羊脱钙骨基质作为骨组织工程支架材料的性能评估

目的 制备山羊脱钙骨基质(decalcified bone matrix,DBM),研究其物理和生物力学特性,为其作为理想的组织工程骨支架材料提供理论依据.方法 制备山羊完全脱钙骨基质,观察其色泽、质地、孔隙度等物理性状,并用扫描电镜观察其孔隙度,测量其孔径;通过测定吸水率评估其亲水性;用生物力学测定仪测定其不同压缩比率下的瞬时形变恢复率、最大形变恢复率及最大极限压缩强度.结果 标准化制备DBM呈乳白色,密度均匀,表面布有较多的微孔,扫描电镜观察其孔径范围为350～450(409.2±39.7)μm,吸水后膨胀,最大值吸水率达(419.0±44.4)%;生物力学测定显示,DBM位移是压缩强度的函数,DBM压缩20%和30%时其最大极限强度分别为(1.43±0.35)N和(1.62±0.51)N,瞬时形变恢复率分别为100%和(91.0±8.2)%.结论 完全脱钙骨基质孔径大,亲水性强,形变恢复好,利于细胞的黏附生长,是理想的组织工程支架材料.     

适用于犬输尿管脱细胞基质制备的灌注系统

目的探讨应用灌注系统制备输尿管脱细胞基质的可行性方案。方法利用输尿管本身存在的管腔结构,通过灌注系统制 备输尿管脱细胞基质。根据化学洗涤剂的不同特性设置3 个不同的灌注组,单纯SDS 组、单纯TritonX-100 组以及联合组 （TritonX-100+SDS）。利用HE染色,DAPI染色,DNA定量,琼脂糖凝胶电泳评价输尿管脱细胞基质中细胞核的残留情况。采 用Masson’s 3色染色、Alcian Blue染色、胶原含量测定、GAG含量测定、扫描电镜和毒性检测等手段评价制备输尿管脱细胞基质 的三维结构和生物活性成分。结果HE染色和DAPI染色显示联合组制备的输尿管脱细胞基质中没有明显的核物质残留, DNA定量和凝胶电泳证实了这一结果。Masson’s 3色染色、Alcian Blue染色、胶原含量测定和GAG含量测定显示联合组保留 了输尿管脱细胞基质三维胶原结构和生物活性成分。扫描电镜观察联合组制备的输尿管脱细胞基质表面存在大量的孔隙结 构。毒性测定证实联合组制备的输尿管脱细胞基质无毒性。结论本研究灌注系统可用于输尿管脱细胞基质的制备,筛选出一 套比较理想的脱细胞方案,制备的输尿管脱细胞基质可用于输尿管组织工程再造。     

尿道修复支架材料生物力学性质比较

目的 检测并比较多种组织工程尿道修复支架材料的生物力学性质.方法 制备小肠黏膜下组织(SIS)、膀胱黏膜下脱细胞基质(BAMG)、聚羟乙酸(PGA)和尿道海绵体脱细胞基质(ACSM)支架材料,对其进行大体观察、HE染色及Masson染色观察.于单向拉伸实验机上检测单层SIS组、BAMG冻干保存组、BAMG液体保存组、ACSM组、PGA组、兔正常尿道标本组和4SIS组(SIS经4层叠加)的Young氏模量、最大载荷、抗拉强度和最大伸长率等生物力学参数,并进行组间比较.结果 ACSM的厚度与其他支架材料有明显差异,HE和Massdn染色显示其由更为丰富的胶原构成.生物力学检测结果显示,Young氏模量:ACSM组>PGA组>4SIS组>BAMG液体保存组>BAMG冻干保存组>兔正常尿道组>SIS组;最大载荷:ACSM组>4SIS组>PGA组>BAMG液体保存组>BAMG冻干保存组>兔正常尿道组>SIS组;抗拉强度:ACSM组>4SIS组>PGA组>BAMG液体保存组>BAMG冻干保存组>兔正常尿道组>SIS组;最大伸长率:兔正常尿道组>SIS组>BAMG冻干保存组>4SIS组>BAMG液体保存组>ACSM组>PGA组.ACSM组在Young氏模量、最大载荷和抗拉强度上显著优于其他组(P<0.01).结论 异种ACSM支架具有良好的生物力学性质,较SIS、BAMG和PGA等支架更适用于尿道重建.     

