Apak稳定敲除细胞系的建立及其p53活性和凋亡水平的变化

目的：利用CRISPR／Cas9慢病毒系统在人结肠癌细胞（ HCT116细胞）中建立稳定及永久性Apak敲除细胞系,检测Apak敲除后细胞部分生物学活性、p53活性和凋亡水平的变化。方法构建lentiCRISPR v2－sgRNA Apak敲除质粒,进行慢病毒包装,感染HCT116细胞,嘌罗霉素筛选出阳性克隆。通过蛋白质免疫印迹检测Apak蛋白水平,筛选得到Apak稳定敲除细胞系。分别通过报告基因实验、流式细胞术和克隆形成实验测定Apak稳定敲除细胞系中p53活性、细胞凋亡率和克隆形成能力。结果通过测序证明lentiCRISPR v2－sgRNA Apak敲除质粒正确,蛋白质免疫印迹证实Apak敲除细胞系中Apak表达缺失。在Apak敲除细胞系中p53的转录活性增强,Apak敲除细胞凋亡增加、克隆形成能力降低。结论获得Apak稳定敲除细胞系,便于后期Apak功能的研究。     

Apak对p53R175H的调控研究

目的 探讨Kruppel相关盒(KRAB)型锌指蛋白Apak对p53R175H的调节功能及机制.方法 报告基因检测Apak对p53R175H的活性调控,实时定量PCR检测Apak对p53R175H下游靶基因的转录水平的调控能力,Western印迹实验检测蛋白的表达.结果 Apak抑制p53175H的转录活性功能与抑制野生型p53(wtp53)的转录活性功能相比被大大减弱,Apak能够下调wtp53相关凋亡基因的水平,而在转染了p53R175H的细胞中,Apak的这种下调功能几乎丧失.结论 Apak对突变型p53R175H失去调控能力.     

微管结合蛋白NuSAP的组织表达谱分析

目的探讨微管结合蛋白NuSAP的组织分布特征。方法利用组织斑点杂交和Northern杂交分析NuSAP在多种组织中的分布情况,RT-PCR分析NuSAP在多种肿瘤细胞系中的mRNA水平,Western印迹分析NuSAP在多种肿瘤细胞系中的蛋白水平。结果 NuSAP的组织表达谱分析表明该基因在胸腺、胎肝、骨髓中高表达,提示NuSAP在造血免疫中可能发挥重要功能;在多数肿瘤细胞中均可检测到NuSAP的表达,为分析该基因的功能提供了线索。结论本研究揭示了NuSAP是一种组织特异性的微管结合蛋白,可能在造血/免疫组织中发挥重要功能,研究结果对肿瘤、免疫等疾病的防治具有一定的科学意义。     

大肠癌P~(53)蛋白测定与临床生物学意义的相关研究

目的　探讨P53 蛋白表达与大肠癌的关系及临床生物学意义。方法　采用免疫组织化学技术对 32例大肠癌组织及 16例正常大肠组织中的p53 蛋白的表达进行观察和比较。结果　P53 在正常大肠组织中表达阴性 ,P53 蛋白在大肠癌组织中表达阳性率为 5 3 13%。P53 蛋白在大肠癌组织中的表达与患者的性别、年龄、肿瘤大小、部位、大体分型、浸润深度、组织学类型、Ducks’分期及局部淋巴结转移无明显关系 (P >0 .0 5 )。P53 蛋白表达与大肠癌伴肝转移相关 (P <0 .0 5 )。结论　P53 蛋白在大肠癌组织中表达阳性 ,尤以伴肝转移者为著。p53 蛋白过度表达提示预后不良。     

低氧状态下Apak对rRNA转录的调控

目的 探讨低氧状态下Kruppel相关盒(KRAB)型锌指蛋白Apak对核糖体RNA(rRNA)转录影响变化及机制.方法 利用实时定量PCR检测低氧状态下rRNA转录水平的变化及Apak对rRNA转录水平的影响,Western印迹检测蛋白的表达,间接免疫荧光观察低氧状态下Apak的定位变化.结果 在低氧(0.3%O2)处理24 h内,野生型HCT116细胞rRNA表达水平呈现先高后低的变化,而在Apak敲除的HCT116细胞系中,低氧处理后rRNA转录水平持续下降;低氧处理3 h后,Apak对rRNA转录的抑制能力消失,Apak的蛋白水平和磷酸化水平降低,在细胞核仁中的定位消失.结论 低氧处理后Apak对rRNA转录抑制能力的消失促使rRNA转录水平的暂时升高.     

