L1 C-末端共同序列多肽抗体检测宫颈液基细胞学标本中人乳头瘤病毒

目的 确定由人乳头瘤病毒（HPV）主要外壳蛋白L1 C-末端保守序列多肽诱导的多肽抗体对宫颈脱落细胞内的HPV是否具有良好的检测能力。方法 收集宫颈脱落细胞,一式两份,一份采用巢氏PCR检测HPV DNA,另一份以兔抗多肽纯化抗体和小鼠抗多肽抗血清为探针做夹心法ELISA检测标本中的HPV L1,比较两种方法对HPV的检出率差异。用多肽抗体对部分标本做免疫细胞化学检测。结果 对收集到的269例宫颈脱落细胞标本用MY09/11引物扩增,检出HPV DNA阳性标本30例,检出率为11.15%;对MY09/11扩增后结果为阴性的标本再用引物GP5+/6 进行扩增。又检出阳性标本51例,检出率为21.34%。将两个PCR检测合计,共检测到81例HPV DNA阳性标本,HPV DNA总检出率为30.11%。对263例脱落细胞标本进行ELISA检测,共检出阳性标本91例,HPV阳性检出率为34.60%,与PCR检测结果相比差异无统计学意义。免疫细胞化学检测结果表明多肽抗体能够特异性地显示有HPV感染的宫颈脱落细胞。结论 HPV L1多肽抗体对宫颈脱落细胞内HPV的感染具有良好的检出能力,该抗体在开发用于宫颈癌预防性筛查的HPV检测试剂盒方面具有一定的潜力。     

HPV L1在不同宫颈病变组织中的表达规律探讨

目的 探讨影响HPV L1蛋白在肿瘤组织内表达的因素,寻找HPV L1蛋白在不同宫颈病变中的表达规律。方法 收集不同宫颈病变组织,检测标本内HPV16和HPV18基因分型及基因组物理状态;用ELISA、蛋白质印迹和免疫组织化学方法检测标本内HPV L1的表达情况。结果 共收集到48例标本,其中42例HPV16阳性,3例HPV18阳性。HPV16阳性标本中,25例病毒基因组为游离型,7例为混合型,10例为整合型;HPV18阳性标本全部为整合型。ELISA及蛋白质印迹检测显示,随着病变程度的加重,HPV L1的表达量有逐渐降低的趋势。免疫组织化学显示,组织内的HPV L1阳性反应有多种形式,依病变组织内病毒基因组物理状态、病变组织分化程度以及病变进程的不同而不同。结论 HPV L1在宫颈病变组织内的表达有一定的结构基础,其表达量与病毒基因组在病变组织和细胞内的物理状态、肿瘤组织的分化程度、病毒基因组插入宿主基因组基因序列的状态有着非常密切的关系。     

宫颈脱落细胞HPVL1蛋白及HPV DNA载量对宫颈病变的预测价值

目的 探讨宫颈脱落细胞HPVL1蛋白、人乳头瘤病毒(HPV) DNA载量对宫颈病变的预测作用.方法 选取宫颈病变患者362例,宫颈刷采集宫颈脱落细胞,采用免疫化学方法检测HPVL1蛋白,HC2技术检测HPV DNA载量,根据宫颈组织病理学结果将患者分为慢性宫颈炎(190例)、宫颈上皮内瘤变Ⅰ期(CIN Ⅰ,45例)、宫颈上皮内瘤变Ⅱ期(CINⅡ,43例)、宫颈上皮内瘤变Ⅲ期(CINⅢ,46例)和宫颈癌(38例);根据宫颈细胞学检查结果将脱落细胞分为未见异常细胞(NILM,122例),未明确性非典型鳞状上皮细胞(ASCUS,75例),可疑非典型鳞状上皮病变细胞(ASCH,52例),低度鳞状上皮内病变(LSIL,61例)和高度鳞状上皮内病变(HSIL,52例),比较不同宫颈病变HPVL1蛋白、HPV DNA载量的差异.结果 130例宫颈脱落细胞HPVL1蛋白阳性,阳性率为35.91％(130/362),其中HPVL1蛋白阳性率由大至小分别为:慢性宫颈炎＞CIN Ⅰ期＞CINⅡ期＞CINⅢ期＞宫颈癌,NILM＞ ASCUS＞ ASCH＞ LSIL＞ HSIL,不同宫颈病变组织病理学或细胞学类型比较差异具有统计学意义(P＜0.05),272例HPV DNA阳性,阳性率为75.14％,低度HPV DNA载量以慢性宫颈炎或NILM最多,高度HPV DNA载量以宫颈癌或HSIL最多,明显高于其他宫颈组织病理学或细胞学类型(P＜0.05).结论 HPVL1蛋白在宫颈脱落细胞的表达随着宫颈病变程度加重而下调,HPV DNA载量随宫颈病变程度加重而上调,二者检测在宫颈病变程度的预测中具有重要的价值.     

