乙型肝炎病毒基因组nt531位突变特异性聚合酶链反应

目的:为调查国内乙型肝炎病毒(HBV)nt531位变异株的流行情况提供方法学。方法:根据已知的HBV基因组序列并结合国内主要流行adr和adw亚型的特点,合成在nt531位分别为C、G和T的3种不同引物,建立了突变特异性聚合酶链反应(msPCR)方法。结果:利用msPCR对10个乙型肝炎疫苗免疫失败儿童体内扩增的HBV S基因片段进行了初步检测,表明该法可分别特异性扩增nt531为C、G或T的HBV DNA,并可推测nt531为A的HBV DNA。结论:该法是鉴定HBV基因组nt531位变异株的有效方法之一。     

四川省德阳地区慢性乙型肝炎病毒感染者病毒基因型的分布与临床意义

根据HBV全基因组序列差异≥8％或S基因序列差异≥4％,将HBV分为A～I 9个基因型[1-2].HBV基因型呈明显的地域分布,甚至在同一个国家的不同地区基因型分布也有差异;不同HBV基因型在病毒生物学特性方面有各自的特点,与HBV感染相关疾病的进展及预后显著相关,并且与IFNα抗病毒疗效之间也存在一定关系.为此,四川省德阳市人民医院感染科应用型特异性引物PCR法,分析了德阳地区608例慢性HBV感染者的HBV基因型分布并探讨其临床意义.     

乙型肝炎病毒基因型(A-F)多引物PCR分型法的初步建立

目的：建立一种简便易行的乙型肝炎病毒基因分型方法（只需PCR）。方法:对GenBank中查获的114例HBV全序列进行比较分析，找出每种基因型相对于其他5种基因型的独特序列，并根据这些独特序列设计出6对分别针对A－F基因型的特异引物。用这6对引物分别对标本进行PCR，根据阳性结果判断出标本的基因型。进一步简化该方法，用多引物对PCR法（PCR with several primer sets in a single tube,Multiplex PCR)将B，C，D3种基因型的特异引物混合进行PCR，根据扩增片断的大小判断基因型。用此方法对已鉴定的B，C，D型标本进行比较和验证。结果：单引物对PCR与多引物对PCR的分型结果一致，且与以前用PCR－RFLP法的分型结果一致。结论：用多引物对PCR分型法准确易行，灵敏性高，便于推广应用。     

乙型肝炎病毒基因型S基因PCR-RFLP分型方法的建立

目的 建立乙型肝炎病毒（HBV）S基因聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）的基因型分型方法并验证其准确性。方法 比较GenBank中HBV223株各基因型全序列的S基因氨基酸及核苷酸序列,设计限制性内切酶BsrⅠ、StyⅠ、DpnⅠ和HpaⅡ鉴别HBVA-F基因型的方法,选择经前SPCR-PFLP的方法已鉴定出的HBVB、C和D基因型标本各30例,用此方法鉴定验证,并随机对HBVB、C和D基因型各3株标本进行S基因测序证实。结果 两种PCR-RFLP及S基因测序鉴定HBV基因型结果一致。结论 S基因PCR-RFLP的方法能够准确鉴定HBV基因型,此方法灵敏性高,特异性强,且酶切图谱简明单一,易于识别,适宜于HBＶ基因型的流行病学调查。     

天津地区乙型肝炎病毒基因型分布及其与临床的关系

根据乙型肝炎病毒(HBV)全基因组序列差异≥8%或S基因序列≥4%,可将HBV分为A～H 8个基因型.不同基因型的产生反映了HBV变异进化的特点.目前有很多研究显示,HBV基因型与病情轻重有较密切的关系.本研究用S基因序列测定法对天津地区223例HBV DNA阳性的乙型肝炎患者进行基因分型,并分析其与临床的相关性.     