尿道修复支架材料生物力学性质比较

目的 检测并比较多种组织工程尿道修复支架材料的生物力学性质.方法 制备小肠黏膜下组织（SIS）、膀胱黏膜下脱细胞基质（BAMG）、聚羟乙酸（PGA）和尿道海绵体脱细胞基质（ACSM）支架材料,对其进行大体观察、HE染色及Masson染色观察.于单向拉伸实验机上检测单层SIS组、BAMG冻干保存组、BAMG液体保存组、ACSM组、PGA组、兔正常尿道标本组和4SIS组（SIS经4层叠加）的Young氏模量、最大载荷、抗拉强度和最大伸长率等生物力学参数,并进行组间比较.结果 ACSM的厚度与其他支架材料有明显差异,HE和Massdn染色显示其由更为丰富的胶原构成.生物力学检测结果显示,Young氏模量：ACSM组〉PGA组〉4SIS组〉BAMG液体保存组〉BAMG冻干保存组〉兔正常尿道组〉SIS组;最大载荷：ACSM组〉4SIS组〉PGA组〉BAMG液体保存组〉BAMG冻干保存组〉兔正常尿道组〉SIS组;抗拉强度：ACSM组〉4SIS组〉PGA组〉BAMG液体保存组〉BAMG冻干保存组〉兔正常尿道组〉SIS组;最大伸长率：兔正常尿道组〉SIS组〉BAMG冻干保存组〉4SIS组〉BAMG液体保存组〉ACSM组〉PGA组.ACSM组在Young氏模量、最大载荷和抗拉强度上显著优于其他组（P〈0.01）.结论 异种ACSM支架具有良好的生物力学性质,较SIS、BAMG和PGA等支架更适用于尿道重建.     

以膀胱脱细胞基质为支架材料体内外构建组织工程化尿路上皮

目的:探讨利用组织工程技术体内外构建尿路上皮组织的方法.方法:制备新西兰兔膀胱脱细胞基质材料(bladder acellular matrix graft,BAMG),通过Masson染色和扫描电镜观察材料结构特点.酶消化法获取兔膀胱上皮细胞,体外培养扩增,倒置相差显微镜下观察细胞生长状况,并以免疫组织化学方法进行细胞鉴定.将膀胱上皮细胞与BAMG体外复合培养,HE染色和扫描电镜观察细胞在材料表面的生长状况.将体外培养的细胞-材料复合物植入裸鼠体内,分别在4周和8周取材,进行大体观察、组织学以及免疫组织化学方法检测.结果:制备的BAMG呈白色半透明薄膜状,扫描电镜下为纤维网状结构,无细胞残留.体外培养的膀胱上皮细胞呈"铺路石"样外观,抗细胞角蛋白AE1/AE3免疫组化染色胞浆呈棕黄色阳性反应.膀胱上皮细胞接种到BAMG 7 d后,细胞铺满材料的表面,呈单层细胞结构.裸鼠体内植入4周和8周后,细胞-材料复合物形成多层细胞结构,抗细胞角蛋白免疫组化染色呈阳性.结论:采用组织工程技术能够在体内外初步构建尿路上皮组织,这可为进一步进行组织工程泌尿道修复及重建奠定基础.     

软骨细胞与异体软骨微粒脱细胞基质体外相容性的研究

目的探索以异体软骨微粒脱细胞基质为支架构建组织工程化软骨。方法多步骤酶法将绵羊关节软骨制成微粒脱细胞基质,行大体、光镜(苏木素伊红、胶原、甲苯胺蓝染色)、扫描电镜观察,同时测定微粒的胶原、氨基葡聚糖、DNA含量。异体绵羊关节软骨细胞分离、体外扩增,并与软骨微粒脱细胞基质混合体外培养0～35d,倒置显微镜及扫描、透射电镜观察,同时测定羟脯氨酸,氨基葡聚糖,DNA含量及细胞黏附率。结果软骨微粒脱细胞基质只含有基质成分,直径0.100～0.154mm,胶原,氨基葡聚糖及DNA含量分别为204.4±3.1μg/mg,18.3±2.0μg/mg和0.042±0.013μg/mg。异体软骨细胞紧紧围绕于异体软骨微粒脱细胞基质四周,二者形成的复合物中胶原、氨基葡聚糖及DNA含量于第7d与0d相比具有统计学意义(P<0.05),分别与14d(胶原、DNA)和21d(氨基葡聚糖)达高峰,随后维持在高水平。细胞黏附率为92%。结论软骨细胞与异体软骨微粒脱细胞基质有良好的生物相容性,为组织工程方法再造软骨提供又一支架材料。     