HPV-18型晚期基因L1在宫颈脱落细胞中的表达与突变研究

目的:研究人乳头瘤病毒HPV-18型晚期基因L1在不同宫颈上皮病变患者脱落细胞中表达分布与基因突变特征。方法:收集单纯感染人乳头瘤病毒HPV-18型宫颈上皮病变组织脱落细胞,免疫细胞化学分析其中L1基因的蛋白表达情况。提取总DNA,特异性引物针对HPV-18 L1基因进行PCR扩增检测,所得产物进行Sanger基因测序分析。结果:HPV-18 L1基因在宫颈炎、CINⅠ+Ⅱ级、CINⅢ级和宫颈癌组织中蛋白表达阳性率分别为100%、81.8%、34.6%和12.2%。在不同病理分级宫颈上皮病变患者脱落细胞标本中,HPV-18 L1蛋白表达阳性率差异有统计学意义(P<0.01)。Sanger法基因测序显示L1基因序列存在突变,突变率9.2%,共发现11类核苷酸变异,其中4类属错义突变。结论:HPV-18型晚期基因L1蛋白表达量与宫颈组织病理病变严重程度呈负相关趋势。HPV-18 L1基因突变较为突出,存在地区流行型突变株。L1基因突变与宫颈恶性病变程度可能存在一定关系。     

HPV L1壳蛋白在宫颈脱落细胞中的表达及临床意义

目的 探讨人乳头状瘤病毒(HPV)L1壳蛋白在宫颈不同病变脱落细胞中的表达和临床意义.方法 收集2008年1月至2009年5月到北京大学深圳医院宫颈门诊就诊患者的宫颈脱落细胞标本309例,其中正常或慢性宫颈炎33例、宫颈上皮内瘤变(CIN)I级168例、CIN Ⅱ/Ⅲ级84例和鳞状细胞癌(SCC)24例,用免疫细胞化学法检测HPV L1壳蛋白在宫颈脱落细胞中的表达.结果 在正常宫颈或慢性宫颈炎、CINI、CINⅡ/Ⅲ和SCC中,HPV L1壳蛋白阳性表达率分别为27.3%(9/33)、66.7%(112/168)、25.0%(21/84)、0%(0/24).其中CINI组、SCC组与正常或慢性宫颈炎组比较,CINI组与CINⅡ/HI组比较,CINI、CINⅡ/Ⅲ组与SCC组比较差异均有统计学意义(均P<0.01),随病变程度的加重,HPV L1壳蛋白阳性表达率呈下降的趋势.分别以30岁和40岁为界分组,不同年龄组间HPV L1壳蛋白的表达差异均无统计学意义(均P>0.05).在高危型HPV DNA负荷量≥1 000 RLU/PC组HPV L1壳蛋白表达率为73.1%,与负荷量<1 000 RLU/PC的各组相比,其表达率明显增加(均P<0.05).HPV L1壳蛋白检测CINⅡ/Ⅲ以上病变的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为80.6%、60.2%、52.1%和85.2%.结论 HPV L1壳蛋白在CIN和SCC中的阳性表达率随着病变程度加重呈下降趋势,有望成为预测宫颈癌前病变进展的生物学标志物.     

宫颈脱落细胞高危人乳头瘤病毒DNA分型定量的临床应用

目的探讨宫颈脱落细胞高危人乳头瘤病毒DNA（HR-HPV-DNA）分型定量在宫颈癌防治中的意义。方法采用实时定量PCR-双色荧光探针法,对1 417例体检妇女进行宫颈脱落细胞作HR-HPV-DNA分型定量检测和TCT检测。结果 HR-HPV16是HR-HPV单型别中阳性率最高的型别（19.14%）。HR-HPV-DNA总体阳性率为13.76%,HR-HPV-DNA阳性率和水平随着细胞学诊断的严重程度增加而升高。在宫颈上皮内瘤变（CIN）组,HR-HPV-DNA水平高于正常组、萎缩性鳞状上皮细胞组、轻度炎症组和中度炎症组（P〈0.05）。非典型鳞状上皮细胞组HR-HPV-DNA水平高于轻度炎症组（P〈0.05）。结论细胞学诊断的严重程度不仅与HR-HPV的型别有关,还与HR-HPV-DNA的水平有关。     