Rho家庭蛋白在胃癌细胞系中的表达及意义

为了研究Rho家族 5个重要成员在胃癌细胞中的表达 ,探讨Rho家族在胃癌发生、发展中的意义 ,分别利用半定量RT PCR和Westernblotting检测胃癌细胞系中RhoA、RhoB、RhoC、Rac1和Cdc4 2的mRNA和蛋白表达水平。结果发现 ,与正常对照肠上皮细胞系相比 ,5种胃癌细胞系中的RhoA、Rac1、Cdc4 2的mRNA和蛋白表达均上调 ;在所有细胞系中均无RhoB的表达 ,RhoC仅在胃粘膜组织和有转移潜能的细胞系中有表达 ,而胰岛素可以诱导肠上皮细胞表达RhoB ,进一步证实了RhoB是一个即刻反应蛋白 ;Rho家族中RhoA、Rac1、Cdc4 2在胃癌细胞系中高表达提示Rho家族可能在胃癌的发生过程中有重要的作用     

受体型蛋白酪氨酸磷酸酶O及P53在胃癌中的表达及其与预后的关系

目的检测受体型蛋白酪氨酸磷酸酶O(PTPRO)、P53蛋白在胃癌组织中的表达,分析其与临床病理特征及预后的关系。方法回顾性分析2004年1月-2007年12月,在解放军总医院行D2根治术后并行氟尿嘧啶为主的辅助化疗4周期以上的Ⅱ-ⅢC期胃癌患者共61例,应用免疫组化法检测胃癌组织、癌旁组织和转移淋巴结中PTPRO蛋白表达,同时检测胃癌组织中P53蛋白表达,分析其与患者临床病理特征及预后的关系。结果 61例标本中,PTPRO在胃癌组织、癌旁组织、转移淋巴结中阳性率分别为65.6%、94.8%6、5.9%(P<0.01);P53在胃癌组织阳性率为36.2%;P53表达与PTPRO表达无相关性(r=0.169,P=0.20)。单因素分析显示,与临床分期晚、P53阳性的患者比较,P53阴性(P=0.022)、临床分期越早(P=0.000)的患者中位无病生存期(MDFS)越长(P<0.05);P53阴性(P=0.001)、临床分期越早(P=0.001)的患者中位生存时间(MST)越长(P<0.05)。多因素分析显示临床分期(P=0.001)、PTPRO蛋白表达(P=0.018)、P53蛋白表达(P=0.031)是影响胃癌术后患者DFS的独立影响因素,而临床分期(P=0.005)、PTPRO蛋白表达(P=0.014)、P53蛋白表达(P=0.033)、组织学分级(P=0.020)是影响其总生存期(OS)的独立影响因素。结论 PTPRO在胃癌组织中的表达显著减少。对于胃癌D2根治术后行氟尿嘧啶为主辅助化疗的患者,PTPRO和P53蛋白表达有望成为预测疗效的分子标记物。     

