Inhibition of proliferation of human breast cancer MCF-7 cells by small interference RNA against LRP16 gene

Objective: Our previous studies have firstly demonstrated that 17β-E2 up-regulates LRP16 gene expression in human breast cancer MCF-7 cells, and ectopic expression of the LRP16 gene promotes MCF-7 cells proliferation. Here, the effects of the LRP16 gene expression on growth of MCF-7 human breast cancer cells and the mechanism were further studied by establishing two stably LRP16-inhibitory MCR-7 cell lines. Methods: Hairpin small interference RNA (siRNA)strategy, bY which hairpin siRNA was released by U6 promoter and was mediated by pLPC-based retroviralvector, was adopted to knockdown endogenous LRP16 level in MCF-7 cells. And the hairpin siRNA against green fluorescence protein (GFP) was used as the negative control. The suppressant efficiency of the LRP16 gene expression was confirmed by Nothern blot.Cell proliferation assay and soft agar colony formation assay were used to determine the status of the cell sproliferation. Cell cycle checkpoints including cyclin E and cyclin D1 were examined by Western blot. Results:The results from cell proliferation assays suggested that down-regulation of LRP16 gene expression is capable of inhibiting MCF-7 breast cancer cell growth and down-regulation of the LRP16 gene expression is able to inhibit anchorage-independent growth of breast cancer cells in soft agar. We also demonstrated that cyclin E and cyclin D1 proteins were much lower in the LRP16-inhibitory cells than in the control cells.Conclusion: These data suggest that LRP16 gene play an important role in MCF-7 cells proliferation by regulating the pathway of the G1/S transition and may function as an important modulator in regulating the process of tumorigenesis in human breast.     

靶向人Pokemon基因的shRNA重组质粒的构建

目的构建靶向Pokemon基因的短发夹RNA（shRNA）真核表达载体,为研究Pokemon基因在肿瘤发生发展中的作用奠定基础。方法利用基因重组技术,依据siRNA的设计原则,针对目的基因的mRNA序列筛选了3对siRNA序列以及一对阴性对照序列,将其分别插入真核表达载体psiRNA-hHlneo H1启动子下游,经α互补筛选、酶切和DNA测序鉴定,构建靶向Pokemon基因的RNAi真核表达载体。结果酶切鉴定及DNA测序结果显示siRNA片断正确,与设计序列一致,且成功插入预定位点。结论靶向Pokemon基因的shRNA重组质粒成功构建,为进一步研究Pokemon基因在多种疾病中的作用以及探索肿瘤的基因治疗奠定基础。     

靶向人Pokemon基因的shRNA重组质粒的构建(英文)

Objective:The aim of this study was to establish the foundation for studying the role of pokemon gene in tumorigenesis and development by constructing recombinant plasmids that can express small interfering RNA(siRNA)targeting human Pokemon gene.Methods:Hairpin siRNA templates targeting Pokemon gene were synthesized and cloned into plasmid vector psiRNA-H1neo.Three vectors derived siRNAs(psiRNA1,2,3)and one mocking psiRNAc(as control)were con- structed.The recombinant Pokemon siRNA plasmids were constructed...     

miR-374过表达增强人乳腺癌细胞对多西他赛的耐药性

目的:观察miR-374过表达对人乳腺癌MDA-MB-231细胞docetaxel(多西他赛)耐药性的影响。方法:qPCR检测miR-374过表达细胞MDA-MB-231-miR-374和对照细胞MDA-MB-231-Cherry中miR-374的相对含量;采用不同浓度的多西他赛处理细胞72小时后,MTT检测细胞的活性。在终浓度为3.2nmol/L的多西他赛处理下,用平板克隆实验检测MDA-MB-231-Cherry和MDA-MB-231-miR-374细胞的增殖能力。流式细胞术检测细胞周期和凋亡。结果:与MDA-MB-231-Cherry细胞相比,miR-374过表达细胞MDA-MB-231-miR-374中miR-374的相对表达量明显增高;MDA-MB-231-miR-374细胞的耐药性和克隆形成能力明显增强(P<0.05)。细胞凋亡率明显降低,G0/G1期细胞减少,S期细胞增加,G2/M期细胞增加。结论:miR-374过表达可明显增强乳腺癌细胞株MDA-MB-231对多西他赛的耐药性。     

