福尔马林固定石蜡包埋样本全基因组文库构建流程优化

目的优化建立适合本实验室针对人源福尔马林固定石蜡包埋(Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded, FFPE)样本的全基因组(Genomic DNA, gDNA)文库构建方案。 方法探讨并设计了在FFPE全基因组文库构建各环节优化条件,分析比较FFPE DNA文库片段大小及文库转化率,以选择最优的文库构建流程。 结果最终确定DNA起始量50 ng、20 min片段化酶切时间,采用4×稀释的接头进行20 min连接,经过2次特定比例的磁珠筛选方案进行文库构建,实现片段主峰在300 bp~400 bp左右,文库转化率达60%。 结论本操作流程针对FFPE样本可以保证高质量的文库构建,同时实现较高文库转化效率。     

实时荧光定量PCR比较分析miRNA在胃癌新鲜组织与石蜡包埋组织中的表达

目的研究miRNA在胃癌石蜡包埋组织和新鲜组织的表达。方法应用实时荧光定量PCR检测23例石蜡包埋胃癌组织及与其配对的新鲜冷冻胃癌组织的miR-30c表达,以U-6为内参对照。结果胃癌石蜡包埋组织中的miRNA可以成功扩增出来,胃癌石蜡包埋组织与胃癌新鲜组织中miR-30c表达呈平行性表达(配对t-检验P=0.81)。miR-30c在石蜡包埋组织中的表达量与临床病理因素的关联似乎更紧密。结论可以利用便利获得的存档石蜡组织进行miRNA相关指标表达研究。     

抗酸染色与PCR-荧光探针法在石蜡包埋组织结核分枝杆菌检测的比较

目的 比较抗酸染色与PCR-荧光探针法检测在福尔马林固定、石蜡包埋组织中结核分枝杆菌(Mycobaeterium tuberculosis,MTB)检测的应用.方法 收集西京医院2018年1月至2019年10月共543例疑似结核患者,所有组织标本均经10％中性福尔马林固定,常规石蜡包埋、切片,HE染色,行抗酸染色及PC...     

固定剂和固定时间对石蜡包埋组织RT-PCR检测病毒RNA的影响

目的 探讨固定剂及固定时间对石蜡包埋RNA病毒感染组织中RNA降解及标本病理形态学的影响。方法 取汉坦病毒76～118株接种的乳鼠感染组织，以沉淀脱水类固定剂100％甲醇、75％乙醇、100％，丙酮以及醛类固定剂4％的多聚甲醛磷酸缓冲液(PFA)、10％，福尔马林共5种固定剂，在室温下固定病毒感染组织6h、12h、24h和48h后，将各种方式固定后的病毒感染组织标本进行石蜡包埋，组织包埋块在室温下保存1年～1.5年，然后进行切片HE染色，镜下观察各种固定剂对组织病理形态学的影响。各种方式固定后石蜡包埋组织中以RT-PCR扩增出不同片段长度的病毒RNA及β-acfin RNA序列，以判断各种固定方式对病毒RNA和细胞总RNA降解的影响。每种固定方法对RNA的影响是通过获得产物最大长度或对长片段扩增的可重复性及假阴性结果的多少来反映。结果 病理切片结果显示，经10％福尔马林和4％PFA固定的石蜡切片，组织结构完整清晰，组织经其他三种沉淀脱水类固定剂固定后有不同程度收缩，但不影响组织病理形态学检测，其中甲醇固定的收缩程度最小。从固定后石蜡包埋组织中提取RNA进行RT-PCR扩增时，扩增的效果受固定剂类型和固定时间的影响，同时也受扩增的基因片段长度的影响。在可达到固定作用的前提下，同一固定剂固定时间越短，RT-PCR扩增结果越稳定；采用相同的固定时间从甲醇、乙醇及丙酮等沉淀类固定剂固定后石蜡包埋的病毒组织中扩增出病毒RNA的阳性结果比醛类剂高，可重复性好。尤其在进行长片段扩增时，在沉淀类固定剂固定的标本中出现假阴性现象比醛类固定剂固定的标本少。各种沉淀固定剂之间无明显区别。结论 从固定后石蜡包埋组织标本中用RT-PCR检测病毒RNA进行回顾性研究是可行的，但受固定剂类型及固定持续时间的影响。临床在对存档的石蜡包埋组织作回顾性研究，解释其PCR阴性结果时，有必要考虑其组织标本固定对RNA分子的影响这一因素。     