肿瘤中GLI1 RNA编辑的下调及其潜在功能分析

目的检测癌相关基因GLI1编码区发生的A-to-I RNA编辑,比较编辑水平在肿瘤与正常细胞系中的差异,并分析编辑事件的潜在影响,以期揭示其与癌症发生发展的关联。方法通过PCR、RT-PCR及测序的方法检测GLI1编码区DNA和RNA序列上的差异,以此来识别该区域上的A-to-I RNA编辑事件和比较肿瘤与正常细胞系中编辑位点的编辑水平差异。使用多种生物信息学工具分析编辑事件的潜在功能影响。结果在人脑、乳腺、小肠组织及多种细胞系中均检测到GLI1转录本上对应染色体12∶56150891的位置发生A-to-I RNA编辑,该编辑事件导致GLI1第701位氨基酸由精氨酸转变为谷氨酸。与相应的正常细胞系相比,肝癌细胞系及乳腺癌细胞系中该位点的编辑水平明显降低。生物信息学分析表明此编辑事件能改变编码的氨基酸,并可能破坏外显子剪接增强子及影响蛋白质高级结构。结论 GLI1编码区发生的A-to-I RNA编辑在人脑、乳腺、小肠组织及多种细胞系中普遍存在。该编辑事件在肝癌和乳腺癌细胞系中的下调提示其可能与癌症的发生发展相关。     

肿瘤中GLI1 RNA编辑的下调及其潜在功能分析

目的检测癌相关基因GLI1编码区发生的A-to-I RNA编辑,比较编辑水平在肿瘤与正常细胞系中的差异,并分析编辑事件的潜在影响,以期揭示其与癌症发生发展的关联。方法通过PCR、RT-PCR及测序的方法检测GLI1编码区DNA和RNA序列上的差异,以此来识别该区域上的A-to-I RNA编辑事件和比较肿瘤与正常细胞系中编辑位点的编辑水平差异。使用多种生物信息学工具分析编辑事件的潜在功能影响。结果在人脑、乳腺、小肠组织及多种细胞系中均检测到GLI1转录本上对应染色体12∶56150891的位置发生A-to-I RNA编辑,该编辑事件导致GLI1第701位氨基酸由精氨酸转变为谷氨酸。与相应的正常细胞系相比,肝癌细胞系及乳腺癌细胞系中该位点的编辑水平明显降低。生物信息学分析表明此编辑事件能改变编码的氨基酸,并可能破坏外显子剪接增强子及影响蛋白质高级结构。结论 GLI1编码区发生的A-to-I RNA编辑在人脑、乳腺、小肠组织及多种细胞系中普遍存在。该编辑事件在肝癌和乳腺癌细胞系中的下调提示其可能与癌症的发生发展相关。     

P53、MVD在非小细胞肺癌中的表达及其相关性

目的:研究P53、MVD在非小细胞肺癌中的表达及其相关性,探讨其在非小细胞肺癌发生、发展中的作用。方法:采用免疫组织化学SP法检测80例非小细胞肺癌组织、20例肺良性病变组织中P53蛋白的表达,并对肺癌组织中CD34单抗标记的血管计数MVD。结果:肺癌组织P53阳性表达率明显高于肺良性病变组织(P<0.05)。P53表达与肺癌患者的组织学类型无关(P>0.05),与肺癌组织的分化程度、TNM分期及淋巴结转移均有关(P<0.05)。在肺癌组织中,P53蛋白表达阳性组MVD明显高于P53蛋白表达阴性组(P<0.05)。结论:P53可能与肺癌的发生、发展有关。肺癌组织中MVD与P53表达密切相关,突变型p53基因在肺癌血管形成中具有重要作用。     

Apak的亚细胞定位机制研究

目的探讨P53的调控分子Apak亚细胞定位的结构基础。方法在热休克及DNA损伤诱导剂MMS处理下,通过免疫荧光技术观察Apak的亚细胞定位变化,并通过激光共聚焦荧光显微镜观察Apak截短体的亚细胞定位。结果 Apak多以均匀的形式分布在细胞核质,偶见在核仁中聚集;在外界刺激后Apak核内的均匀分布减少,主要以点状的大颗粒形式在核仁中呈聚集样分布;Apak的9种截短体均可定位于核内,且在核质和核仁中具有明显的比例差异。结论在DNA损伤信号下Apak有一个从核质向核仁移位的动态过程;KRAB区可以拮抗Apak在核仁的定位,而锌指尤其是锌指数的数目（锌指数〉14）则决定了Apak能否在核仁定位。     