开封地区10733例女性宫颈脱落细胞HPV基因分型分析

目的:对10 733例女性宫颈脱落细胞进行人乳头瘤病毒(HPV)基因分型检测,了解HPV基因各亚型感染现状,为宫颈癌的筛查及早期预防治疗提供理论依据。方法:采取核酸分子快速导流杂交分型技术,对10 733例女性的宫颈脱落细胞进行核酸的提取和HPV基因分型检测。结果:在10 733例女性宫颈脱落细胞中21种HPV基因亚型均被检出,HPV阳性2509例(23.38%,2509/10 733),单一亚型感染1780例,感染率为16.58%,多重亚型感染729例,感染率为6.79%;单纯高危型HPV感染1680例,感染率为15.65%,单纯低危型HPV感染503例,感染率为4.69%,高、低危型HPV合并感染326例,感染率为3.04%。HPV检出频次2849次。检出频次较高的5种亚型是(按照由高到低的顺序)HPV-16型(22.50%,641/2849),HPV-6型(13.27%,378/2849),HPV-52型(10.46%,298/2849),HPV-11型(10.35%,295/2849),HPV-58型(7.06%,201/2849)。≤30岁人群HPV感染率较高,与其他年龄组比较差异均有统计学意义(P0.05)。结论:HPV-16型、HPV-6型、HPV-52型、HPV-11型、HPV-58型为开封地区HPV感染常见亚型,应重视≤30岁人群HPV的筛查。     

宫颈脱落细胞HPVL1蛋白监测在高危型HPV阳性妇女分流中的应用

目的：探讨高危型人乳头瘤病毒(HPV)阳性的妇女采用宫颈脱落细胞HPV L1蛋白检测的临床实际意义。方法选择2014年10月至2015年10月期间我院妇科收治的386例高危型HPV阳性患者,收集患者的宫颈脱落细胞,采用液基薄层细胞学检查(TCT)、免疫组化两种方法检测HPV L1蛋白,同时对所有患者进行阴道镜检测,可疑部分取活检进行病理检查。对比HPV L1蛋白在正常妇女及不同的病理组织学病变患者中的表达情况。以此评估宫颈脱落细胞HPVL1蛋白检测对筛查子宫病变的临床实际价值。结果386例高危型HPV阳性患者中,发现正常子宫颈162例,低度鳞状上皮内病变94例,高度鳞状上皮内病变128例,而子宫颈鳞癌2例,统计后发现高度内皮病变者、宫颈鳞癌者的HPV L1蛋白阳性率明显低于正常者和低度内皮病变者。此外,宫颈脱落细胞的HPV L1蛋白检测中的组织学诊断关于高度内皮病变者、宫颈鳞癌者两种类型的敏感度、阴性预测值均明显高于TCT检查,但是在特异度一项中,组织学诊断则明显低于TCT检查,差异均有统计学意义(P<0.05),而两项检查中对于阳性预测结果差异无统计学意义(P>0.05);高危型HPV阳性患者中,HSIL、SCC患者的HPV L1蛋白阳性比例为19.2%,而正常以及LSIL者的蛋白阳性比例高达66.4%,差异均有统计学意义(P<0.05);宫颈脱落细胞额HPV L1蛋白检测中的组织学诊断关于高度内皮病变者、宫颈鳞癌者两种类型的敏感度、阴性预测值均明显高于TCT检查,但是在特异度一项中,组织学诊断则明显低于TCT检查,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论对高危型HPV阳性的妇女患者而言,子宫颈脱落细胞HPV L1蛋白检测具有一定的筛查意义,能够为临床提供多一种且适宜的分流方案。     

