高迁移率族蛋白B1及ERK1/2通路对张应力下人牙周膜细胞自噬的影响

背景：正畸牙移动骨重塑的机械力信号转导通路及其调控机制是正畸生物力学和生物学研究的热点。目前正畸牙移动过程中张力侧牙周膜细胞对机械刺激反应的复杂分子信号网络机制尚不太明确。目的：探究正畸牙移动过程中张应力作用下高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein 1,HMGB1)和ERK1/2通路对人牙周膜细胞自噬的影响。方法：选取第3-5代生长状态良好的人牙周膜细胞,施加周期性张应力,利用免疫荧光观察HMGB1在细胞中的分布情况,RT-qPCR及Westernblot检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1和HMGB1的表达水平,完成张应力加载后分别提取胞核蛋白和胞浆蛋白,Westernblot分别检测胞核及胞浆中HMGB1蛋白水平。为探究HMGB1通过何种机制参与调控细胞自噬,使用丙酮酸乙酯(HMGB1胞浆抑制剂)进行细胞处理,通过免疫荧光、RT-qPCR和Western blot检测细胞自噬水平。最后,选用PD98059抑制ERK1/2通路,通过RT-qPCR以及Western blot检测自噬水平变化,探讨HMGB1通过ERK1/2通路调控自噬的机制。...     

骨巨细胞瘤细胞自噬特征及其对细胞增殖的影响

目的探讨骨巨细胞瘤细胞自噬特征及其对细胞增殖的作用。方法体外培养骨巨细胞瘤细胞(GCT-0404细胞),分别采用血清饥饿、雷帕霉素以及抑制剂氯喹进行处理,Western blot检测自噬相关蛋白LC3、Beclin 1的表达;免疫荧光显示细胞内自噬体的形成;倒置相差显微镜下观察细胞形态学变化;CCK-8检测细胞的活性。结果血清饥饿、雷帕霉素以及氯喹干预GCT-0404细胞,可使LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化水平明显增高(P0.05);绿色荧光的斑点增多;而Beclin 1的表达水平无显著变化。同时,干预处理后细胞形态发生了显著变化,并抑制细胞增殖(P0.05)。结论血清饥饿、雷帕霉素以及抑制剂氯喹干预GCT-0404细胞所致自噬的发生及其自噬流的变化可参与对细胞增殖抑制的调控。     

NOD8抑制人胰腺癌细胞自噬及凋亡对其自噬作用的影响

目的:探讨NOD8(也称NLRP10或PYNOD)是否能抑制胰腺癌细胞发生自噬及其可能机制,并研究凋亡对NOD8调控自噬的影响。方法:用JetPRIME阳离子聚合物将空质粒pEGFP-C2和重组质粒pEGFP-NOD8分别转染入胰腺癌Panc-1细胞,并设立空白对照组,48 h后应用Western blot检测NOD8蛋白、自噬相关蛋白(beclin-1和LC3-Ⅱ)以及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路相关蛋白(Akt、p-Akt、mTOR和p-mTOR)的表达;并采用免疫荧光染色法观察细胞LC3斑点的数量。此外,用caspase抑制剂Z-VAD-FMK作用于过表达NOD8的Panc-1细胞后,Western blot检测beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白的表达水平;免疫荧光染色法观察细胞LC3斑点数量。结果:pEGFP-NOD8组细胞NOD8蛋白表达明显高于对照组和pEGFP-C2组(P0.01)。与对照组和pEGFP-C2组相比,pEGFP-NOD8组细胞beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表达及细胞LC3斑点数量显著降低;并且pEGFP-NOD8组细胞p-Akt及p-mTOR蛋白表达量显著上升(P0.01),而AKT和mTOR蛋白表达无明显差异。与pEGFP-NOD8组相比,pEGFP-NOD8+Z-VAD-FMK组细胞beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表达水平及LC3斑点数量显著高于pEGFP-NOD8组。结论:NOD8可抑制Panc-1细胞自噬,其机制可能与激活PI3K/Akt/mTOR通路有关;凋亡可增强NOD8对自噬的抑制作用。     

