IRE1α重组腺病毒载体对ATDC5软骨干细胞增殖及凋亡的影响

目的 构建重组人IRE1α腺病毒,观察其对软骨干细胞ATDC5增殖与凋亡的影响.方法 应用pAdEasyTM腺病毒载体系统构建包含全长IRE1α基因和RNase+Kinase核心结构域的重组穿梭质粒pAdTrack-IRE1α、pAdTrack-R+K,通过电转法分别与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1进行同源重组,获得重组腺病毒pAd-IRE1α、pAd-R+K.随后在HEK-293细胞中包装并扩增重组腺病毒颗粒Ad-IRE1α、Ad-R+K.用直接PCR法鉴定重组腺病毒,后者体外感染软骨干细胞ATDC5,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)感染效率,并应用流式细胞仪分别检测在内质网应激(ERS)和非ERS状态时重组腺病毒对ATDC5细胞增殖和凋亡的影响.结果 酶切鉴定和PCR证实成功构建了重组腺病毒质粒pAd-IRE1α、pAd-R+K.流式细胞仪检测结果显示,在ERS状态时,重组腺病毒质粒Ad-IRE1α、Ad-R+K感染后ATDC5细胞G1期比例明显降低,S期细胞比例明显升高(P＜0.05),细胞凋亡率明显增高(P＜0.05).结论 含IRE1α基因的重组腺病毒感染可促进ATDC5细胞的增殖和凋亡.     

IL-1对多发性骨髓瘤细胞粘附分子表达的影响

为探讨人骨髓瘤细胞株ＫＭ３表面粘附分子的表达及ＩＬ－１对粘附分子表达的影响，应用直接免疫荧光标记流式细胞术分析人骨髓瘤细胞株ＫＭ３细胞表面粘附分子表达，以荧光阳性率和平均荧光强度两个指标反映粘附分子的表达量，研究ＩＬ－１对ＫＭ３细胞粘附分子表达调控。发现正常情况下，ＫＭ３细胞表面表达粘附分子ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ，不表达ＣＤ５６和ＣＤ４９ｄ；ＩＬ－１以剂量非依赖方式促进ＫＭ３细胞表面ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ表达。为进一步应用ＫＭ３细胞探讨粘附分子在ＭＭ发病机制中的作用提供实验依据     

白介素-6对马法兰诱导多发性骨髓瘤细胞KM3凋亡的影响

目的探讨白介素-6（IL-6）在马法兰诱导人多发性骨髓瘤细胞株KM。凋亡效应中的作用及其可能的分子机制。方法运用流式细胞仪技术（FACS）、DNA片段化百分率、凋亡细胞的原位检测（TUNEL法）和Western blot分析，观察II；6对马法兰诱导KM。细胞凋亡的影响及其caspase-3、caspase-8蛋白表达的变化。结果IL-6作用可使马法兰诱导的KM3细胞凋亡减少，同时caspase-3蛋白表达降低。结论1176可通过调节caspase-3、caspase-8表达保护马法兰诱导的KM3细胞凋亡。     

细胞外信号调节激酶1/2传导通路在不同发育阶段皮肤组织内的变化

为研究磷酸化细胞外信号调节激酶1/2（p-ERK1/2）、Ras和C-fos在不同发育阶段皮肤中的表达特征及其可能的生物学意义,用免疫组化技术检测这3种蛋白在8例胎儿皮肤和8例成人皮肤中的表达变化规律。结果发现,在胎儿发育初期,p-ERK1/2、Ras和C-fos蛋白表达较低,随着胎儿生长发育,这3种蛋白的阳性细胞率逐渐增大,在妊娠后期胎儿和成人皮肤组织中,3种蛋白的阳性细胞率明显高于妊娠早期胎儿皮肤（P<0.01）。p-ERK1/2、Ras和C-fos蛋白在不同发育阶段皮肤组织内都有表达,显示它们可能对皮肤的发生、结构和功能的维持以及损伤后修复十分重要。     

携带人鞘氨醇激酶及突变体基因重组腺病毒载体的制备及表达

目的制备携带人野生型鞘氨醇激酶基因(SPK^wt)及其突变体(SPK^DN)的腺病毒载体,为研究SPK的生物学功能提供高效基因转移载体。方法将野生型和突变体SPK基因亚克隆至穿梭载体pshuttle-cmv,重组的穿梭质粒经Pme线性化后,电转化E.coli BJ-AD-1感受态,获得带有目的基因的腺病毒重组子质粒;重组子经Pac I线性化后,以脂质体介导转染293包装细胞,获得重组腺病毒载体;分别行PCR鉴定重组腺病毒是否携带目的基因,Western blot鉴定目的基因是否表达,酶活性检测判断野生型基因和突变体基因表达活性。结果重组腺病毒带有目的基因,可以感染内皮细胞并正确表达,酶活性分析表明野生型SPK基因增强SPK活性,突变体SPK基因抑制SPK活性。结论成功构建了携带SPK野生型及其突受体的重组腺病毒,为研究SPK的功能提供了物质基础。     