miRNA干扰Pokemon基因对大肠癌细胞增殖的影响及机制

目的 探索miRNA干扰Pokemon基因后对大肠癌细胞系LoVo增殖和细胞周期的作用.方法 构建靶向Pokemon基因的miRNA重组质粒并转染LoVo细胞,设重组质粒组、阴性对照质粒组和脂质体空白对照组,运用实时荧光定量PCR(QPCR)检测干扰后LoVo细胞中Pokemon mRNA的表达,MTT法和流式细胞仪技...     

siRNA沉默hTERT基因表达对人乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的应用小干扰RNA（small interferingRNA，siRNA）抑制乳腺癌MCF-7细胞hTERT的表达，探讨其对乳腺癌细胞增殖和凋亡的效应。方法体外化学合成针对hTERT基因的siRNA序列，在脂质体介导下转染MCF-7细胞，实时定量PCR检测hTERTmRNA表达水平，Westernblot检测hTERT蛋白表达水平，流式细胞仪检测细胞凋亡状况，MTT法检测细胞增殖活性，平板克隆形成实验检测克隆形成率。结果所设计的3对针对不同靶点的siRNA与对照组相比均可有效抑制hTERT的表达，hTERTsiRNA转染MCF-7细胞48h后，siRNAl-siRNA3组hTERTmRNA表达分别为（35．3±4．2）％、（30．7±2．8）％、（31．3±3．6）％，与阴性对照组（96．4±2．8％）相比，差异有统计学意义。MTT结果显示MCF-7细胞增殖能力显著降低，转染48h后，siRNAl～siRNA4细胞抑制率分别为（57．6±3．6）％、（61．3±4．3）％、（65．6±6．3）％和（3．1±4．5）％，细胞克隆形成能力下降，凋亡率明显增加。结论体外化学合成的hTERTsiRNA可以有效地抑制MCF-7细胞hTERT的表达，从而抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。     

RNA干扰对白血病细胞增殖与凋亡机制的探讨

目的 尾侧同源盒基因(caudal tupe homeobox gene 2,CDX2)是早期胚胎生长发育过程中重要的调节因子,近年来有研究证实CDX2基因在造血细胞增殖分化过程中亦发挥重要作用.本研究采用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术沉默白血病K562细胞中CDX2的表达,探讨该基因沉默前后对白血病细胞增殖和凋亡的影响,为白血病的临床治疗提供理论依据.方法 设计合成针对目的基因CDX2不同编码区的3个小干扰RNA序列(CDX2-siRNA-1443,CDX2-siRNA-2009,CDX2-siRNA-921)及阴性对照序列(CDX2-siRNA-NC),将各组siRNA分别转染K562细胞,同时设未转染K562细胞组作为对照,采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)法及蛋白质印迹法检测CDX2 mRNA和蛋白的表达量变化,筛选对目的基因CDX2沉默效率最高的siRNA序列,用于下一步实验.MTT法、Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术检测转染前后细胞增殖和凋亡变化.结果 RT-PCR结果显示,与未转染K562细胞组相比,3组CDX2-siRNA均能有效沉默K562细胞内CDX2 mRNA表达,其中CDX2-siRNA-921对CDX2 mRNA沉默效率最高(66.2％),差别有统计学意义,P＜0.05.蛋白质印迹法结果显示,CDX2-siRNA-921组CDX2蛋白相对表达量与未转染K562细胞组相比降低最明显(68.0％,P＜0.01),该结果与RT-PCR结果相符.MTT法显示,转染CDX2-siRNA-921组细胞存活率明显低于未转染K562细胞组,而转染CDX2-siRNA-NC组细胞存活率无明显变化,提示转染CDX2-siRNA-921能够明显抑制细胞增殖.流式细胞术结果显示,与CDX2-siRNA-NC组和正常细胞组相比,转染CDX2-siRNA-921组细胞凋亡率显著增加.结论 CDX2 siRNA能够有效抑制白血病细胞K562中CDX2的表达,使细胞增殖减弱、凋亡增加,有望为白血病临床治疗提供新的基因靶点和治疗方法.     