荧光PCR熔解曲线法检测结核分枝杆菌耐药性价值及耐药特征分析

目的 评价荧光PCR熔解曲线法(熔解曲线法)对结核分枝杆菌(MTB)耐药性检测价值。方法 采用熔解曲线法与传统液体药敏法同时检测156例临床分离培养MTB对抗结核药物利福平(RFP)、异烟肼(INH)、乙胺丁醇(EMB)、链霉素(SM)和氟喹诺酮类药物耐药情况,并对2种检测方案结果进行比较。结果 与液体药敏检测相比,熔解曲线法对5种抗结核药物耐药性检测结果差异无统计学意义(P> 0.05),以液体药敏检测为金标准,熔解曲线法检测RFP、INH、EMB、SM以及氟喹诺酮类药物耐药性的灵敏度分别为100.00%、75.86%、61.54%、75.00%、90.00%,特异度分别为97.10%、95.28%、99.30%、96.21%、100.00%,Kappa值分别为0.885、0.721、0.707、0.724、0.944,表明2种检测方法一致性好。结论 荧光PCR熔解曲线法对抗结核药物RFP、INH、EMB、SM及氟喹诺酮类的耐药性与液体药敏法检测效果一致,灵敏度、特异度均较高,具有较好的临床应用价值。     

固定剂和固定时间对石蜡包埋组织RT-PCR检测病毒RNA的影响

目的　探讨固定剂及固定时间对石蜡包埋RNA病毒感染组织中RNA降解及标本病理形态学的影响。方法　取汉坦病毒 76～ 118株接种的乳鼠感染组织 ,以沉淀脱水类固定剂 10 0 %甲醇、75 %乙醇、10 0 %丙酮以及醛类固定剂 4 %的多聚甲醛磷酸缓冲液 (PFA)、10 %福尔马林共 5种固定剂 ,在室温下固定病毒感染组织 6h、12h、2 4h和 4 8h后 ,将各种方式固定后的病毒感染组织标本进行石蜡包埋 ,组织包埋块在室温下保存 1年～ 1 5年 ,然后进行切片HE染色 ,镜下观察各种固定剂对组织病理形态学的影响。各种方式固定后石蜡包埋组织中以RT_PCR扩增出不同片段长度的病毒RNA及 β_actinRNA序列 ,以判断各种固定方式对病毒RNA和细胞总RNA降解的影响。每种固定方法对RNA的影响是通过获得产物最大长度或对长片段扩增的可重复性及假阴性结果的多少来反映。结果　病理切片结果显示 ,经 10 %福尔马林和 4 %PFA固定的石蜡切片 ,组织结构完整清晰 ,组织经其他三种沉淀脱水类固定剂固定后有不同程度收缩 ,但不影响组织病理形态学检测 ,其中甲醇固定的收缩程度最小。从固定后石蜡包埋组织中提取RNA进行RT_PCR扩增时 ,扩增的效果受固定剂类型和固定时间的影响 ,同时也受扩增的基因片段长度的影响。在可达到固定作用的前提下 ,同一固定     

石蜡包埋组织中甲基化特异性PCR全程的质量控制

近年来有关DNA甲基化与肿瘤发生的关系日益受到人们的重视,成为肿瘤分子生物学研究热点之一.而现在对DNA甲基化状态的检测方法不多,Herman等(1996年)在黍亚硫酸盐处理的基础上提出了甲基化特异性的PCR,(methyrlafion-specific PCR.MSP)是一个快速敏感的基因甲基化分析方法.它将DNA先用重亚硫酸盐处理,使未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶,而甲基化的不变.     