雷公藤甲素对TLR7激动剂Resiquimod诱导RAW264.7巨噬细胞自噬的影响

目的考察TLR7激动剂Resiquimod(R848)能否诱导RAW264.7细胞自噬以及雷公藤甲素对R848诱导的自噬的影响。方法用0.01、0.1、1μg/ml的TLR7激动剂R848诱导RAW264.7细胞12、24、36 h,Western blot检测自噬蛋白LC3II/I、P62、Beclin1和Atg5表达情况;RAW264.7细胞采用0.1μg/ml R848处理24 h诱导自噬后,给予5 ng/ml、10 ng/ml雷公藤甲素12、24 h对自噬相关蛋白LC3II/I、P62及通路蛋白AKT检测。结果 RAW264.7细胞采用0.1μg/ml R848处理24 h后自噬相关蛋白LC3II/I、P62、Beclin1和Atg5表达显著升高;加入不同质量浓度的TP后,LC3II/I、P62显著表达减少,通路蛋白AKT表达升高。结论TLR7激动剂R848能够诱导RAW264.7细胞自噬,而TP能够抑制R848诱导的自噬,并且该作用可能与PI3K/AKT信号通路有关。     

连接子蛋白43(Cx43)抑制氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的大鼠胸主动脉平滑肌细胞自噬

目的 探讨连接子蛋白43(Cx43)在氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)自噬中的作用。方法 采用α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)免疫荧光细胞化学染色鉴定原代VSMC, ox-LDL处理后,采用油红O染色鉴定泡沫细胞;Western blot法检测(0、 40、 80、 160)μg/mL ox-LDL处理0、 6、 12、 24 h, VSMC中微管相关蛋白1轻链3(LC3)蛋白的表达以及80μg/mLox-LDL干预24 h,Cx43蛋白的表达;将VSMC随机分为对照组、ox-LDL组和ox-LDL联合Cx43特异性阻断剂Gap26组,Western blot法检测各组细胞LC3、beclin 1的表达。结果 分离的细胞α-SMA阳性率达95%以上,与对照组相比,ox-LDL处理的细胞油红O阳性细胞明显增加,ox-LDL呈浓度依赖及时间依赖地降低LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值及beclin 1蛋白表达,Cx43蛋白的表达明显升高;给予Gap26后,可上调LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值及beclin 1蛋白表达。结论 Cx43抑制ox-LDL引起的自噬。     

miR-218-5p靶向HMGB1参与脂多糖诱导的足细胞损伤

目的探究miR-218-5p、高迁移率蛋白B1(HMGB1)在脂多糖(LPS)诱导的小鼠足细胞损伤中的作用。方法将小鼠足细胞分为4组:正常对照组、LPS诱导组、HMGB1 shRNA+LPS组、miR-218-5p mimics+LPS组。Western blot和Real-time PCR分别检测各组HMGB1、TLR4、MyD88、TNF-α、IL-6、synaptopodin、ZO-1蛋白和mRNA表达水平;免疫荧光检测synaptopodin、ZO-1的表达和定位;Transwell检测足细胞迁移能力;双荧光素酶报告基因验证miR-218-5p和HMGB1的关系。结果 LPS刺激后,HMGB1、TLR4、MyD88表达明显升高,炎性因子TNF-α、IL-6表达升高,而足细胞标记蛋白synaptopodin、ZO-1表达降低,同时足细胞迁移能力明显增强。沉默HMGB1或过表达miR-218-5p可降低TLR4、MyD88,TNF-α、IL-6表达,增加synaptopodin、ZO-1表达,抑制足细胞迁移能力,缓解足细胞损伤。荧光素酶报告基因检测提示miR-218-5p可直接作用...     

