麻疹病毒血凝素蛋白抗原表位的预测与分析

目的 探讨麻疹病毒(MeV)流行株血凝素蛋白(H)抗原表位上氨基酸(aa)变异对病毒抗原性的可能影响。方法 利用生物信息学软件预测MeV H蛋白上B细胞线性表位,设计并合成来源于疫苗株和流行株表位以及同一区域非表位上的多肽对。间接ELISA法检测合成多肽的免疫原性,并制备多肽免疫血清。采用交叉ELISA法分析两条多肽间的抗原性差异,计算抗原比。结果 合成的多肽均能与MeV免疫血清结合,其中设计在表位区的多肽对CW23/CW22(273～282 aa)结合能力最强,而非表位区多肽对CW150/CW151(418～427 aa)结合能力最弱。多肽对中来源不同两条多肽间抗原性差异较大,其中CW23(疫苗株来源)与CW22(流行株来源)间抗原比为16,CW123(疫苗株来源)与CW124(流行株来源)(236～246 aa)间的抗原比为2.877±0.583。非表位多肽对中,CW125与CW126(356～364 aa)间抗原比为1.631±0.481,而CW150与CW151间抗原比为10.367±1.617。结论 麻疹流行株上仍存在保守的抗原表位,但预测的抗原表位及非表位区上的部分aa变异导致疫苗株与流行株间抗原性存在差异。     

H5N1禽流感病毒血凝素抗原快速诊断试剂的改进与初步评价

H5N1病毒高度变异,为确保本中心研制的H5N1禽流感病毒抗原快速诊断试剂对不同变异分支的H5N1病毒,特别是实时流行株的高度检测准确性,本研究根据抗原活性变异情况对中心开发的第一代H5抗原快速诊断试剂进行了改进。改进后的第二代H5抗原快速诊断试剂(H5-Dot-2nd)对25株代表亚洲地区流行的不同进化分支的H5N1禽流感病毒检测均为阳性,其中12株检测下限达到0.01HA;而对20株32HA滴度的非H5亚型流感病毒株检测均为阴性;不同机构的评价结果显示,H5-Dot-2nd的灵敏度比国外同类试剂高出10～1000倍,对非H5现场标本特异性达到99.0%(399/403)。上述结果提示,H5-Dot-2nd对历年来特别是当前流行株均具有很好的检测灵敏度,能更好地满足流感疫情监控的需要。     

禽流感病毒H5N1血凝素蛋白的重组牛痘病毒表达

目的研究H5 I151F和H5 I151F＋A134V＋E186D两种氨基酸变异对血凝素蛋白（HA）亲人受体结合的影响,并获得该HA。方法构建载体pRB21’,共感染／转染vp37^-牛痘病毒vRB12和pRB21’,基因同源重组牛痘病毒表达HA,Western免疫印迹法鉴定。结果获得了克隆有H5HA全长基因片段的载体pRB21’,构建了2种重组牛痘病毒re-VV H5 I151F和re-VV H5 I151F＋A134V＋E186D,且能在被感染细胞膜表达这两种HA。结论首次通过构建重组牛痘病毒成功表达了禽流感病毒H5N1的H5HA,为进一步研究禽流感病毒人传人的可能性奠定了基础。     

H7N9禽流感病毒重组质粒构建及应用

目的构建一种含H7N9禽流感病毒全长血凝素/神经氨酸酶/基质蛋白（HA/NA/M）基因的重组质粒,为核酸检测方法提供一种通用的阳性定量标准品。方法设计H7N9禽流感病毒HA、NA及M抗原基因全长开放阅读框的克隆引物,提取H7N9禽流感病毒总RNA后用实时荧光定量PCR获得相应片段,用3次酶切连接方法,依次插入到pGEM-T easy质粒,进行测序确认;线性化后的重组质粒用T7 RNA聚合酶进行体外转录,RNA转录产物纯化后测定浓度,用实时荧光定量PCR构建标准曲线进行验证。结果HA、NA和M基因扩增片段大小分别约为1.7、1.3、1.1 kb,与预期相符;构建的重组质粒pGEM-HA-NA-M插入片段的测序结果与GenBank 公布序列一致;由重组质粒体外转录获得同时含有H7N9禽流感病毒HA、NA、M全长开放阅读框序列的RNA片段质量浓度为399.5 ng/μL,梯度稀释后用3种实时荧光定量PCR方法均获得了良好的标准曲线。结论成功构建重组质粒pGEM-HA-NA-M,由此质粒体外转录获得的RNA片段可作为H7N9禽流感病毒核酸快速检测方法通用的阳性定量标准品。     