产毒真菌多重实时荧光PCR快速检测方法建立

目的建立一种能够在单体系中同时检测产黄曲霉毒素真菌及3种潜藏性产毒真菌的多重实时荧光PCR快速检测方法。方法分别根据产黄曲霉毒素真菌、赭曲霉、青霉和镰刀菌的蛋白活化基因aflR、ITS序列、β-微管蛋白编码区、LS rRNA,设计引物和探针,通过优化反应组分和反应条件,建立了可同时检测常见产毒真菌的实时荧光PCR方法,并对该方法的灵敏度和特异性进行了分析。结果优化建立的反应体系对产黄曲霉毒素真菌、赭曲霉、青霉和镰刀菌的检测限分别可达到3.37×10⁴、1.91×10⁴、1.53×10⁴和3.95×10⁴拷贝/反应。结论本研究建立的多重实时荧光PCR检测方法特异性强,灵敏度高,可在2 h内完成对产毒真菌的检测。     

多重不对称PCR探针熔解曲线法在一管中检测多个肥胖易感基因方法的建立

目的 针对中国人群4个常见的肥胖易感基因位点(FTO基因rs1421085位点、APOA5基因rs662799位点、FABP2基因rs1799883位点、ADRB3基因rs4994位点),建立一种方便、精准、低成本的检测方法.方法 结合前期研究中发现的与中国人群肥胖密切相关的4个基因位点,设计引物对、荧光探针以及对应等位基因的靶序列,通过熔解曲线法,验证荧光探针与对应等位基因的靶序列的工作效果,确认不同基因型的熔解温度.采用PCR-Sanger测序法为金标准,对收集的人唾液样本进行检测,选取12个基因型的样本,开发多重不对称PCR荧光探针熔解曲线法进行检测.随后,使用多重不对称PCR探针熔解曲线法与PCR-Sanger测序法分别对200例志愿者的唾液样本进行基因分型检测,比较两种方法的结果与优缺点.结果 多重不对称PCR探针熔解曲线法可以在一管中同时对4个常见的肥胖易感基因位点进行检测,准确度与PCR-Sanger测序法相同,且与PCR-Sanger测序法需有扩增、电泳、纯化、s测序的复杂步骤相比,可在一管中一次完成检测,操作更为便捷,且成本更加节省.结论 本研究建立了一种针对4个常见肥胖易感基因位点的方便、精准、低成本的基因分型方法,为人群肥胖易感基因的批量筛查提供了一种有效的检测手段.     

PCR-反向杂交膜片技术检测石蜡包埋组织中的结核杆菌

[目的]探讨PCR-膜片RDB (recerse dot blot)技术检测石蜡包埋组织中的结核杆菌的方法.[方法]合成检测结核杆菌的寡核苷酸探针并制作膜芯片,扩增结核分支杆菌插入序列IS6110基因片段,利用PCR-膜片RDB技术,检测12株结核分支杆菌临床分离株、2株大肠杆菌,120例结核病人及38例非结核病人石蜡包埋组织中结核杆菌.石蜡组织的膜片检测结果与抗酸染色法和PCR检测结果比较.[结果]12株扩增阳性的结核分支杆菌,膜片检测11株杂交阳性,2株大肠杆菌和阴性对照结果均为阴性.120例结核病人石蜡组织标本,抗酸染色,PCR和PCR-膜片RDB技术检测灵敏度分别为43.3%(52/120),76.7%(92/120)和87.5%(105/120),三者比较差异有统计学意义(P<0.01).38例非结核病人石蜡组织标本,抗酸染色,PCR和PCR-膜片RDB技术检测特异度分别为100%(38/38),94.7%(36/38)和100%(38/38),三者比较差异无统计学意义(P>0.05).[结论]PCR-膜片RDB技术有助于提高石蜡包埋组织中结核杆菌检出率.     

荧光定量PCR技术在食源性疾病病原菌快速检测上的应用与评估

目的:应用荧光定量PCR技术,实现对食源性疾病病原菌的快速检测。方法:选取食源性疾病常见的四种病原菌,沙门菌、志贺菌、副溶血性弧菌和金黄色葡萄球菌,根据它们的基因保守区设计特异性引物和Taqman探针,建立荧光定量PCR技术,同时验证方法的敏感性和特异性,并与普通PCR、常规培养法进行比较。结果:用荧光定量PCR技术检测沙门菌、志贺菌、副溶血性弧菌和金黄色葡萄球菌的检测灵敏度可达4 CFU/ml～8 CFU/ml,其敏感性比普通PCR高10倍,比常规培养法高1000倍。且快速简便,特异性强,从核酸提取至完成检测最快能在2 h～3 h内完成,而常规培养需3 d～4 d。通过对282件样品的检测,证实该方法可以使阳性检出率从常规法的8.51%提高至14.18%。结论:建立的荧光定量PCR技术特异性强,敏感性高,操作简便快速,适用于食源性疾病病原菌的快速检测。     