Rack1敲低促进TGF-β诱导的A549细胞的上皮-间充质转化

目的 研究Rack1分子在TGF-β诱导A549细胞发生上皮-间充质转化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)过程中的功能.方法 制备携带不同Rack1干涉序列的慢病毒颗粒,并感染A549细胞建立稳定细胞系.选取敲低效率较高的细胞系,利用MTS、细胞划痕、免疫印迹等技术检测Rack1敲低后细胞的增殖、TGF-β诱导的迁移及相关分子表达水平的改变.结果 获得了Rack1稳定敲低的细胞系,Rack1敲低后细胞增殖减慢,TGF-β诱导的迁移加快,钙黏蛋白E(E-cadherin)下调和胞外信号调节激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)磷酸化水平升高.结论 Rack1分子敲低促进EMT的发生.     

增生性瘢痕形成和成熟过程中细胞外信号调节激酶基因表达的变化

细胞外信号调节蛋白激酶(ERKs)是一类分布于细胞质内且具有丝氨酸和苏氨酸双重磷酸化能力的蛋白激酶，主要包含两种亚型：ERKl和ERK2，它们介导的信号通路在细胞生长因子影响细胞分裂、增殖和分化的过程中起重要的作用。因此，笔者拟通过检测不同形成时期的增生性瘢痕中ERKs信号通路中部分信使分子的基因表达变化，初步     

血管紧张素Ⅱ2型受体重组腺病毒的扩增及其在INS－1细胞中的转染

目的：利用人胚肾（HEK）293A细胞株扩增含有大鼠血管紧张素Ⅱ2型受体（AT2R）基因的重组腺病毒,并在大鼠胰岛素瘤细胞INS－1细胞株中进行转染,构建AT2R高表达的胰岛β细胞模型。方法利用293A细胞株扩增重组腺病毒Ad－G－AT2R－EGFP和对照病毒Ad－CMV－EGFP,并测定病毒滴度。在INS－1细胞中瞬时转染后利用实时PCR、Western 印迹以及免疫荧光和激光共聚焦技术检测细胞中AT2R与AT1R的表达。结果扩增后得到重组腺病毒Ad－G－AT2R－EGFP和Ad－CMV－EGFP的滴度分别为9×109和8×109 pfu／ml。在INS－1细胞中转染Ad－G－AT2R－EGFP后,AT2R mRNA的表达随病毒感染复数（multiplicity of infection,MOI）值的增加呈剂量依赖性增加。当MOI值为10时,AT2R mRNA的表达达到峰值（P＜0．05）,同时AT2R蛋白的表达明显高于转染了Ad－CMV－EG－FP的细胞和未转染细胞,但AT1R的表达无显著变化。结论成功扩增并得到高滴度且携带有AT2R基因的重组腺病毒载体,并将其转染入INS－1细胞中构建出AT2R高表达的胰岛β细胞模型,为下一步探讨AT2R在胰岛β细胞中的作用奠定了基础。     

Erk信号传导通路对乙醛刺激的大鼠肝星状细胞增殖的影响

目的:探讨乙醛激活HSC过程中Erk的变化,以及阻断Erk信号传导通路对HSC增殖的影响。方法:用乙醛刺激,不同剂量PD98059预处理后的HSC,采用免疫组织化学方法检测细胞中Erk的变化,并以细胞计数和MTT比色法观察PD98059Erk对HSC增殖的影响。结果:乙醛刺激HSC后Erk胞浆表达向胞核移行,PD98059阻断Erk核内移行,随剂量递增愈发明显,PD98059在20μmol/L时对HSC增殖有抑制作用,P<0.05;50μmol/L、100μmol/L时抑制作用明显,P<0.01。结论:Erk信号传导通路参与乙醛激活HSC的过程,PD98059对乙醛刺激的HSC增殖具有抑制作用,提示Erk信号传导通路是调控乙醛刺激的HSC增殖重要通道。     