间充质源性软骨种子细胞与脱细胞软骨复合培养构建软骨组织

目的兔外周血间充质源性软骨种子细胞与同种异体脱细胞软骨体外复合培养,构建新型软骨组织,为临床修复器官缺损及再造提供实验基础。方法提取兔外周血间充质干细胞,行体外诱导培养14 d获得软骨种子细胞,显微镜下观察细胞生长特性,制作细胞爬片行甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色。联合去垢剂—酶法获得兔脱细胞肋软骨支架,软骨种子细胞与同种异体脱细胞软骨支架体外复合培养7 d获得复合软骨,脱细胞软骨及复合软骨固定后行扫描电镜观察及组织学HE、甲苯胺蓝染色。结果兔外周血间充质干细胞体外诱导培养14 d,胞浆内较多软骨细胞特异性Ⅱ型胶原分泌;兔脱细胞软骨呈乳白色,结构完整、孔隙均匀,仍保存大量酸性黏多糖及胶原成分,其孔隙率(61.31±8.45)%,孔径长度(32.80±5.15)μm。支架与软骨细胞黏附良好,并伴有多量基质分泌。结论间充质源性软骨种子细胞与同种异体脱细胞软骨体外复合培养可构建新型软骨组织,本研究为临床修复器官缺损及再造提供了实验依据。     

两种羊膜脱细胞基质制备方法的比较

目的:探究制备羊膜脱细胞基质的方法.方法:取新鲜羊膜标本,分别采用TritonX-100(Triton组)预处理(恒温36 h)和甘油预处理(4℃,24 h×3次),再经胰蛋白酶、EDTA酶消化(分别用时4 h和10 h),制备羊膜脱细胞基质.经HE染色和扫描电镜观察2组羊膜脱细胞基质残留细胞数和组织结构,并观察接种的第3代人脐带间质干细胞在2种羊膜脱细胞基质上的黏附、生长状况.结果:上述2种方法制备的羊膜脱细胞基质均为白色、半透明膜状物,无细胞及其他组织残留.Triton组羊膜脱细胞基质结构均匀平整,操作时间短.甘油组样本表面凹凸不平,看不到细胞形态.脐带间质干细胞在2种羊膜脱细胞基质表面黏附、增殖状况均良好,Triton组细胞增殖状况总体优于甘油组(P<0.05).结论:TritonX-100预处理并酶消化法是制备羊膜脱细胞基质较好的方法.     

CPPf/PLLA支架负载人半月板纤维软骨细胞的体外实验研究

目的探讨聚磷酸钙纤维／左旋聚乳酸（CPPf／PLLA）支架负载人半月板纤维软骨细胞的有效性和可行性。方法将人半月板纤维软骨细胞接种CPPf／PLIA支架并在体外培养,应用倒置相差显微镜和扫描电镜观察纤维软骨细胞的粘附、生长和增殖情况,培养14d,行HE、TB（甲苯胺蓝）及Ⅰ型胶原免疫组化染色观察纤维软骨组织形成情况。结果纤维软骨细胞在支架上粘附、生长和增殖良好,体外培养14d能形成较成熟的纤维软骨组织。结论CPPf／PLLA支架具有良好的细胞相容性,可作为负载人纤维软骨细胞的载体。     

灌注法制备大鼠全肾脏脱细胞基质的研究

目的 探讨灌注法制备大鼠全肾脏脱细胞基质(ACM)支架的可行性.方法 取12周龄的Wistar大鼠的肾脏,保留输尿管、肾静脉及肾动脉,沿肾动脉插入留置针建立灌注通道.灌注压强为100 cmH2O,依次灌注肝素化PBS溶液,1%十二烷基磺酸钠(SDS)溶液,去离子水,1%TdtonX-100溶液以及含青链霉素的PBS溶液.经脱细胞处理后,采用HE染色法光镜观察及扫描电镜观察支架微观结构,DAPI染色法荧光显微镜观察残留细胞核成分.结果 所有经SDS及TritonX-100联合处理后的脱细胞基质支架在HE染色光镜观察下未发现细胞残留,扫描电镜观察仪见基膜及胶原蛋白等细胞外基质形成网状结构而无细胞,DAPI染色荧光显微镜观察未见DAPI与细胞核结合后所发出的强荧光.结论 灌注法用于制备大鼠全肾脏脱细胞基质支架,简便可靠,该支架无细胞成分残留,是一种理想的细胞支架.     