宫颈HPV持续感染患者脱落细胞中miR-148a-3p的表达水平及意义

目的 探讨宫颈人乳头瘤病毒（HPV）持续感染患者宫颈脱落细胞中微小RNA-148a-3p（miR-148a-3p）的表达水平及意义。方法 选取2017年3月至2019年3月上海交通大学附属新华医院崇明分院妇科收治的宫颈HPV阳性患者170例作为研究对象,根据随访6个月的结果将患者分为HPV非持续感染组（n=105,HPV转阴）、HPV持续感染组（n=65,HPV仍呈阳性）。收集两组患者临床资料,采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测宫颈脱落细胞中miR-148a-3p表达水平;采用HPV核酸扩增分型检测试剂盒对21种常见的HPV基因型进行分型检测,并根据HPV基因型检测结果将HPV持续感染组分为低危型组（n=26）、高危型组（n=39）。采用多因素logistic回归分析影响宫颈HPV持续感染的危险因素;并绘制接受者操作特征曲线（ROC）,分析宫颈脱落细胞中miR-148a-3p表达水平对宫颈HPV持续感染的诊断价值。结果 HPV持续感染组年龄≥ 45岁、初次性生活年龄<20岁、人流次数≥ 1次及有生殖道炎症比例均高于HPV持续感染组,差异有统计学意义（P<0.05）。HPV持续感染组患者脱落细胞中miR-148a-3p表达水平低于HPV非持续感染组患者,差异有统计学意义（P<0.05）。高危型宫颈HPV持续感染患者脱落细胞中miR-148a-3p表达水平低于低危型宫颈HPV持续感染患者,差异有统计学意义（P<0.05）。多因素logistic回归分析显示,年龄、人流次数及脱落细胞中miR-148a-3p表达水平均是影响宫颈HPV持续感染的独立危险因素（P<0.05）。ROC曲线分析显示,脱落细胞中miR-148a-3p表达水平诊断宫颈HPV持续感染的曲线下面积为0.923,最佳截断值为0.75时,诊断敏感度为81.30%,特异度达96.30%。结论 脱落细胞中miR-148a-3p表达水平降低与宫颈HPV持续感染发生有关,可能作为早期诊断宫颈HPV持续感染的有效指标之一。     

HPV L1壳蛋白在宫颈病变诊断及随访中的临床意义

目的：探讨宫颈脱落细胞HPV L1壳蛋白检测在宫颈病变诊断及随访中的临床意义。方法：选取2013年1月至2014年6月在温州市中心医院宫颈液基细胞学检查（TCT）诊断≥未明确诊断意义的不典型鳞状上皮细胞（ASCUS）,HPV病毒基因分型检测高危型HPV阳性276例患者,检测HPV L1壳蛋白在子宫颈病变中表达情况。结果：①HPV L1壳蛋白在低度鳞状上皮内病变（LSIL）、ASCUS、非典型鳞状上皮-不除外高度病变（ASC-H）/高度鳞状上皮内病变（HSIL）/鳞状上皮浸润癌（SCC）中的表达率分别是70.09%、55.46%、10.00%,3者间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。②HPV L1壳蛋白在组织病理学诊断慢性子宫颈炎（CC）、CINI、CINII-III和SCC中的阳性表达率分别是63.55%、75.32%、21.59%、0.00%,不同组间的HPV L1壳蛋白表达率差异有统计学意义（P＜0.05）。③在高危型HPV基因阳性妇女中,HPV L1壳蛋白联合TCT及单独TCT对诊断组织病理学≥CINII的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别是88.89%、46.73%;88.65%、96.20%;71.43%、86%和96.15%、78.32%。④对31例CINI妇女随访1年,结果发现CINI妇女中HPV L1壳蛋白阳性者和HPV L1壳蛋白阴性者相比,1年病变自然消退率高,差异有统计学意义（P＜0.05）;HPV L1壳蛋白预测CINI患者病变消退的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为91.67%、57.89%、57.89%、91.67%。结论：①HPV L1壳蛋白随着子宫颈病变程度增高表达率下降;②在高危型HPV基因阳性妇女中,宫颈脱落细胞HPV L1壳蛋白检测联合TCT比单独TCT预测组织学病理≥CINII有更高的敏感度（88.89% vs 46.73%）和阴性预测值（96.15% vs 78.32%）;③在CINI随访妇女中,HPV L1壳蛋白阳性妇女CINI自然消退率更高,有较高的预测CINI病变消退的敏感度和阴性预测值,值得临床推广。     