高迁移率族蛋白1促进原发性肝癌细胞增殖

目的探讨高迁移率族蛋白1(HMGB1)及晚期糖基化终产物受体(RAGE)在原发性肝癌中的表达,研究HMGB1促进肝癌细胞增殖的作用以及相关的分子机制。方法取肝癌组织及癌旁组织各25例,免疫组化法观察组织样本中HMGB1及RAGE的表达;体外培养肝癌细胞系HepG2和正常肝细胞系L02,用Western blot检测细胞系中HMGB1及RAGE的表达。向HepG2肝癌细胞系中加入外源性重组人HMGB1蛋白(rhHMGB1),用MTT法检测处于不同浓度rhHMGB1(0、10、50和100μg/L)以及不同处理时间(0、12、24和36 h)作用下HepG2细胞的增殖率;用Western blot检测细胞中RAGE和NF-κB的表达。结果 HMGB1和RAGE蛋白在肝癌组织的阳性表达率为64%和72%,分别高于癌旁组织的20%和28%(P0.05)。随着细胞培养时间的延长,HMGB1及RAGE的表达呈上升趋势;随着rhHMGB1浓度的升高或处理时间的延长,HepG2细胞的增殖率显著提高(P0.05),细胞中RAGE和NF-κB的表达显著上调(P0.05)。结论 HMGB1和RAGE蛋白在肝癌组织及肝癌细胞中高表达。HMGB1可能通过与其受体RAGE结合,进一步激活NF-κB信号通路,从而促进肝癌细胞增殖。     

UCP2通过调控mTOR对LPS诱导的HK2细胞自噬产生影响

目的探讨线粒体解耦联蛋白2(uncouplingprotein2,UCP2)在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导肾小管上皮细胞(HK2细胞)自噬中的作用机制。方法以HK2细胞为研究对象,采用不同质量浓度LPS(0,0.1,0.5,1,5μg/ml)干预不同时间(0,12,24,48 h),Western blot检测HK2细胞UCP2蛋白水平变化。并将HK2细胞分为4组:正常对照组,LPS组(LPS induced),UCP2shRNA组(UCP2 shRNA+LPS)和UCP2 scramble组(UCP2 scramble+LPS),LPS为1μg/ml,24 h。利用Real-time PCR和Western blot检测HK2细胞UCP2 mRNA和蛋白表达水平,免疫荧光检测线粒体动力相关蛋白1(Drp1)表达变化,Western blot检测线粒体融合蛋白2(Mfn2)、Drp1,自噬相关蛋白Beclin-1、LC3B,凋亡相关蛋白Bcl-2、Cleaved-Caspase-3以及mTOR的蛋白表达水平。结果 Western blot结果显示,1μg/...     

lncRNA PVT1促进卵巢癌细胞自噬相关机制研究

目的探究长链非编码RNA PVT1对卵巢癌细胞自噬的影响及其调控机制。方法 Real-timePCR检测PVT1在卵巢癌组织样本中表达情况及PVT1在卵巢癌细胞株中的表达;免疫荧光实验和Western blot检测过表达PVT1对卵巢癌细胞自噬水平的影响;Western blot用于研究过表达PVT1对自噬相关蛋白ATG7表达的影响;利用共转染实验验证PVT1通过上调ATG7从而影响自噬水平。结果 Real-time PCR结果表明卵巢癌组织中PVT1的表达水平高于正常组织,各卵巢癌细胞系(ES2、OVCAR3、A2780)中PVT1表达高于正常卵巢细胞系(HOSEpiC)。Western blot和免疫荧光实验结果表明,与对照组相比,过表达PVT1能增加自噬标志蛋白LC3II/LC3I比例,能够显著促进卵巢癌细胞的自噬并通过上调ATG7的表达促进细胞自噬的发生。结论 lncRNA PVT1能够上调ATG7表达,促进卵巢癌细胞自噬的发生,有望成为卵巢癌新的治疗靶点。     