用随机引物多态性DNA聚合酶链反应鉴别新的裂体吸虫X

目的 鉴定新的裂体吸虫X的基因组DNA。方法 应用随机引物多态性DNA聚合酶链反应（RAPD-PCR）对裂体吸虫X（S.X）和日本血吸虫（S.j）的基因组DNA进行分析鉴别。感染了S.X和S.j尾蚴的兔45d后杀死，各取成虫50条，磨碎，用苯本分氯仿抽提法提取基因组DNA。反应在PCR扩增仪上进行，应用29个随机引物，1.4%琼脂糖凝胶电泳后观察、照相。结果 29个引物中2个引物，J01碱基CCCGGCATAA和L12碱基GGGCGGTACT的扩增产物在两者间显示出明显的差异带。引物J01S.X特异性条带1条，S.j特异性条带1条。引物L12S.X特异性条带3条，S.j特异性条带1条。结论 S.X和S.j的基因组DNA在J01和L12的6个位点的序列有所不同，出现了差异带，这在种间进化方面有鉴别价值。     

乙型肝炎患者HBV X蛋白特异性CTL表位变异分析

目的 比较急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎与慢性重型乙型肝炎HBV X 蛋白特异性CTL表位变异差异,探讨乙型肝炎重症化和慢性化的可能机理.方法 对393例乙型肝炎患者的血清样本进行HLA-A2分型;用巢式PCR扩增血清HBV前S/S基因与X基因并对PCR产物进行序列测定;根据HBV前S/S基因序列,用VirusBlast软件鉴定患者感染的HBV基因型;用Vector NTI软件对目前已知的6个HLA-A2限制性X蛋白特异性CTL表位序列分析,对患者各个表位变异的差异进行卡方检验.结果 190例(48.35%)患者HLA-A2阳性,其中急性乙型肝炎(AHB)67例,慢性乙型肝炎(CHB)52例,慢性重型乙型肝炎(CSHB)71例.CTL表位变异分析结果如下:对三组所有患者进行比较时,X92-100表位变异发生频数三组患者比较有非常显著性差异(P＜0.01);对三组中HBV C基因型患者进行比较时,X92-100和X115-123表位变异发生频数三组患者比较有显著性差异(P＜0.05);对三组中HBV B基因型患者进行比较时,各表位变异发生频数三组患者比较无显著差异.结论 某些HBV X蛋白特异性CTL表位在AHB、CHB和CSHB患者间变异有明显差异且受病毒基因型影响,CTL表位变异可能与乙型肝炎的重症化和慢性化机制相关.     

乙型肝炎病毒基因的型特异引物结合型特异核苷酸分析

目的 研究HBV感染者HBV基因型分布状况,并建立一套适合HBV病毒株分型的简便可靠的分析方法.方法 通过对GenBank中全部S区基因序列(1000余条)进行比对,筛选A～H 8个基因型的型特异核苷酸.采用型特异引物PCR法分型,对238例慢性乙型肝炎患者所感染病毒中未能分型的病毒株再进行S区基因巢式PCR扩增、测序筛选出其特异性核苷酸从而判定其基因型.结果 238株HBV均得到分型.其中B型HBV感染者159例(男120例、女39例);C型69例(男52例、女17例);B+C混合型6例(男4例、女2例),B+D混合型4例(男3例、女1例).B型、C型、B+C和B+D昆合型检出率分别为66.8%、28.9%、2.5%和1.6%.未检出A、E、F、G、H基因型.结论 HBV感染以B、C基因型为主,B基因型高于C基因型.少数患者为B+C或B+D混合型感染.B、C基因型分布与性别无关(χ2=0.794,P＞0.05).     

厦门市乙型肝炎患者病毒基因型的分析

目的:采用多对型特异性引物,通过巢式PCR法检测厦门市乙型肝炎患者血清中乙型肝炎病毒(HBV)基因型的分布情况.方法:收集250例HBV感染患者血清,提取血清中HBV DNA作为模板,设计HBV前S1基因和S基因中区域内设计出10条内外引物,并将其中8条型特异性内引物分成A,B两组,分别扩增A,B,C和D,E,F型HBV,然后将第2轮PCR产物以用30g/L琼脂糖进行电泳,根据PCR产物电泳显示的产物长度判定HBV基因型,以了解厦门HBV基因型分布情况.结果:共120例确定了HBV基因型.患者群中慢性乙型肝炎90例,占75.0%,急性乙型肝炎、肝炎肝硬化、原发性肝癌分别占5.8%(7/120)、6.7%(8/120)和12.5%(15/120).分型结果:B型58例(48.3%)、C型30例(25.0%),B/C混合型32例(26.7%).HBeAg阳性患者中B基因型占63.8%,B/C型混合感染21.9%;抗-HBe阳性患者中以B/C型混合感染68.8%,B型25.9%,HBeAg阳性组与抗-HBe组之间比较发现B型和B/C混合型之间(P<0.05).结论:厦门乙型肝炎患者HBV基因型以B型为主,B/C混合感染是一个值得重视的问题.     