p16、Ki67、PHH3和HPV-L1在宫颈脱落细胞中的表达及临床意义

目的：观察p16基因、Ki67蛋白、核分裂特异性抗体(PHH3)及人乳头瘤病毒L1型(HPV-L1)基因在宫颈病变脱落细胞的表达规律,并探讨其临床意义。方法选取2015年4月至2016年4月期间本院妇科收治的100例妇科病患者作为研究对象,取宫颈脱落细胞,行杂交捕获Ⅱ代法人乳头瘤病毒(HPV HC-Ⅱ)检测和液基薄层细胞学检查,检测并分析HPV-L1、PHH3、Ki67、p16的表达水平。结果宫颈脱落细胞学检出未见上皮内细胞病变(NILM)8例,非典型鳞状上皮细胞/低级别鳞状上皮内病变(ASCUS/LSIL)42例,非典型鳞状上皮细胞不能排除高级别鳞状上皮内病变/高级别鳞状上皮内病变(ASC-H/HSIL)41例,鳞状细胞癌(SCC)9例。ASCUS/LSIL患者的Ki67、PHH3、p16阳性检出率分别为19.05%、4.76%、26.19%,均明显低于ASC-H/HSIL患者的85.37%、88.89%、88.89%,差异均有统计学意义(P<0.05);p16阳性表达对宫颈癌及癌前病变的诊断敏感性、特异度分别为90.32%(56/62)、86.84%(33/38),Ki67分别为83.87%(52/62)、89.47%(34/38),PHH3分别为70.97%(44/62)、100.00%(38/38);ASCUS/LSIL患者的HPV-L1阳性表达率为69.05%,明显高于ASC-H/HSIL (0),差异有显著统计学意义(P<0.01)。结论 PHH3、Ki67、p16联合检测可作为筛查宫颈脱落细胞的辅助手段,其能够有效提高宫颈癌及癌前病变的诊断准确性,检测HPV-L1能够对ASCUS/SLIL病变程度进行有效分流,为临床治疗提供一定的指导。     

CaSki细胞内HPV L1蛋白的表达

目的：了解含人乳头瘤病毒（HPV）基因组的宫颈癌CaSki细胞中HPV晚期衣壳蛋白1（L1）的表达。方法以多价HPV L1小鼠单克隆抗体做探针，采用ELISA、免疫组化、Western blotting等方法，检测CaSki细胞内L1蛋白的表达；采用RT-PCR法检测细胞内L1 mRNA的表达。结果 CaSki细胞呈HPV L1阳性反应，显示细胞内有HPV L1蛋白存在；CaSki细胞内有L1 mRNA存在。结论包含HPV16混合基因组的CaSki细胞可以表达L1蛋白。     

人乳头瘤病毒16型E7蛋白单克隆抗体的研制

目的 为研究HPV16 E7蛋白在肿瘤早期预报中的作用及研制治疗性疫苗,特制备HPV16 E7的单克隆抗体.方法 将构建成的PGEX4T-1-HPV16 E7的质粒转化BL21细菌,在IPTG诱导下,稳定表达GST-HPV16E7融合蛋白,免疫Balb/c小鼠,收集免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合,用ELISA双筛,直至检测所有孔均为E7阳性而GST阴性为止,扩大培养、建株、冻存并制备腹水、单克隆抗体.结果 成功制备出HPV16 E7的单克隆抗体,可在多种肿瘤组织细胞核中染色.结论 该抗体是HPV16 E7蛋白特异性的McAb.     

抗HPV16L1 IgY抗体的制备及活性检测

目的 制备出高特异性的抗HPV16L1 IgY抗体,为HPV16L1蛋白的检测提供一种方法.方法 用纯化HPV16 L1蛋白免疫母鸡,分别收集鸡蛋,4℃下保存备用;经聚乙二醇法提取鸡蛋黄中IgY抗体;用酶联免疫吸附法检测IgY抗体效价的测定;采用免疫组织化学法通过对转染pcDNAEGFP-HPV16L1(含EGFP-HPV16L1融合基因)质粒的CHO细胞中L1蛋白的检测评价IgY抗体的特异性.结果 3次免疫之后,IgY抗体效价达到1:10 240,同时可特异性与转染pcDNAEGFP-HPV16L1(含EGFP-HPV16L1融合基因)质粒的CHO细胞中EGFP-HPV16L1 结合.结论 采用HPV16L1蛋白免疫母鸡,成功获得了较高效价的特异性IgY抗体,并可用于HPV16L1蛋白的细胞学检测,为IgY抗体在免疫组织化学检中的应用提供实验依据.     

抗人肝再生增强因子单克隆抗体对人肝癌细胞株HepG2增殖活性的影响

目的:检测人肝癌细胞株HepG2细胞有无人肝再生增强因子(hALR)的表达,利用hALR特异性的单克隆抗体(anti-hALR McAb)结合hALR,观察其阻断hALR的作用后,对人肝癌细胞株HepG2细胞的增殖活性的影响.方法:用免疫细胞化学以及RT-PCR的方法检测HepG2细胞hALR蛋白及mRNA的表达;用3H-TdR掺入法检测hALR特异性单克隆抗体中和hALR后HepG2细胞的增殖情况.结果:①HepG2细胞有hALR的表达.②抗hALR单克隆抗体特异性地阻断hALR的作用后可部分抑制肿瘤细胞自主性生长.结论:抗hALR单克隆抗体能部分抑制肿瘤细胞自主性生长;hALR通过自分泌方式参与了肝癌细胞的自主性生长.