印迹法检测鱼藤酮、氯喹和雷帕霉素处理后Beclin-1和α-syn多聚体的表达;将SH-SY5Y细胞分为对照组、鱼藤酮组、利福平+鱼藤酮组和利福平组,流式细胞术检测4组细胞凋亡率,蛋白质印迹法检测α-syn多聚体及自噬标志蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、p62的表达;在上述分组基础上,蛋白质印迹法检测氯喹和雷帕霉素预处理后各组细胞α-syn多聚体的表达。结果： 利福平浓度为150 μmol/L时细胞存活率最高;氯喹、雷帕霉素调节自噬的最佳处理条件分别为10 μmol/L(1 h)、10 nmol/L(2 h);与对照组相比,鱼藤酮、氯喹均能显著增加细胞内α-syn多聚体表达(P均＜0.01),降低Beclin-1表达(P均＜0.05),雷帕霉素能显著提高Beclin-1表达(P＜0.01);与对照组比较,鱼藤酮组细胞凋亡率明显上升(P＜0.05),p62和α-syn多聚体表达增加,Beclin-1和LC3-Ⅱ/Ⅰ表达明显降低(P均＜0.01);与鱼藤酮组相比,利福平+鱼藤酮组细胞凋亡率明显降低(P＜0.05),p62和α-syn多聚体表达明显减少,Beclin-1和LC3-Ⅱ/Ⅰ表达明显升高(P均＜0.01);与利福平+鱼藤酮组比较,氯喹预处理后α-syn多聚体表达明显增加(P＜0.01)。 结论： 利福平能减少鱼藤酮诱导的多巴胺能神经元凋亡,可能通过促进细胞自噬降低α-syn多聚体表达。     

HMGB1下调的作用：通过抑制神经元细胞自噬和凋亡减轻大鼠脑出血后的神经元损伤

目的 探讨高迁移率族蛋白1（HMGB1）在大鼠脑出血后对神经元细胞自噬和凋亡的作用机制。方法 将20只Wistar大鼠随机分为4组（5只/组）：假手术组（Sham组）、脑出血组、HMGB1中和抗体治疗（anti-HMGB1）组、control IgG组。模型组选择颅内纹状体注射0.2 U/mL胶原酶Ⅳ建立脑出血大鼠模型。Sham组颅内注射2 μL生理盐水,术后尾静脉注射PBS,6 h后再次注入等量PBS;anti-HMGB1组术后尾静脉注射1 mg/kg anti-HMGB1单克隆抗体,6 h后再次注入等量抗体;control IgG组术后尾静脉1 mg/kg anti-IgG单克隆抗体,6 h后再次注入等量抗体。采用改良神经损害程度（mNSS）评分评估大鼠神经功能和损伤程度。TUNEL染色检测纹状体神经元凋亡。Western blot检测血肿周围脑组织神经元细胞HMGB1、自噬蛋白（Beclin-1、LC3-II和LC3-I）和凋亡相关蛋白（Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3）的表达。免疫组化检测纹状体组织中HMGB1阳性表达。ELISA检测血清HMGB1含量变化。结果 造模成功后,脑出血组中mNSS评分增加（P<0.05）,给予anti-HMGB1单克隆抗体后,mNSS评分减少（P<0.05）。与 Sham 组相比,脑出血组大鼠纹状体神经元凋亡率增加（P<0.001）,Beclin-1、LC3-II、Bax 和 cleavedcaspase-3的表达增加（P<0.05）,而LC3-I和Bcl-2的表达减少（P<0.05）,HMGB1含量增加（P<0.05）。给予anti-HMGB1单克隆抗体后,大鼠纹状体神经元凋亡率减少（P<0.05）,Beclin-1、LC3-II、Bax和cleaved caspase-3的表达减少（P<0.05）,而LC3-I和Bcl-2的表达增加（P<0.05）,HMGB1含量减少（P<0.05）。结论 anti-HMGB1单克隆抗体下调HMGB1水平改善大鼠脑出血后的神经功能,其机制可能是抑制大鼠脑出血后的神经元细胞自噬和凋亡。