具有良好细胞相容性的脱细胞血管支架的制备

目的制备具有良好细胞相容性的脱细胞血管支架材料，为构建组织工程血管奠定基础。方法用含有脱氧胆酸钠、SDS、EDTA的低渗液和等渗液以及核酸酶对猪的胸主动脉进行脱细胞处理．使用HE、Movat五色法、DAPI染色及电镜观察处理结果。以MTT法分析脱细胞溶液的细胞毒性，通过种植内皮和平滑肌细胞，分析支架的细胞相容性。结果上述方法使用的脱细胞溶液细胞毒性低；经该法处理后，血管的细胞成分完全去除，胶原纤维、弹性纤维、糖蛋白等主要基质成分充分保留，组织结构完整，内皮细胞和平滑肌细胞可以在上面黏附生长，形成完整的细胞层。结论利用脱氧胆酸钠、SDS、EDTA和核酸酶联合消化的方法．可制备出基质成分充分保留、细胞相容性优良的脱细胞血管支架．适于构建组织工程血管。     

体外家兔骺板软骨细胞和复合支架材料构建人工骺板软骨

目的：探讨采用复合支架材料构建人工骺板软骨的可行性。方法:分离获得骺板软骨细胞,加入0.3% Ⅰ型胶原酸性溶液、1 000 U·mL^-1凝血酶溶液及20 g·L^-1人血冻干纤维蛋白原混匀,成为胶冻样软骨组织培养物。定期取培养块固定,常规石蜡切片,行HE染色、甲苯胺蓝染色及免疫组化检查。结果：新制成的以胶原-纤维蛋白混合凝胶为支架材料的软骨细胞培养物呈浅粉红色胶冻样 ,细胞均匀分布于其中。培养3 d后悬浮物呈乳白色,透光度降低。逐渐缩小至直径约7 mm大小,硬度逐渐增加。HE染色见软骨细胞位于软骨陷窝内,软骨细胞培养物有一定层次感,但没有象骺板样排列成柱状。甲苯胺蓝染色显示胞体周围有丰富的软骨基质。免疫组织化学染色可见Ⅱ型胶原阳性细胞。结论：利用混合支架构建的人工骺板软骨在大小及可塑性等方面结果较满意。     

用等电聚焦免疫印迹法测精液(斑)、阴道液以及混合斑中T_f的亚型

作者用等电聚焦免疫印迹法（ＩＥＦＩＢ）对人类精液（斑）、阴道液及混合斑中转铁蛋白（Ｔｆ）亚型进行了检测，结果发现８份精液和室温下保存３２周的精斑与同一个体血清的Ｔｆ亚型相同，用ＩＥＦＩＢ法未测出阴道液及含少量精液的混合斑中Ｔｆ的亚型。结果提示：Ｔｆ在精斑中稳定，ＩＥＦＩＢ法可检测强奸案的精斑和含精液较多的混合斑中Ｔｆ的亚型。     

组织工程化人口腔黏膜的构建

目的:用组织工程方法培养人全层口腔黏膜.方法:婴儿唇裂多余口腔黏膜组织为取材对象,分离成纤维细胞与上皮细胞,分别接种在聚乳酸羟基乙酸(PLGA)膜上培养,后将其移至气液面进行复合.HE染色、免疫组化AE1/AE3及Vimentin染色,光镜、倒置相差显微镜、扫描电镜观察其形态结构.结果:口腔黏膜具备上皮层和上皮下纤维组织,上皮细胞3～7层,见桥粒连接,AE1/AE3阳性;同有层细胞核形Vimentin( ).结论:成功培养全层人口腔黏膜,PLGA可作为口腔黏膜组织工程支架材料.     

bFGF基因转染的牙龈成纤维细胞与脱细胞真皮基质复合物的体外构建

目的研究碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）基因修饰的牙龈成纤维细胞（GFs）与组织工程支架材料脱细胞真皮基质（ADM）复合后的生长、结合情况,为基因治疗与组织工程联合应用于牙周组织缺损再生治疗提供依据。方法将转染bFGF的GFs接种于ADM真皮面,通过荧光显微镜、激光共聚焦扫描显微镜、透射电镜及组织学检查,观察细胞的生长状况及其与支架材料的复合情况。结果基因修饰的牙龈成纤维细胞复合ADM膜后生长良好,24 h细胞已贴附、伸展。透射电镜可见细胞在支架材料中生长,并与支架材料结合紧密。结论转染bFGF基因的的GFs与ADM膜复合物有望应用于牙周组织工程。     