人乳头瘤病毒16 E5(HPV16 E5)蛋白抑制角质形成细胞生长因子诱导的细胞自噬

目的研究人乳头瘤病毒16 E5(HPV16 E5)蛋白对角质形成细胞生长因子(KGF)诱导的细胞自噬的影响。方法构建HPV16 E5蛋白真核表达载体p CI-neo-E5,采用LipofectamineTM2000转染至Ha Ca T人角质形成细胞,实时定量PCR检测HPV16 E5 mRNA转录水平。转染p CI-neo-E5并以KGF刺激Ha Ca T细胞后,实时定量PCR检测自噬相关蛋白beclin 1、自噬相关基因5(ATG5)、ATG7及LC3B mRNA的水平,Western blot法检测LC3BⅡ蛋白的表达量,免疫荧光技术检测LC3B的分布。结果成功构建HPV16 E5真核表达载体p CI-neo-E5并可有效表达。角质形成细胞转染p CI-neo-E5,自噬相关蛋白mRNA的水平显著降低,抑制KGF诱导的LC3BⅡ表达水平升高和LC3B的聚集。结论 HPV16 E5蛋白通过下调自噬相关蛋白的表达,抑制KGF诱导的细胞自噬。     

TLR4介导可溶性尿酸诱导的肾小管上皮细胞自噬流异常

目的:探寻Toll样受体4(TLR4)与可溶性尿酸诱导肾小管上皮细胞HK-2自噬的关系。方法:用可溶性尿酸或/和氯喹(CQ)刺激HK-2细胞,采用Western blot检测LC3-Ⅱ和P62的表达水平,通过透射电子显微镜观察细胞内自噬小体及自噬溶酶体形成。在可溶性尿酸刺激HK-2细胞的基础上加上TLR4抑制剂TAK242后采用RT-qPCR检测TLR4的mRNA表达水平,Western blot检测TLR4、LC3-Ⅱ和P62的蛋白水平,并通过自噬双标腺病毒(mRFP-GFP-LC3)标记观察细胞内自噬流的变化。结果:可溶性尿酸可诱导HK-2细胞LC3-Ⅱ和P62的表达上调,其与CQ共同处理后LC3-Ⅱ及P62的表达进一步增加,透射电子显微镜下观察到自噬小体增多,自噬溶酶体少见,提示自噬流受阻。Western blot结果显示,与正常对照组相比,可溶性尿酸组TLR4、LC3-Ⅱ和P62的蛋白水平增高,而TAK242则抑制可溶性尿酸诱导HK-2细胞的TLR4、LC3-Ⅱ和P62的表达水平。自噬双标腺病毒实验结果显示,可溶性尿酸组与对照组相比,自噬小体显著增多,且自噬溶酶体较少;而与可溶...     

肝素结合血凝素通过抑制A549细胞的自噬作用增强耻垢分枝杆菌的感染能力

目的将肝素结合血凝素(HBHA)重组表达于耻垢分枝杆菌(MS),鉴定其对A549细胞自噬作用的影响。方法将HBHA克隆于穿梭表达质粒pMV261,构建HBHA重组载体,电转化至MS;感染A549细胞,Western blot法鉴定A549细胞微管相关蛋白轻链3(LC3)的表达情况,并检测LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值的变化可估计自噬的水平;利用单丹磺酰尸胺(MDC)将自噬体染色后,激光共聚焦观察细胞内自噬体变化的情况;通过MS、rMS-HBHA感染A549细胞18 h,计算胞内活菌数,鉴定感染状况。结果 rMS-HBHA经42℃热诱导成功表达HBHA蛋白;相对野生型MS,重组表达HBHA蛋白的MS(rMS-HBHA)可以显著抑制A549细胞中的LC3Ⅰ和LC3Ⅱ的表达,rMS-HBHA组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值为0.625显著低于MS组2.025,表明rMS-HBHA组自噬体形成受到抑制;并且rMS-HBHA感染A549细胞18 h后胞内活菌为6.3×106,明显高于MS组1×105。结论外源性HBHA可以通过抑制A549细胞的自噬作用增强MS的感染能力。     