多重荧光定量PCR检测鼠感染3种病原体的方法

目的 建立多重荧光定量PCR快速检测以鼠为宿主伯氏疏螺旋体、弓形虫和恶性疟原虫的方法,对预防3种病原体引发的疫情具有重要意义.方法 通过设计特异性引物和探针,扩增伯氏疏螺旋体23S rRNA基因,弓形虫的B1基因和恶性疟原虫的SSU基因,采用倍比梯度稀释法检测该体系的灵敏度,以另外8种以鼠为宿主的致病菌评价检测体系的特异性;建立了同时感染3种病原体的鼠全血模拟样本检测试验,以验证方法的适用性.结果 建立自鼠血液模拟样本中同时检测伯氏疏螺旋体、弓形虫和恶性疟原虫的多重荧光定量PCR方法,检测3种病原体的灵敏度分别为5.5、12.8、17.2拷贝/μl,特异性强.结论 建立了多重荧光定量PCR检测伯氏疏螺旋体、弓形虫和恶性疟原虫方法,缩短了检测时间,在疾病防控等方面有很好的应用前景.     

疟疾的实时荧光PCR快速检测方法

目的:建立疟疾的实时荧光PCR检测方法并用于疟疾的快速检测。方法:设计了疟原虫通用型实时荧光PCR检测的引物和探针,建立了疟疾的实时荧光PCR检测方法。对40份疟疾镜检阳性样本和20份镜检阴性样本进行实时荧光PCR检测,并和巢式PCR方法检测结果进行了比较。结果:疟疾实时荧光PCR检测速度快,20分钟即可完成。40份镜检阳性样本的荧光PCR检测均为阳性,2份样本的巢式PCR结果为阴性;20份镜检阴性样本中有3份样本为实时荧光PCR阳性,其余17份样本为实时荧光PCR阴性,与疟疾巢式PCR检测结果相同。结论:该实时荧光PCR方法检测速度快,特异性强,准确性高,阳性率高,不易漏检,适用于疟疾的快速检验,这对防止该病在国境口岸的传入提供了技术依据。     

应用荧光定量PCR检测阴道加特纳菌

目的:确定荧光定量PCR方法检测细菌性阴道病相关细菌阴道加特纳菌的可行性。方法:采用SYBR Green方法建立了阴道加特纳菌荧光定量PCR方法,评价荧光PCR方法的特异性、灵敏度、重复性;并对568例临床分泌物样本进行检测。结果:本实验所建立的荧光定量PCR方法可准确、特异的检测阴道加特纳菌;该方法的灵敏度可达到1拷贝/μl;194例细菌性阴道病患者分泌物标本中荧光定量PCR法检出116例(59.79%)阴道加特纳菌;而在374例非细菌性阴道病患者分泌物标本中荧光定量PCR法检出35例(9.36%)阴道加特纳菌;荧光定量PCR法检出率明显高于细菌培养方法,差异具有显著性,χ2=24.89,P<0.01。结论:荧光定量PCR方法能够应该用于临床分泌物标本中的阴道加特纳菌的检测。     

应用Taq Man探针法与高分辨熔解曲线法检测HLA-B27基因诊断强直性脊柱炎的价值

目的运用Taq Man探针法与高分辨熔解曲线法检测疑似强直性脊柱炎患者的人类白细胞抗原HLA-B27,并探讨其方法的有效性和应用价值。方法分别将疑似强直性脊柱炎患者的血样DNA进行HLA-B27的Taq Man探针法和高分辨熔解曲线法检测,并以DNA直接测序法所得阳性结果作为金标准,来确定Taq Man探针法和高分辨熔解曲线法的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值。结果 55例样本中,Taq Man探针法和高分辨熔解曲线法与DNA测序法的符合率分别为98.2%和92.7%。Taq Man探针法检测HLA-B27的敏感度为0.970,特异度为1.000,阳性预测值为1.000,阴性预测值为0.956;高分辨熔解曲线法检测HLA-B27的敏感度为0.879,特异度为1.000,阳性预测值为1.000,阴性预测值为0.846。结论 Taq Man探针法与高分辨熔解曲线法均具有准确性好、灵敏度高、检测快速等优点,适合于临床HLA-B27的检测。     