泛太平洋西岸地区部分H5N1亚型禽流感病毒毒株血凝素基因特性的研究

目的了解泛太平洋西岸各个国家H5N1亚型人禽流感病毒血凝素(HA)基因分子特征,寻求HA基因变异规律。方法从Genebank中下载泛太平洋西岸国家或地区(包括泰国、越南、香港、印度尼西亚、中国大陆、蒙古、俄罗斯)50株H5N1亚型高致病性流感病毒(HAPI)毒株血凝素基因序列,利用生物信息学软件DNASTAR5.0进行核酸同源性分析,用MEGA3.1进行核酸和氨基酸序列比对和进化树分析。结果50株高致病性H5N1亚型流感病毒毒株可以分成3个相对独立的进化簇。第1簇为泰国越南簇;第2簇为中国印尼北亚簇(包含中国、印度尼西亚、蒙古以及俄罗斯);第3簇主要为1996~2001年期间分离的毒株,该簇毒株HA基因与Gs/Gdlike毒株核酸同源性更为接近,其基因亚型更多表现为Gs/Gdlike或其他基因亚型。HA基因分子特征分析表明在HA蛋白抗原性上,泰国越南分离株表现基本一致,而其他地域分离株存在表现各异,但也存在地域的一致性。结论泛太平洋西岸地区分离的H5N1亚型禽流感病毒血凝素蛋白在分子特征上表现出一定的地域特异性,在一定地域范围内保持一致性。     

华东地区高致病性H5N6禽流感病毒血凝素蛋白分子特征分析

目的分析2017年以来中国华东地区高致病性H5N6禽流感病毒的HA基因分子特征。方法 H5N6核酸阳性标本采用9～11日龄鸡胚进行病毒分离,病毒基因测序采用下一代测序技术,相关的参考序列下载自GISAID或NCBI网站,序列比对和进化树构建采用ClustalX、Blasts及Mega 6.1等生物信息学软件。结果 2017年以来,在江苏省活禽市场和禽流感患者的标本中,成功分离出43株H5N6禽流感病毒,对33株病毒进行了基因组测序。选择其中的27株H5N6病毒的HA基因进行分子进化分析,clade 2.3.4.4h有20株,clade 2.3.4.4e有3株,另外4株归类于clade 2.3.4.4b;多个碱性氨基酸出现在病毒HA蛋白的裂解位点,是高致病性禽流感病毒的典型分子特征;HA蛋白受体结合位点的222和224位氨基酸分别是Q和G,具有结合禽类受体α2-3半乳糖苷唾液酸(SAα2-3Gal)的特性,158位点糖基化位点丢失,但新的糖基化位点出现在124位点上。结论 2017年HA基因clade 2.3.4.4h是我国华东地区H5N6病毒优势基因型,病毒处于持续动态进化中,需要继续对病毒进化进行监测。     

我国H7N9禽流感病毒血凝素和神经氨酸酶基因的分子进化分析

  目的  通过对安徽省安庆市人感染H7N9禽流感外环境标本检测,分析外环境中病毒污染情况,研究判断人感染H7N9的风险,为制定防控措施提供依据。  方法  于2017年1月5日 — 2月22日,采用完全随机抽样的方法,采集安庆市38家农贸市场、4例确诊人感染H7N9禽流感病例居家禽类相关标本共324份,用实时荧光定量RT-PCR方法进行甲型流感病毒通用核酸检测,对阳性标本进一步进行H7N9检测。  结果  安庆市H7N9禽流感病毒阳性率28.40 %,11个县（市、区）中有10个检出H7N9病毒阳性,阳性率90.90 % （10/11）。主城区阳性率37.68 %（26/69）高于非主城区,差异有统计学意义（χ² = 9.23,P < 0.05）;鸡、鸭、鸽子标本中,鸡标本阳性率最高31.75 %（80/252）,差异有统计学意义（χ² = 6.57,P < 0.05）;农贸市场来源的标本阳性率为29.77 %（92/309）,病例家来源的标本阳性率为0,差异有统计学意义（χ² = 6.24,P < 0.05）;不同类型标本中,咽拭子和肛拭子阳性率最高,分别为42.86 %（9/21）和40.00 %（2/5）,其次为饮水和污水;发生人感染病例前外环境标本阳性率38.71 %（12/31）高于发生后,但2者间的差异无统计学意义（χ² = 1.79,P > 0.05）。  结论  安庆市农贸市场存在H7N9禽流感病毒污染。     