HMGB1参与HBSS诱导的Lewis细胞凋亡及其相关机制研究

目的探讨HBSS饥饿缓冲液能否诱导肺癌细胞(Lewis)凋亡及可能的机制。方法 Hank′s平衡溶液(HBSS)饥饿缓冲液作用于Lewis细胞12 h后采用Annexin V/PI流式双染检测细胞凋亡。Lewis细胞在HBSS处理30 min后流式检测ROS的产生,4、8、12 h后通过免疫印迹检测HMGB1蛋白的表达。另外,HBSS刺激Lewis细胞12 h后采用Caspase-3活性检测试剂盒检测Caspase-3的表达。结果 HBSS饥饿缓冲液作用于Lewis细胞12 h后与对照组相比凋亡百分比明显增多。流式结果表明Lewis细胞在HBSS处理30 min后ROS表达量明显上升,免疫印迹检测发现HBSS作用Lewis细胞3 h后HMGB1表达增加,6 h后在细胞培养上清中检测到HMGB1的分泌。另外,HBSS刺激12 h后Caspase-3表达也显著增加,且有统计学意义。结论 HBSS饥饿缓冲液能诱导肺癌细胞(Lewis)凋亡,且凋亡可能依赖于ROS-HMGB1-Caspase-3通路。     

胃饥饿素在脂多糖诱导的胎盘滋养细胞自噬中的作用

目的 探讨胃饥饿素（Ghrelin）对脂多糖诱导的胎盘滋养细胞自噬的影响。方法 构建脂多糖（LPS）诱导的子痫前期（PE）大鼠模型,分为对照组、LPS组和LPS+Ghrelin组,利用透射电镜观察胎盘自噬体和自噬溶酶体的变化。体外培养人胎盘滋养细胞株（HTR-8/SVneo）,分为对照组,LPS组,LPS+Ghrelin低、中、高剂量组,利用透射电镜观察滋养细胞自噬体和自噬溶酶体的变化。利用免疫荧光法检测各组滋养细胞中LC3B的表达,利用Western blot检测各组滋养细胞中LC3B、Beclin1、p-IKKα/β及p-p65蛋白的表达。利用Transwell法观察各组滋养细胞迁移能力的变化。结果 在LPS组中胎盘和滋养细胞的自噬体及自噬溶酶体显著增多,而在LPS+Ghrelin组中显著减少。LPS组的滋养细胞内LC3B荧光强度显著增强,而随着Ghrelin浓度的增加,LC3B荧光强度逐渐减弱。在LPS组中LC3B、Beclin1、p-IKKα/β及p-p65蛋白表达水平升高,而随着Ghrelin浓度增加,LC3B、Beclin1、p-IKKα/β及p-p65蛋白表达水平逐渐降低...     

敲低线粒体转录因子A(TFAM)抑制人宫颈癌细胞及骨肉瘤细胞自噬及增殖、侵袭和迁移

目的 研究线粒体转录因子A(TFAM)对宫颈癌HeLa细胞及骨肉瘤U2OS细胞的线粒体功能、自噬、增殖、侵袭、迁移的影响。方法 HeLa、 U2OS细胞转染TFAM小干扰片段(si-TFAM)下调TFAM表达,Mito-Tracker Red CMXRos染色结合激光共聚焦显微镜检测线粒体膜电位(MMP)、 MitoSOX^TM Red标记法检测线粒体活性氧(mtROS)水平、实时定量PCR检测线粒体DNA(mtDNA)的表达,免疫荧光细胞化学染色检测自噬体数量的变化。Western blot法检测TFAM、微管相关蛋白1轻链3A/B(LC3A/B)、自噬相关基因2A(ATG2A)、 ATG2B、 ATG9A、锌指转录因子Snail、基质金属蛋白酶2(MMP2)和MMP9的表达。CCK-8法、平板集落形成实验检测细胞增殖,Transwell^TM实验、划痕愈合实验检测细胞侵袭、迁移的变化。结果 下调TFAM表达导致HeLa及U2OS细胞MMP减少,mtDNA拷贝数减少,mtROS产生量增加。LC3A/B蛋白含量较对照组明显下降,胞质内自噬体数量明...     