RNA干扰人胃癌BGC-823细胞中DNA聚合酶β基因表达的初步研究

目的 研究RNA干扰DNA聚合酶β(polβ)基因对人胃癌BGC-823细胞生物学行为的影响.方法 针对DNA polβ基因序列构建小干扰RNA(siRNA)真核表达载体,用脂质体介导转染人胃癌BGC-823细胞,G418筛选出稳定细胞株;采用荧光定量PCR和Western blot测定各组细胞的DNA polB mRNA和蛋白表达水平;用流式细胞术和裸鼠体内成瘤检测各组细胞的增殖情况.结果 成功构建了针对polβ基因的siRNA表达载体.转染pol β靶向siRNA的BGC-823细胞,其polβmRNA和蛋白表达水平均明显降低,且载体pRNAT-U6.l-sipoβ2(抑制程度83%)的沉默抑制作用强于载体pRNAT-U6.l-sipolβl(抑制程度56%);与无关siRNA对照组、空载体对照组和空白对照组相比,转染pRNAT-U6.1-sipellM的细胞G0/G1期比例显著升高,S期比例及细胞增殖速度显著下降(P<0.05);转染pRNAT-U6.l-sipolβ2的细胞C0/C1期比例显著降低,S期比例及细胞增殖率显著升高(P<0.05).结论 靶向DNA polβ的siRNA可以显著抑制polβ的表达;polβ的高表达和近乎完全抑制的超低水平表达都不利于维持细胞的生理状态;通过siRNA将BGC-823细胞中polβ表达沉默到合适的低水平,可能对肿瘤的生长起到抑制作用.     

X射线对人肺癌细胞Pokemon表达影响

目的 研究不同剂量X射线照射及照射后不同时间点对体外培养的人肺癌A₅₄₉细胞系Pokemon基因和蛋白表达的影响。方法 用X射线2、4、6、8 Gy吸收剂量照射体外培养的A₅₄₉细胞系,分别采用荧光实时定量PCR技术和蛋白印记法检测A₅₄₉细胞照射后2、4、8、12、24、48 h的Pokemon mRNA和蛋白表达水平,以未照射组为对照。采用二苯基四氮唑溴盐法分别检测2 Gy照射1、2、3、4、5 d后A₅₄₉细胞增殖能力变化,以未照射组为对照。结果 Pokemon mRNA的表达在2、4、6、8 Gy照射后早期呈降低趋势,但晚期呈升高趋势,大部分时间点差异有统计学意义(t=3.40~154.76,P=0.000~0.041);Pokemon 蛋白的表达较对照组均升高,且各剂量组均在照射后8 h达峰值,在大部分时间点实验组与对照组差异有统计学意义(t=4.18~89.64,P=0.000~0.039)。照射组细胞接种后第3~5天细胞增殖能力显著低于对照组(t=2.34~18.19,P=0.000~0.040)。结论 一定剂量X射线在特定条件下可诱导人肺癌A₅₄₉细胞Pokemon mRNA和蛋白表达升高,可能与A₅₄₉细胞辐射抗性有关。     

小分子干扰RNA抑制TNC基因的表达并逆转卵巢癌紫杉醇耐药

目的 研究小分子干扰RNA(siRNA)介导的RNA干扰(RNAi)对卵巢癌紫杉醇耐药细胞TNC基因表达的影响,探讨TNC基因在紫杉醇耐药中的功能.方法 用脂质体转染剂LipofectamineTM2000将针对TNC基因特异性合成的siRNA转染SKOV3/TAX30细胞,分别在转染后24、48、72 h收集细胞,检测各组细胞TNC mRNA和TNC蛋白的表达水平.siRNA转染SKOV3/TAX30细胞后,采用MTT法检测细胞对紫杉醇的半数抑制浓度(IC50).Western Blot检测SKOV3/TAX30及SKOV3/TAX300两种耐药细胞Wnt信号通路中关键蛋白β-catenin及下游Cyclin D、E-cadherin蛋白的表达.结果 siRNA转染SKOV3/TAX30细胞24、48、72 h后,TNC mRNA和TNC蛋白表达水平均下降,SKOV3/TAX30细胞对紫杉醇药物的IC50下降.TNC表达升高的耐药细胞中,Wnt信号通路中关键蛋白β-catenin及下游Cyclin D蛋白表达上调,E-cadherin蛋白表达下调.结论 针对TNC基因特异性合成的siRNA可激发RNAi介导的TNC沉默,并且逆转了紫杉醇化疗耐药,TNC表达上调与紫杉醇耐药相关,TNC可能通过Wnt信号通路的激活参与了化疗耐药.     