两种新发现的乙型肝炎病毒/C基因亚型的鉴定

目的 了解我国西部新发现的两种HBV C/D基因型重组体的基因型特点.方法 采用PCR对来自我国西部地区的17株HBV全基因组序列进行扩增,并利用生物信息学软件对其全基因组结构、遗传距离及重组位点进行分析.结果 两种HBV C/D基因型重组体与HBV基因型A、B、D、E、F的异质性>8%,而与C基因型的异质性为3.8%～8.0%.进化树分析发现,所有C/D重组体与基因型C形成一个大分支,但又独立于C基因型的其他5种哑型而形成明确的另外两个分支,即两个新的HBV/C基因亚型.结论 两种HBVC/D重组体从遗传距离分析属于与C1～C5亚型不同的新的HBV/C基因亚型.     

A novel hepatitis B virus genotyping system by using restriction fragment length polymorphism patterns of S gene amplicons

AIM: Traditional hepatitis B virus (HBV) genotyping methods using restriction fragment length polymorphism (RFLP) can reliably identify genotypes A to F. As HBV genotypes G and H have been recently identified, this study was to establish an accurate and simple genotyping method for all eight HBV genotypes (A to H).METHODS: Two hundred and forty HBV small S sequences obtained from GeneBank were analysed for restriction enzyme sites that would be genotype-specific. Restriction patterns following digestion with restriction enzymes BsrⅠ, StyⅠ, DpnⅠ, HpaⅡ, and EaeⅠ, were determined to identify all eight HBV genotypes. Mixed genotype infections were confirmed by cloning and further RFLP analysis.RESULTS: The new genotyping method could identify HBV genotypes A to H. Genotypes B and C could be determined by a single step digestion with BsrI and StyI in parallel. This was particularly useful in the Far East where genotypes B and C are predominant. Serum samples from 187 Chinese HBV carders were analysed with this genotyping system, and the genotype distribution was 1.1% (2), 51.9% (97), 40.6% (76) and 4.8% (9) for genotypes A, B, C, and D, respectively. Mixed genotypes were found in only 3 patients (1.6%). Sequence data analysis confirmed the validity of this new method.CONCLUSION: This HBV genotyping system can identify all eight HBV genotypes. It is accurate and simple, and can be widely used for studies on HBV genotyping.     

C基因型HBV较B基因型HBV易引起肝炎慢性化的机制

目的探讨HBVC基因型较B基因型易引起肝炎慢性化的机制。方法从GenBank分别下载C基因型和B基因型小S蛋白的氨基酸序列（即HBsAg），用CLustalW2．0生物软件分别比较C基因型和B基因型小S蛋白氨基酸序列的相似性；用神经网络的方法预测同基因型不同的小S蛋白氨基酸序列之间的T细胞表位的差异。结果通过分别比较C基因型和B基因型小S蛋白的氨基酸序列的相似性，C基因型小S蛋白的氨基酸序列之间的相似性为（90～100）％，B基因型小S蛋白的氨基酸序列之间的相似性为（94～100）％；同基因型不同的小S蛋白氨基酸序列之间的T细胞表位存在明显差异。结论C基因型小S蛋白的氨基酸序列之间较大的变异和同基因型不同的小S蛋白氨基酸序列之间的T细胞表位的差异可能是HBVC基因型较B基因型易引起肝炎慢性化的原因或部分原因。     

基因芯片技术检测西藏拉萨地区的乙型肝炎病毒基因型

目的:研究西藏拉萨地区乙型肝炎病毒基因型的分布与特点.方法:采集92份西藏拉萨地区乙型肝炎患者的血清,参照GenBank中HBV DNA序列设计寡核苷酸探针并制备HBV基因分型芯片,利用套式PCR扩增HBV S基因部分片段,结合基因芯片、DNA测序和BioEdit软件进行基因分型检测,并对其与乙肝标志物、DNA含量、性别和民族之间的关系进行分析.结果:在92例血清标本中,套式PCR检测73例HBV DNA阳性可进行基因分型检测.其中B型13例(17.8%),C型18例(24.7%),D型39例(53.4%)和B/D混合基因型3例(4.1%).统计学分析3种基因型分布在不同乙肝标志物阳性、不同DNA含量和不同性别之间无差异,但与民族存在统计学差异(x~2=7.179,P<0.05).B型以汉族为主(9/13),而C、D型以藏族为主(12/18、28/39).将基因芯片分型的B、C、D型和B/D混合型进行DNA序列分析,表明两种分型方法的结果完全一致.结论:PCR结合基因芯片技术可用于HBV基因分型.西藏拉萨地区HBV基因型包括B、C、D和B/D混合型,其中以D型为主.     