重组腺病毒肝细胞生长因子对乙型肝炎病毒感染滋养层细胞的抑制作用

目的：探讨肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor,HGF）对乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）体外感染滋养层细胞（JEGⅢ）的治疗作用。方法：在转染与不转染rAd-HGF两种情况下,HBV阳性血清感染JEGⅢ。用GIMSA染色、透射电镜及荧光定量PCR三种方法观察感染后细胞形态学及培养物中HBV-DNA含量的变化。结果：形态学观察转染rAd-HGF组细胞病变较未转染组有明显减轻,且未转染组胞质内可见HBV颗粒。荧光定量PCR显示未转染Ad-HGF组培养上清中HBV-DNA含量较转染组明显增高（P〈0.05）。结论：HGF可有效抑制HBV感染滋养层细胞。     

KAI1基因外源性过表达对胆管癌细胞层黏素受体的影响

目的研究KAI1基因外源性过表达对胆管癌细胞层黏素受体(LNR)表达的影响。方法体外培养人胆管癌QBC939细胞,分为两组:转染空载体pIRES2-EGFP对照组和转染重组真核载体pIRES2-EGFP-KAI1实验组。采用脂质体转染法分别将空载体和重组真核载体转染到QBC939细胞,经G418筛选,得到阳性克隆细胞株。通过RT-PCR、Western blotting和细胞免疫组化法,分别检测KAI1、LNR的mRNA及蛋白表达水平。结果实验组的KAI1 mRNA、蛋白表达量(分别为0.49±0.071、.06±0.05)均显著高于对照组(分别为0.22±0.02、0.59±0.02,P<0.01);实验组的LNR mRNA、蛋白表达量(分别为0.38±0.04、0.29±0.03)均显著低于对照组(分别为0.73±0.05、0.68±0.02,P<0.05)。与对照组比较,实验组KAI1蛋白在胞质的着色明显增强、LNR着色减弱。结论体外胆管癌QBC939细胞过表达KAI1可导致LNR mRNA和蛋白表达下调。     

酪氨酸激酶抑制剂抑制骨髓瘤细胞的增殖及Rac1的表达

目的:观察酪氨酸激酶抑制剂STI571对骨髓瘤细胞系RPMI8226细胞增殖、细胞周期以及Rac1 mRNA表达的影响。方法:采用MTT法检测STI571对骨髓瘤细胞增殖的影响;流式细胞仪检测对细胞周期的影响;半定量RT-PCR研究Rac1mRNA水平的变化。结果:STI571明显抑制RPMI8226细胞的增殖,24、48、72 h IC50值分别为(34.52±2.31)μmol/L、(28.46±1.58)μmol/L、(25.74±2.44)μmol/L。25μmol/L STI571处理24 h,G1期细胞由55.8%增加至72.4%,S期细胞由34.8%减至15.6%。半定量RT-PCR显示,Rac1 mRNA水平在25μmol/L STI571处理24 h后明显下降。结论:STI571能抑制RPMI8226细胞的增殖,并可下调其Rac1 mRNA水平。     

KAI1和P53在滋养细胞疾病中的表达及意义

目的：探讨KAI1和P53蛋白在滋养细胞疾病中的表达及与滋养细胞肿瘤侵袭的关系。方法：应用免疫组织化学SP法检测正常早孕绒毛组织及滋养细胞肿瘤组织中KAI1和P53蛋白的表达情况。结果：①KAI1在恶性葡萄胎及绒癌中的表达与正常早孕绒毛及葡萄胎比较明显下降（P〈0．05），KAI1的表达与滋养细胞肿瘤患者的年龄和浸润情况相关（P〈0．05）；②P53在恶性葡萄胎及绒癌中的表达与正常早孕绒毛及葡萄胎比较明显升高（P〈0．05）；③P53和KAI1表达之间无明显相关（P〉0．05，rs=-0．8）。结论：P53、KAI1对预测滋养细胞的恶变，判断预后有一定的参考价值。     

马法兰作用后多发性骨髓瘤细胞APE1蛋白表达的改变及意义

目的探讨脱嘌呤／脱嘧啶核酸内切酶（APEl）基因在多发性骨髓瘤（multiple myelorna，MM）细胞中的表达变化及其与马法兰作用的关系。方法采用免疫细胞化学、Western blot方法检测0～15μmol／L马法兰作用KM3多发性骨髓瘤细胞1～2天后APEl表达的变化，并且通过图像分析系统计算其积分光密度值。结果马法兰作用可诱导KM3细胞APE1表达增强，并与其作用时间、剂量成正比。结论马发兰作用可诱导APE1蛋白表达增强，提示其可能在MM对马发兰耐药中起一定作用。     

多发性骨髓瘤误诊为多发性骨转移1例

男,84岁,2003年12月15日因"腰背痛1月"住院.其疼痛呈持续性钝痛,不向他处放射.一年半前患者因肉眼血尿经膀胱镜活检诊为移行细胞癌,后行膀胱癌部分切除术未再发现癌细胞.术后丝裂霉素20 mg每月1次膀胱灌注,定期复查膀胱镜未见复发.患者有老慢支病史30年.     