miR-337靶向调节p53表达对结肠癌细胞自噬和迁移能力的影响

目的:研究微小RNA-337(miR-337)对结肠癌细胞自噬及迁移能力的影响并从靶向调节p53表达的角度探讨其可能机制。方法:采用免疫组化方法检测结肠癌组织中beclin-1、LC3B和p53蛋白的表达,分析beclin-1和LC3B蛋白的表达与临床病理特征的相关性及p53与beclin-1和LC3B蛋白表达的相关性。小干扰RNA敲减p53基因表达后电镜观察结肠癌细胞株HCT116中自噬小体的形成,Western blot检测beclin-1和LC3B蛋白的表达。生物信息学预测筛选靶向p53的miRNAs并用RT-qPCR方法验证在HCT116细胞中的表达,萤光素酶报告检测miR-337对p53基因的调控作用。过表达miR-337后用Western blot检测p53及beclin-1和LC3B的表达,Transwell实验检测HCT116细胞的迁移能力。结果:与癌旁黏膜组织相比,beclin-1和LC3B蛋白在结肠癌组织中表达降低,与结肠癌的发生发展以及侵袭、转移显著相关。p53在结肠癌组织中表达升高,与beclin-1和LC3B蛋白的表达显著负相关。敲减p53基因的表达使beclin-1和LC3B蛋白表达上调;过表达miR-337和敲减p53蛋白表达可使beclin-1和LC3B的蛋白表达上调,HCT116细胞迁移能力降低(P0.05)。结论:miR-337可促进结肠癌细胞自噬,抑制其迁移能力,其机制可能与靶向抑制p53表达有关。     

虫草素通过ERK1/2、Ezrin和Akt信号通路抑制胆囊癌细胞SNU-308的增殖和迁移

目的:探讨虫草素对胆囊癌细胞SNU-308增殖和迁移的影响及其分子机制。方法:MTT法和平板集落形成实验检测不同浓度虫草素对胆囊癌SNU-308细胞活力和集落形成能力的影响;Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡率;Western blot法检测细胞凋亡和自噬相关蛋白以及Akt、ERK1/2和Ezrin蛋白的磷酸化水平;免疫荧光染色法检测细胞内LC3的表达水平;划痕愈合实验和Transwell实验检测虫草素对胆囊癌细胞迁移能力的影响;划痕实验检测Akt抑制剂和ERK1/2抑制剂及Ezrin基因沉默对细胞迁移能力的影响。结果:虫草素可显著抑制胆囊癌细胞的活力和集落形成能力(P0.05)。流式细胞术结果显示,虫草素可诱导胆囊癌细胞凋亡(P0.05)。Western blot结果显示,虫草素处理后Bcl-2表达降低,Bax、细胞色素C(Cyto C)、Fas、Fas L和cleaved caspase-3蛋白水平升高,自噬标识蛋白LC3-II/I比例和beclin 1表达上调(P0.05)。免疫荧光染色结果显示,虫草素处理后SNU-308细胞胞浆中LC3荧光颗粒的数量明显增多。划痕实验和Transwell实验结果显示虫草素可抑制细胞迁移(P0.05)。虫草素明显抑制Akt、ERK1/2和Ezrin蛋白的磷酸化水平(P0.05)。Ezrin基因沉默及Akti-1/2和GDC-0994均可抑制胆囊癌细胞的迁移作用(P0.05)。结论:虫草素通过诱导凋亡和自噬抑制胆囊癌细胞的增殖和迁移,其机制可能与调控ERK1/2,Ezrin和Akt信号通路有关。     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA诱导人乳腺癌细胞凋亡及自噬