乙型肝炎病毒S基因限制性片段长度多态性分型方法的建立及应用

目的 建立乙型肝炎病毒(HBV)S基因片段聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(RFLP)的基因分型方法并用于基因型与临床疾病谱关系的研究。 方法 比较GenBank中124株各基因型HBV全序列的S基因核苷酸序列及13株单独S基因序列,设计利用限制性内切酶Mbo Ⅰ、BsTN Ⅰ、BsmA Ⅰ、HpaⅡ酶切S基因片段鉴定HBV基因型(A-F)的方法。对贵州地区176份乙型肝炎患者血清进行基因分型并分析基因型与疾病谱的关系。直接测序2份B型和3份C型毒株的PCR扩增产物,以验证本酶切分型方法的正确性。 结果 测序结果证明本方法能够准确鉴定基因型。在176份标本中,B型100份(56.8％),C型76份(43.2％),未发现其他基因型。B型中无症状携带者(ASC)比例(40.0％)高于C型(15.8％),x2=12.16,P<0.005;慢性中度比例(14.0％)低于C型(31.6％),x2=7.88,P<0,005。 结论 本S基因片段PCR-RFLP基因分型方法简便、准确。贵州地区存在HBV B和C基因型。     

全长乙型肝炎病毒基因组的扩增及序列分析

目的 建立一种全长乙型肝炎病毒(HBV)基因组扩增及序列分析的新方法。方法 在HBV负链开环缺口处设计引物，使用TaKaRa LA Taq^TM DNA聚合酶进行扩增，聚合酶链反应产物克隆后进行全长序列测定。结果 用此方法成功获得HBV全基因组DNA序列。将已知序列的HBV全基因组重组质粒作为模板进行敏感性和保真性测定，其敏感性为10^2个初始模板，核苷酸的人为突变率为1．2bp／kb。结论 此方法可用于大规模HBV全基因组扩增和序列分析，为HBV的基础和临床研究提供了一种新方法。     

乙型肝炎病毒逆向点杂交基因分型法建立及应用

目的 利用逆向点杂交技术建立乙型肝炎病毒(HBV)基因分型新方法，通过对HBV DNA阳性血清抽样标本进行基因分型，了解佛山地区HBV基因型分布状态。方法 以HBV基因组的X区序列为主设计分型引物与探针，将活性氨基标记的探针依次固定在尼龙膜上，制成检测膜条。用标记生物素的引物进行HBV DNA扩增，将扩增产物与检测膜条杂交，以POD与TMB显色，判断基因分型结果，通过与基因测序结果比较确定新方法的有效性。从佛山地区HBVDNA阳性患者血清中随机抽取300份，用新建方法进行HBV基因分型检测。结果 新建HBV逆向点杂交基因分型方法可对拷贝数在10^3～10^9／ml之间的300份HBV DNA阳性抽检血清进行基因分型，发现B型147例，占49.0％；C型136例，占45．3％；D型1例，占0．3％；B、C混合型12例，占4．0％；C、D混合型4例，占1．3％；未发现A、E和F型。新方法基因分型结果与测序结果一致。结论 利用逆向点杂交技术可以准确有效和简便经济的进行HBV基因分型，适用于临床检测与流行病学研究；在佛山地区，人群中感染的HBV以B、C型为主。     

乙型肝炎病毒表面抗原一级结构多态性的初步研究

目的 研究慢性乙型肝炎患者体内乙型肝炎病毒（HBV）表面抗原一级结构的多态性。方法 设计特异性引物，自7例慢性乙型肝炎患者血清中扩增S基因全长或全基因组片段，TA克隆法克隆到T载体中，随机选择克隆测序。结果 共20个克隆被测序。20个克隆全S蛋白的总一致率仅为32．0％，13株全长为401氨基酸残基的克隆氨基酸一致效率为82．5％。患者血清中发现2株克隆编码截短型表面抗原中蛋白，在前S1或前S2的免疫决定区或可能的肝细胞结合部位均发现缺失突变。结论 慢性乙肝患者体内存在HBV准种群，病毒编码的截短型表面抗原中蛋白可为HBV诱导原发性肝癌提供一种途径，应加强对HBsAg一级结构多态性的研究。