H5N1禽流感病毒血凝素和神经氨酸酶基因在杆状病毒中的共表达

目的构建共表达H5N1禽流感病毒血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)蛋白的杆状病毒表达系统。方法利用PCR方法分别扩增A/Hubei/1/2010(H5N1)病毒的HA和NA基因,克隆至经改造带有对虾白斑综合病毒(WSSV)早期启动子iel的mpFastBac Dual载体,构建mpFast Bac-HA-NA表达质粒,转化DH10Bac感受态细胞,用获得的Bacmid-HA-NA穿梭质粒转染sf9细胞,获得重组杆状病毒Bac-HA-NA;提取重组杆状病毒Bac-HA-NA的DNA并使用PCR方法检测;利用Western blot检测HA和NA表达,并分别检测重组杆状病毒Bac-HA-NA红细胞凝集能力和神经氨酸酶活性。结果经PCR鉴定,构建的质粒Bacmid-HA-NA正确;Western blot检测表明Bacmid-HANA能在sf9细胞中有效表达HA和NA蛋白,生物活性检测表明Bac-HA-NA能引起红细胞凝集并具有神经氨酸酶活性。结论获得了能同时表达禽流感病毒HA和NA的重组杆状病毒Bac-HA-NA,为进一步研究流感疫苗奠定了基础。     

H7N9禽流感病毒的食品安全预防措施

一、病毒特征 甲型流感的H7病毒通常是一组在鸟类中传播的流感病毒。甲型流感病毒（H7N9）属于H7病毒大类下的一个亚群。虽然偶尔会有某些H7病毒（H7N2、H7N3、H7N7）感染人类的报告,但过去没有人类感染H7N9病毒的报告,直到最近报告出现了人类感染病例。     

贵州省2014-2017年H7N9禽流感病毒HA和NA基因特征分析

目的 分析2014－2017年贵州省H7N9禽流感病毒HA和NA基因的分子特征和感染风险。方法 对2014－2017年贵州省获取的18例确诊人感染H7N9病例和6份环境样本分离的H7N9病毒株的HA和NA基因进行扩增,运用生物信息学软件解析其变异和遗传进化。结果 2014－2015年贵州省2株毒株与WHO推荐的A/Shanghai/2/2013和A/Anhui/1/2013疫苗株HA和NA基因的同源性最高,分别为98.8%～99.2%和99.2%;2016年2株和2017年14株与A/Hunan/02650/2016疫苗株同源性最高,分别为98.2%～99.3%和97.6%～98.8%;2017年其余6株与A/Guangdong/17SF003/2016疫苗株同源性最高,为99.1%～99.4%和98.9%～99.3%。所有毒株均属于长江三角洲分支,但主要聚集为3个次分支。2017年贵州省西部有6株毒株（含2例人感染病例毒株）裂解位点存在插入突变为PEVPKRKRTAR↓GLF,具备高致病性禽流感病毒的分子特征;受体结合关键位点存在A134V、G186V和Q226L突变,NA蛋白颈区“QISNT”均缺失,毒株A/Guizhou-Danzhai/18980/2017发生耐药突变R294K,9株毒株NA蛋白糖基化位点发生NCS42NCT突变。结论 2014－2017年贵州省H7N9禽流感病毒HA和NA基因存在遗传差异,关键位点的变异增强了病毒对人体的易感性和毒力,部分毒株发生耐药突变,其感染与致病风险增加。     

禽流感病毒研究进展及抗H7N9型病毒疫苗与抗体研究

禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）是一种可引起急性呼吸道传染病的人畜共患病毒。自2013年我国出现了全球首例人感染H7N9型AIV病例以来,人们对该病毒产生了担忧与恐慌。AIV在全球广泛传播,人感染不同型别AIV事件也持续发生,造成了巨大的经济损失。目前尚无针对该病的特异性治疗措施与药物,...     