多重PCR与PCR-荧光探针法检测外环境霍乱弧菌的比较研究

目的：对比多重PCR与PCR-荧光探针法从外环境中直接检测霍乱弧菌的效果。方法：收集40份水样和40份水产品样本,再以20份已知特性菌株作对照。将上述样本和菌株进行培养后提取模板,分别进行多重PCR和PCR-荧光探针法检测。结果：两种方法均从40份水样中检出14份非O1非O139群霍乱弧菌,两种方法均能从40份水产品中检出29份O1群霍乱弧菌及3份非O1非O139群霍乱弧菌。以上检出霍乱弧菌均可经血清学试验证实。20份已知特性样本两种方法均鉴定无误,最低检出限均为10^2cfu/ml。结论：两种方法灵敏度和特异度均极高,多重PCR方法因能同时进行致病力的初步判断,检验速度相对较快,成本较为经济而更为实用。     

四种食源性致病菌多重PCR检测方法的建立

目的建立一种多重PCR检测方法同时检测食品中沙门菌、志贺菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌。方法参考沙门菌侵袭蛋白A(invA)基因序列,志贺菌侵袭性质粒抗原(ipaH)基因序列,金黄色葡萄球菌引物设计参考耐热核酸酶(nuc)基因序列,单增李斯特菌引物设计参考溶血素蛋白(hly)基因序列设计引物,通过多重PCR对4种食源性致病菌的目的基因进行扩增,并对反应体系进行优化。结果对15株目标菌和17株非目标菌的检测未出现假阳性和假阴性结果,产物分子量与预期一致;4种菌的检测灵敏度分别至少达到10pg/μl;对产物的测序分析表明所得序列与目的基因序列吻合;对319份样品的检测结果显示,其中4份生鲜乳中检出金黄色葡萄球菌,1份生猪肉中检出沙门菌。结论该方法具有良好的检测特异性,可供食源性致病菌的快速检测。     

荧光定量PCR检测肺炎链球菌感染方法的建立

目的 建立Taqman探针法荧光定量PCR检测肺炎链球菌感染的实验室诊断方法.方法 针对肺炎链球菌自溶素基因设计引物及探针,建立荧光定量PCR Taqman探针法检测肺炎链球菌感染.采用肺炎链球菌标准株,构建质粒,用质粒构建标准品,扩增标准品,绘制标准曲线并检验新建荧光定量PCR的敏感性,采用本实验冻存其他菌DNA样本,检测其特异性;采集2015年9月至2015年12月份北京地区家5家医院儿童门诊或病房,诊断为呼吸道感染患儿的咽拭子标本133例,对新建荧光定量PCR法进行临床样本的验证.结果 绘制了荧光定量PCR Taqman探针法检测肺炎链菌感染的标准曲线;新建荧光定量PCR可检测的肺炎链球菌最低拷贝数为10copies/μL;新建荧光定量PCR可成功区分几种病原体DNA,具有较好特异性;采用新建荧光定量PCR检测临床样本132例,其中肺炎链球菌阳性25例,阳性率为18.94%.结论 新建立的荧光定量PCR检测肺炎链球菌感染的实验室诊断方法具有较高的敏感性和特异性,可用于临床样本的检验.     

多重荧光定量PCR同时检测霍乱弧菌、副溶血性弧菌和创伤弧菌的方法研究

目的:利用多重荧光定量PCR技术检测霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌。方法:以溶藻弧菌等17种相关试验菌株做特异性检测;并将标准菌株稀释成不同梯度,做灵敏度检测。结果:与传统的检测方法相比,该方法有很好的特异性且灵敏度高,检测时间短并可节省人力,具有快速方便等优点。结论:适用于样品中霍乱弧菌、副溶血性弧菌和创伤弧菌的快速检测。检测限分别为:霍乱弧菌为280 cfu/ml;副溶血性弧菌为:100 cfu/ml;创伤弧菌为:450 cfu/ml。