目的 探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古霉素(TSA)对人乳腺癌细胞凋亡及自噬的作用及其可能的分子机制。方法采用MTT法检测T47D细胞的增殖能力;流式细胞术检测细胞凋亡的变化;Western blot法检测凋亡及自噬相关蛋白的表达。结果 TSA对人乳腺癌细胞T47D具有增殖抑制作用(P0.05);TSA诱导T47D细胞发生凋亡,下调BCL-2/Bax比值,上调Caspase-3的表达(P0.05);同时自噬相关蛋白LC3B及Beclin-1的表达也明显增加(P0.05,P0.01)。结论 TSA体外能抑制乳腺癌细胞的增殖,其机制与诱导细胞凋亡和自噬作用有关。     

髓样细胞表达的触发受体1抑制LPS应激下巨噬细胞的自噬

目的　观察髓样细胞表达的触发受体1（TREM-1）对脂多糖（LPS）应激下巨噬细胞自噬相关基因表达的影响。 方法　观察LPS应激下的巨噬细胞TREM-1蛋白的表达。分别选用TREM-1的激动剂（MAB1187）和TREM-1的拮抗剂（LR12）作用于巨噬细胞,利用qPCR检测巨噬细胞自噬相关基因ATG7、ATG5、ATG12及自噬标志蛋白微管相关蛋白1轻链3（LC3）mRNA的表达;采用Western Blot检测巨噬细胞TREM-1、LC3Ⅱ/Ⅰ、ATG7蛋白的表达;采用免疫荧光检测在LPS应激与TREM-1激活的情况下,巨噬细胞的自噬标志蛋白LC3表达。 结果　LPS（400 ng/mL、1000 ng/mL）应激下巨噬细胞TREM-1蛋白表达明显增加;LPS（1000 ng/mL）作用巨噬细胞24 h,巨噬细胞TREM-1蛋白表达达到峰值。LPS应激的巨噬细胞自噬基因ATG7、ATG5、ATG12及自噬标志分子LC3 mRNA表达均降低;当给予TREM-1拮抗剂后,巨噬细胞的ATG7、ATG5、ATG12、LC3 mRNA表达均升高,而采用TREM-1激动剂后,自噬基因表达被抑制。Western Blot检测结果显示,TREM-1可抑制LPS应激下巨噬细胞LC3 Ⅱ/Ⅰ、ATG7蛋白的表达。免疫荧光检测表明TREM-1激动剂可使巨噬细胞胞内的LC3蛋白表达量减少。 结论　巨噬细胞胞膜上TREM-1激活后,可使巨噬细胞自噬减弱,提示LPS应激下的巨噬细胞TREM-1可能通过抑制巨噬细胞的正常自噬从而发挥炎症放大作用。     

抑制自噬促进MK-2206诱导SGC-7901胃癌细胞发生DNA损伤

目的:探讨蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)抑制剂MK-2206对胃癌细胞SGC-7901DNA损伤的影响。方法:不同浓度的MK-2206作用于SGC-7901细胞后,免疫荧光检测细胞内DNA损伤标记分子磷酸化组蛋白H2AX(γ-H2AX)焦点的生成,Western blot检测DNA损伤相关蛋白的表达水平,同时观察MK-2206对自噬标志蛋白LC3-II表达量的影响,用以确定MK-2206是否促进细胞发生自噬。结果:MK-2206能够诱导SGC-7901细胞发生DNA损伤,促进细胞内γ-H2AX焦点生成,并且激活DNA损伤相关蛋白的表达;MK-2206作用细胞后,LC3-II的生成增加;抑制细胞的自噬显著增强了MK-2206诱导的H2AX磷酸化水平。结论:Akt抑制剂MK-2206能够诱导细胞发生DNA损伤和自噬,抑制自噬促进了MK-2206诱导的DNA损伤。