广西禽流感H5N1亚型病毒HA基因序列分析

目的了解广西禽流感H5N1亚型病毒的基因特性.方法2011年在广西农贸市场采集污水、笼具涂抹、粪便标本,经H5亚型特异实时荧光定量PCR方法(Real-time fluorescence quantitative RT-PCR)检测,阳性样本进行病毒血凝素(hemagglutinin,HA)基因扩增后对产物直接测序,测序结果与已知参考毒株进行序列比对及系统进化分析.结果对阳性样本病毒HA基因测序获得6份HA序列,均分布在进化分支2.3.2的Ⅱ-1分支下.广西的6序列无论是氨基酸还是核苷酸的都是高度同源的,其核苷酸同源性在99.5%~100%,氨基酸同源性在99.5%~99.8%;序列测定的结果同时表明无论是受体特异性还是连接肽都是禽源的.结论2011年广西农贸市场流行的禽流感H5N1亚型病毒主要以进化分支2.3.2Ⅱ-1为主,均为禽源性的病毒.     

H7N3 live attenuated influenza vaccine has a potential to protect against new H7N9 avian influenza virus

After recent emergence of new avian influenza A(H7N9) viruses in humans many people and Governments are asking about H7 influenza vaccine which could provide cross-protection against new viruses, until H7N9 vaccine is prepared from a relevant strain. Here we scientifically justify that available H7N3 live attenuated influenza vaccine (LAIV) can be protective against H7N9 viruses due to the presence of conserved immune epitopes in its hemagglutinin. We used Immune Epitope Database analysis resource to predict B-cell and CTL epitopes distributed across H7N3 HA molecule and assessed their identity with new H7N9 viruses at near 70% and 60% of the epitopes, respectively. In addition, we tested serum samples of volunteers participated in phase I clinical trial of H7N3 LAIV for the presence of anti-H7N9 hemagglutination-inhibition and neutralizing antibodies and found seroconversions in 44.8% of vaccinated persons, which suggests the potential of H7N3 LAIV to protect against new H7N9 avian influenza viruses.     

2016年6月至2017年4月辽宁省人感染H7N9禽流感病毒HA和NA基因特征分析

目的 本文对2016-2017年辽宁省人感染H7N9禽流感病毒血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因遗传进化特征分析。方法 使用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)对选取的4株H7N9禽流感病毒株HA和NA基因进行扩增并测序,用生物信息学软件分析其基因进化变异特征。结果 2016年6月至2017年4月辽宁省4株毒株的HA和NA基因与WHO最新推荐的A/Hunan/02650/2016疫苗株的同源性最高,其HA基因的核苷酸和蛋白氨基酸序列同源性分别为99.3%~99.6%,99.8%~100%;NA基因的核苷酸和蛋白氨基酸序列同源性分别为97.7%~99.7%;98.3%~99.6%。本省所有毒株均属长江三角洲谱系,但主要聚集在两个次分支。4株病毒HA蛋白裂解位点333-342氨基酸序列均为PEIPKGR↓GLF,在338-339位点无连续的多个氨基酸插入(KRTA),属于低致病性禽流感病毒分子特征。HA受体结合位点均出现S138A、G186V、Q226L、T221P氨基酸的突变,NA茎部区均出现“QISNT”缺失,且NA蛋白上相关耐药位点上的氨基酸并未发生突变,3株毒株NA蛋白上糖基化位点第42位发生氨基酸序列NCSH→NCTH突变。结论 2016-2017年辽宁省人感染H7N9禽流感病毒HA和NA基因关键位点氨基酸发生突变,使病毒具有双受体结合特性以及毒力增强。     

安徽省2013-2018年活禽市场H9N2亚型禽流感病毒血凝素基因遗传特征

目的  分析2013年-2018年安徽省外环境中H9N2亚型禽流感病毒(avian influenza virus, AIVs)血凝素(hemagglutinin, HA)基因变异特征。 方法  将所有安徽省禽流感外环境监测点搜集的H9N2亚型核酸阳性样本接种鸡胚分离病毒,病毒RNA逆转录为cDNA后用特异性引物进行扩增,聚合酶链式反应产物通过基因测序后获得HA基因序列,应用分子生物学软件进行分析;使用DATAMONKEY在线服务器进行基因选择压力分析,并使用SWISS-MODLE软件构建分子突变三维构象。 结果  获得33株H9N2 AIVs属于h9.4.2.5进化分支,受体结合位点183、226和227位置分别突变为N、L和M,189和190位置存在多样性;2015年以后分离的毒株均携带6个糖基化位点;选择压力分析得出160位置承受较大的正向选择压力,至少呈现7种空间构象。 结论  安徽省外环境中存在的H9N2亚型AIVs具有感染哺乳动物的分子特征并具备抗原漂移能力,需密切关注该病毒的分子变异特征。     