γ-catenin在白血病细胞中的表达

目的检测白血病骨髓标本及白血病细胞株中γ-catenin的表达情况,探讨γ-catenin在白血病细胞中的作用。方法以RT-PCR检测76例白血病骨髓标本、8例正常骨髓标本和白血病细胞株K562、HL-60、U-937、Jurkat中γ-catenin的mRNA表达情况,以Western blot和免疫细胞化学法检测上述白血病细胞株中γ-catenin蛋白表达及其分布情况。结果正常骨髓标本中γ-catenin表达阳性率为0（0/8）,急性髓细胞白血病（AML）骨髓标本中γ-catenin表达阳性率为40.0%[12/30,其中M2型的阳性率为50.0%（7/14）],慢性髓细胞白血病（CML）骨髓标本中γ-catenin表达阳性率为13.6%（3/22）,急性淋巴细胞白血病（ALL）和慢性淋巴细胞白血病（CLL）骨髓标本中γ-catenin表达阳性率均为25.0%（3/12）。白血病组γ-catenin表达阳性率与正常组相比,AML组有显著性差异（P〈0.05,其中M2型最为显著）,其余各组均无显著性差异（P〉0.05）。RT-PCR及免疫组化检测可见HL-60和K562细胞γ-catenin呈强阳性,U-937和Jurkat细胞呈弱阳性表达,且γ-catenin主要表达于细胞质中。Western blot检测见K562和HL-60细胞γ-catenin呈阳性表达,而U-937和Jurkat细胞未见表达。结论作为细胞内信号传导分子,γ-catenin表达于AML组、HL-60及K562细胞中,可能与急性髓细胞白血病（特别是M2型）的发生有关。     

乙型肝炎病毒DNA聚合酶反式调节人类新基因HBVDNAPTP1的克隆及原核表达与组织表达分析

目的 克隆应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学技术筛选得到的乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶反式调节新型靶基因HBVDNAPTP1,构建HBVDNAPTP1基因的原核表达载体,诱导其在大肠埃希菌中表达,并进一步分析HBVDNAPTP1在组织中的分布表达水平.方法 应用RT-PCR技术扩增获得HBVDNAPTP1基因片段,测序正确后插入至原核表达载体pET-32a( )中,转化BL21(DE3)宿主菌,IPTG诱导以获得HBVDNAPTP1融合蛋白的表达,利用Western blot证实表达蛋白的特异性.应用UniGene数据库对HBVDNAPTP1基因的染色体中定位及组织分布表达水平进行分析.结果 RT-PCR扩增获得HBVDNAPTP1基因片段,插入pET-32a( )表达载体,转化BL21(DE3)受体菌,经IPTG诱导获得了HBVDNAPTP1重组蛋白的表达,Western blot证实了表达的重组蛋白的特异性.HBVDNAPTP1在多数组织中低表达,仅在脑垂体腺、扁桃体、舌、胸腺、气管与脐带中无表达.结论 成功构建了HBVDNAPTP1基因的原核表达载体,利用大肠埃希菌原核表达系统获得了重组蛋白的表达,并初步了解了HBVDNAPTP1基因的染色体定位与组织表达水平.     

人分化相关基因Ndr3的克隆、组织表达谱及亚细胞定位研究

目的 :研究人源分化相关新基因Ndr3的克隆、组织表达谱及亚细胞定位。方法 :采用电子拼接和PCR扩增技术 ,从人 2 2周孕龄胎肝cDNA文库中获得与人Ndr1基因同源的一段表达性序列标签 ,继而从成人脑cDNA文库分离出Ndr3的全长cDNA ;采用点杂交分析和多组织Northern杂交分析方法 ,确定其组织表达谱 ;将其亚克隆入绿色荧光蛋白表达载体pEGFP_N1,用脂质体介导法转染COS_7细胞 ,确定其亚细胞定位。结果与结论 :Ndr3的全长cDNA为 2 879bp ,其开放阅读框 (ORF)编码 375个氨基酸 ,染色体定位为 2 0q12_11.2 3。Northern杂交和点杂交分析显示 ,NDR3在脑组织和睾丸中高表达 ,在肾、心肌和前列腺中有一定量的表达 ,在胚胎组织的表达较低 ,在 8种人肿瘤细胞中的表达极低。与绿色荧光蛋白融合表达的实验结果显示 ,该蛋白定位于核外胞浆内     