多肿瘤抑制基因对卵巢癌细胞周期的影响

目的：在以往研究的基础上进一步探讨多肿瘤抑制基因（MTSI）对卵巢癌细胞周期的影响。方法：将卵巢癌细胞（HO8910）和转染空载体的卵巢癌细胞（8910－pcDNA2)作为对照组,与转染MTS1的卵巢癌细胞（8910－p16)同时进行消化收集后经流式细胞仪检测,对比各组间细胞周期的改变。结果：HO－8910细胞经MTS1转染后,其受阻于G1期的细胞增多,同时S期细胞相应减少,而单纯转染空载体并不对细胞周期产生任何影响。结论：MTS1基因可以改变卵巢癌细胞HO－8910的细胞周期,这可能为卵巢癌的基因治疗提供了新的实验依据。     

Immunotherapeutic strategies targeting B cell maturation antigen in multiple myeloma

Multiple myeloma (MM) is the second most common hematologic malignancy,and is characterized by the clonal expansion of malignant plasma cells.Despite the recent improvement in patient outcome due to the use of novel therapeutic agents and stem cell transplantation,all patients eventually relapse due to clone evolution.B cell maturation antigen (BCMA) is highly expressed in and specific for MM cells,and has been implicated in the pathogenesis as well as treatment development for MM.In this review,we will summarize representative anti-BCMA immune therapeutic strategies,including BCMA-targeted vaccines,anti-BCMA antibodies and BCMA-targeted CAR cells.Combination of different immunotherapeutic strategies of targeting BCMA,multi-target immune therapeutic strategies,and adding immune modulatory agents to normalize anti-MM immune system in minimal residual disease(MRD) negative patients,will also be discussed.     

多发性骨髓瘤克隆起源系列研究

多发性骨髓瘤 (Ｍｕｌｔｉｐｌｅｍｙｅｌｏｍａ ,ＭＭ)是Ｂ淋巴细胞分化的终末阶段———浆细胞的恶性增殖性疾病。目前对于ＭＭ发病机制的研究主要从 2个方面着手 :(1)细胞因子网络异常在ＭＭ发病机制中的作用 ;(2 )ＭＭ骨髓瘤细胞克隆的起源 (即骨髓瘤细胞克隆究竟在哪一个阶段发生恶变 )。细胞因子网络研究已取得很大进展 ,证实ＭＭ患者存在细胞因子网络异常[1] 。骨髓瘤细胞克隆起源的研究进展相对缓慢 ,因为骨髓瘤细胞克隆缺乏特异免疫和基因标志。鉴于此 ,我们通过采用分子生物学方法分析ＭＭＩｇＨ基因重排特征 ,探讨ＭＭ骨髓瘤细胞…     

肝癌组织中gp78蛋白与KAI1蛋白的相互关系研究

目的探讨gp78蛋白与肝癌组织中的肿瘤转移抑制基因KAI1蛋白可能存在的相互关系。方法收集肝癌组织30例及与其相对应的癌旁组织标本30例。用MHCC-97肝癌细胞接种裸鼠肝脏,产生肝脏原位肿瘤9例及肿瘤转移灶14例,收集肿瘤组织和正常肝脏组织。采用免疫组织化学和蛋白质印迹技术检测相关组织中gp78蛋白及KAI1蛋白的表达。结果蛋白质印迹结果表明,人肝癌组织中gp78蛋白的表达水平(0.350±0.143)明显高于人癌旁组织(0.036±0.003,P=0.016),而KAI1蛋白的表达水平(0.036±0.008)则明显低于人癌旁组织(1.173±0.124,P=0.003)。与癌旁组织相比,30例肝癌组织中24例(80%)gp78水平升高,20例(66.7%)KAI1水平降低;9例裸鼠肝癌组织中8例(88.9%)gp78水平升高,6例(66.7%)KAI1水平降低;14例肝癌转移灶样本中,12例(85.7%)gp78水平升高,13例(92.8%)KAI1水平降低。免疫组织化学结果显示,30例人肝癌组织中,有22例(73.3%)gp78呈强阳性表达(分值≥5分),19例(63.3%)KAI1阳性表达较低(分值...