3D打印明胶海藻酸钠凝胶支架对人牙髓细胞的黏附增殖作用

目的 探讨3D打印的明胶海藻酸钠凝胶支架对人牙髓细胞(HDPCs)的细胞毒性,及不同接种方法对细胞黏附生长的差异.方法 组织块酶消化法分离培养HDPCs,利用Bioplotter三维生物打印机进行明胶海藻酸钠凝胶支架的3D打印,选取第3代HDPCs,Cell Counting Kit-8试剂检测不同浓度材料浸提液对细胞增殖的影响,扫描电镜观察、台盼蓝染色计数比较直接滴加低浓度细胞悬液与高浓度细胞浓缩液接种法,对细胞在材料表面黏附与增殖作用的差异.结果 不同浓度的材料浸提液均对HDPCs细胞毒性为0,具有促进细胞增殖的作用.HDPCs在3D打印的明胶海藻酸钠凝胶支架上生长良好,先滴加高浓度的细胞浓缩液可以更有效的促进细胞对材料的黏附,5d后材料表面的细胞计数结果较滴加低浓度细胞悬液显著增加,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 3D打印的明胶海藻酸钠凝胶支架具有良好的生物相容性,具有促进HDPCs增殖的作用,可作为牙再生的支架材料,选择高浓度细胞浓缩液接种细胞更有利于细胞黏附.     

聚乙交酯-聚丙交酯降解支架复合胎儿脐动脉细胞构建组织工程血管

目的：探讨改良聚乙交酯-聚丙交酯（PLGA）降解支架复合胎儿脐动脉细胞方法构建组织工程血管（TEBV）的可行性。方法：将胎儿脐动脉的平滑肌细胞,内皮细胞种植于国产PLGA血管上并进行培育,观察两种细胞生长情况、检测内皮细胞、平滑肌细胞并测定其功能。结果：培育2mo后,平滑肌细胞,内皮细胞在PLGA血管片上黏附良好,材料组织相容性好。结论：应用PLGA降解支架复合胎儿脐动脉细胞构建组织工程血管的体外培养方法是可行的,PLGA支架有利于细胞生长、分化及功能发挥,动态培养方法培养出的TEBV色泽光亮,厚度均匀,具有良好的弹性。     

可注射C/GP支架的组织相容性及与BMCs的细胞相容性观察

目的观察温固化可注射性壳聚糖/甘油磷酸钠（C/GP）凝胶的组织与细胞相容性,评估其作为组织工程支架的可行性。方法将7∶1体积比的壳聚糖和甘油磷酸钠溶液混合,注入成年兔的背部皮下、皮内和腹腔,从大体和组织学观察其局部炎症、皮肤刺激及全身中毒反应。以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）标记的骨髓间充质干细胞（BMCs）为示踪细胞,复合C/GP凝胶行体外培养,注入兔的背部皮下或预制关节缺损的关节腔内,术后一定时间制作冰冻切片,荧光显微镜下观察,图像分析细胞存活及修复关节缺损效果。结果C/GP具有良好的组织相容性和生物安全性,与EGFP-BMCs以一定细胞浓度混悬,体外及皮下培养数周均可见荧光标记的细胞,支架与细胞复合物完全充填关节缺损,细胞荧光标记阳性,细胞参与修复。结论可注射性C/GP支架具有良好的组织相容性,细胞在支架内存活良好。     

Repairing cartilage defects using chondrocyte and osteoblast composites developed using a bioreactor

Background  Articular cartilage injury is a common disease, and the incidence of articular wear, degeneration, trauma and sports injury is increasing, which often lead to disability and reduced quality of life. Unfortunately repair of articular cartilage defects do not always provide satisfactory outcomes.

Methods  Chondrocyte and osteoblast composites were co-cultured using a bioreactor. The cartilage defects were treated with cell-β-tricalcium phosphate (β-TCP) composites implanted into osteochondral defects in dogs, in vivo, using mosaicplasty, by placing chondrocyte-β-TCP scaffold composites on top of the defect and osteoblast-β-TCP scaffold composites below the defect.

Results  Electron microscopy revealed that the induced chondrocytes and osteoblast showed fine adhesive progression and proliferation in the β-TCP scaffold. The repaired tissues in the experimental group maintained their thickness to the full depth of the original defects, as compared with the negative control group (q=12.3370, P <0.01; q=31.5393, P <0.01).

Conclusions  Perfusion culture provided sustained nutrient supply and gas exchange into the center of the large scaffold. This perfusion bioreactor enables the chondrocytes and osteoblasts to survive and proliferate in a three-dimensional scaffold.

     

磁性纳米纤维复合材料原位诱导体内成骨的研究

目的:研究一种新型顺磁性的纳米纤维复合支架γ-Fe2O3/nHAP/PDLLA在弱磁场下体内诱导新骨形成的功效.方法:纳米纤维复合材料支架通过电纺丝方法制成,支架内部的微观结构用扫描电镜(SEM)进行表征.将支架植入兔横突根部骨缺损处并在12周后处死动物,应用组织学方法研究支架在动物体内原位诱导新骨形成和胶原蛋白沉积的...