内皮活化相关新基因EOLA1的亚细胞定位及组织表达

目的研究内皮细胞高表达脂多糖相关因子1(EOLA1)基因的亚细胞定位和组织表达特性,为对其进行进一步的功能研究打下基础。方法构建EOLA1-EGFP(绿色荧光蛋白)融合蛋白表达质粒,转染内皮细胞后瞬时表达,在激光共聚焦显微镜下观察EOLA1蛋白的亚细胞定位;通过人多组织Northern杂交研究EOLA1基因的组织表达。结果EOLA1蛋白在正常人各组织中呈选择性表达,在人的心脏、骨骼肌、肾脏、肝脏和胎盘组织中有较强的表达,在结肠、脾脏和小肠中有较弱的表达,而在脑、胸腺、肺和外周白细胞中无表达;EOLA1蛋白主要定位于细胞浆,少量表达于细胞核。结论EOLA1属胞内蛋白,可能在细胞内信号转导中起着作用。     

髓细胞白血病β—catenin表达及与外源性Wnt5a的作用关系

目的调查β-catenin在髓细胞白血病标本及细胞株中的表达,明确外源性Wnt5a与K562细胞β-catenin表达的关系。方法首先以RT-PCR和免疫组化检测β-catenin在髓细胞白血病标本及细胞株中的表达,再以Wnt5a条件培养液处理K562细胞,然后用Westernblot检测β-catenin表达变化。结果β-catenin在髓细胞系白血病标本及细胞株中有普遍表达,但外源性Wnt5a不能明显下调K562细胞β-catenin表达。结论外源性Wnt5a对K562细胞Wnt／β-catenin信号传导途径无明显抑制作用。     

111In-DTPA-D-Phe1-octreotide binding and somatostatin receptor subtypes in thyroid tumors.

The purpose of this study was to evaluate the potential for therapy of thyroid tumors using the radiolabeled somatostatin (SS) analog octreotide. METHODS: Concentrations of 111In activity in human thyroid tumors and normal thyroid tissue and blood samples were determined 1-15 d after intravenous injection of 111In-diethylenetriaminepentaacetic acid-Phe1-octreotide. The results were compared with SS receptor (sstr subtype profile (by Northern blot analysis) and the relative expression of the second subtype, sstr2 (by ribonuclease protection assay, RPA). The true tumor volumes in lymph node metastases from 1 patient were estimated. In total, tissues from 68 patients were included in the study. RESULTS: The highest tumor-to-blood ratio (T/B) for medullary thyroid carcinoma (MTC) was 360; for follicular adenoma (FA), 190; for Hurthle cell adenoma (HCA), 140; and for Hurthle cell carcinoma (HCC) and papillary carcinoma (PC), 70. The corresponding value was 7-18 for normal thyroid tissue, with higher values for colloid goiter (8-48) and thyroiditis (7-120). A high T/B was related to a large fraction of tumor cells in lymph node metastases. T/Bs were higher for the tumor samples with expression of sstr2 at Northern blot analysis than for those without. All thyroid tumor types regularly expressed sstr1, sstr3, sstr4, and sstr5. sstr2 was expressed in most MTC tumors but was not detected in FA or PC and was irregularly expressed in HCA and HCC. However, RPA analysis detected sstr2 in all tumors studied. CONCLUSION: Despite the lack of sstr2 at Northern blot analysis in most of the thyroid tumors studied, high T/Bs were in general found when compared with corresponding values for normal thyroid tissue. The sometimes extremely high ratios are promising and indicate a possibility of using radiolabeled octreotide for radiation therapy of sstr-positive tumors in the future.