Generation of a reassortant avian influenza virus H5N2 vaccine strain capable of protecting chickens against infection with Egyptian H5N1 and H9N2 viruses

BackgroundAvian influenza H5N1 viruses have been enzootic in Egyptian poultry since 2006. Avian influenza H9N2 viruses which have been circulating in Egyptian poultry since 2011 showed high replication rates in embryonated chicken eggs and mammalian cells.MethodsTo investigate which gene segment was responsible for increasing replication, we constructed reassortant influenza viruses using the low pathogenic H1N1 PR8 virus as backbone and included individual genes from A/chicken/Egypt/S4456B/2011(H9N2) virus. Then, we invested this finding to improve a PR8-derived H5N1 influenza vaccine strain by incorporation of the NA segment of H9N2 virus instead of the NA of H5N1. The growth properties of this virus and several other forms of reassortant H5 viruses were compared. Finally, we tested the efficacy of this reassortant vaccine strain in chickens.ResultsWe observed an increase in replication for a reassortant virus expressing the neuraminidase gene (N2) of H9N2 virus relative to that of either parental viruses or reassortant PR8 viruses expressing other genes. Then, we generated an H5N2 vaccine strain based on the H5 from an Egyptian H5N1 virus and the N2 from an Egyptian H9N2 virus on a PR8 backbone. This strain had better replication rates than an H5N2 reassortant strain on an H9N2 backbone and an H5N1 reassortant on a PR8 backbone. This virus was then used to develop a killed, oil-emulsion vaccine and tested for efficacy against H5N1 and H9N2 viruses in chickens. Results showed that this vaccine was immunogenic and reduced mortality and shedding.DiscussionOur findings suggest that an inactivated PR8-derived H5N2 influenza vaccine is efficacious in poultry against H5N1 and H9N2 viruses and the vaccine seed replicates at a high rate thus improving vaccine production.     

云南省边境地区禽流感H5N1亚型病毒遗传多样性分析

目的 了解云南省边境地区禽流感H5N1亚型病毒遗传多样性.方法 2009-2011年7月在云南省边境地区采集境外家禽和野生鸟类棉拭子样品,经H5/Nl亚型特异性多重RT-PCR检测,阳性样品进行病毒HA基因扩增,克隆至pMD 18-T载体测序,并与已知参考毒株进行序列比对及系统发育分析.结果 36份阳性样品病毒HA基因测序获得15种HA序列,存在2个不同进化分支(2.3.2、2.3.4),2.3.2进一步可划分为3个进化小分支(Ⅱ-1～Ⅱ-3),2.3.4进一步可划分为2个进化小分支(Ⅰ-1和Ⅰ-2).2.3.2Ⅱ-1、Ⅱ-2毒株是新出现的H5N1亚型病毒变异株.结论 2009- 2011年7月云南省边境地区H5N1亚型病毒具有遗传多样性,病毒经历了多分支(2.3.2、2.3.4)至单一支(2.3.2)的进化过程.     

浙江省人感染H7N9禽流感病毒的基因组序列分析

目的分析浙江省2013年4月初一例人感染甲型H7N9禽流感患者的病原学和基因组序列特征.方法提取患者标本的病毒RNA并用荧光定量RT-PCR方法检测,一步法RT-PCR扩增H7N9禽流感病毒基因组的8个片段,测序并拼接出基因组序列.下载目前已经公布的H7N9禽流感病毒和其他H7、N9亚型的病毒的HA和NA序列,采用Mega 5.1软件对其进行序列比对并构建进化树.根据测序的结果分析该例H7N9禽流感病毒的序列变异情况.结果该患者标本甲型流感、H7亚型和N9亚型均为阳性,通过扩增基因组各片段并进行测序.对血凝素和神经氨酸酶基因进行比对和进化树构建,结果显示该H7N9病毒HA基因与A/duck/Zhejiang/12/2011(H7N3)的亲缘关系最近,NA基因与A/wild bird/Korea/A14/2011 (H7N9)的亲缘关系最近.编码内部蛋白的6个基因均与中国大陆近两年的H9N2毒株最为相似.该标本的病毒HA蛋白发生了Q226L突变,而与已经公布的人感染H7N9禽流感毒株均不一致的是PB2未发生E627K突变.结论从该份临床标本完成了检测和基因组各片段的扩增与测序.该病毒与已报道的人感染H7N9禽流感病毒同源性高,存在Q226L等重要位点的突变,但PB2未发生E627K突变.