利用RNA干扰技术分析Pokemon对Lovo增殖过程的影响

目的 探索干扰Pokemon基因对大肠癌细胞系Lovo增殖和细胞周期的影响。方法 采用miRNA技术干扰Pokemon基因不同位点,运用q-PCR检测干扰后Lovo细胞中Pokemon mRNA的表达,MTT和流式细胞仪分析转染后细胞增殖和细胞周期的变化。结果 成功构建含miRNA片段的重组质粒,依次命名为mR22-1、2、3、4。转染Lovo细胞后,Pokemon基因的mRNA表达水平明显下调,以mR22-1最强,干扰效率为50%±2.7%,对照组之间有统计学意义(P＜0.01)。MTT显示mR22-1可明显抑制细胞增殖,24 h、48 h和72 h的抑制率分别为23%±2.1%、47%±3.0%和69%±2.5%,呈时间依赖性;流式细胞仪测定转染后Lovo细胞周期阻滞在G₁期。结论 采用RNAi技术可以特异性阻断Pokemon基因的表达;Pokemon基因有促进大肠癌细胞株Lovo增殖的作用。     

组蛋白去乙酰化酶1siRNA转染对Hela细胞的抑制

Objective:To investigate the anti-proliferative effect of histone deacetylases-1(HDAC-1)knockdown in Hela cells.Methods:The HDAC-1 protein was knockdowned using siRNA.The expression of HDAC-1 was detected by Western blotting.Apoptosis was assessed by flow cytometry.The inhibition of cell growth was assesses by MTT assay.Result:HDAC-1 siRNA knockdowned the expression of HDAC-1 protein.HDAC siRNA inhibited lhe proliferation of Hela cells.HDAC-1 siRNA induced apoptosis.Conclusion:HDAC-1 siRNA may inhibit the growth of Hela cells by inducing apoptosis.     

siRNA沉默 B7-H4 表达对人肺腺癌A549细胞增殖、侵袭和迁移的影响

目的:探讨靶向B7-H4基因的小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)对人肺腺癌细胞A549增殖、侵袭和迁移的影响。方法:体外化学合成B7-H4特异性siRNA(B7-H4-siRNA),转染A549细胞,MTT法、流式细胞术、Western blotting分别检测A549细胞的增殖、细胞周期,以及B7-H4和Cyclin D1蛋白的水平;Transwell实验检测A549细胞体外侵袭和迁移能力。结果:B7-H4-siRNA成功转染入A549细胞,Western blotting结果显示,B7-H4-siRNA转染抑制A549细胞中B7-H4和Cy-clin D1蛋白的表达。B7-H4-siRNA转染后A549细胞增殖活性明显下降,B7-H4-siRNA组A549细胞的倍增时间明显长于未转染组、Ctrl-siRNA组和转染试剂对照组[(33.78±0.26)h vs(28.69±0.18)、(27.32±0.13)、(26.93±0.19)h,P<0.05]。B7-H4-siRNA转染使A549细胞阻滞在G1期。B7-H4-siRNA组A549细胞的侵袭细胞数明显少于未转染组[(89.80±0.99)个vs(186.20±1.33)个,P<0.05]。B7-H4-siRNA组A549细胞的迁移细胞数明显少于未转染组、Ctrl-siRNA组和转染试剂对照组[(60.20±0.37)个vs(102.57±0.52)、(100.72±0.31)、(98.65±0.21)个,P<0.05〗。结论:B7-H4-siRNA能沉默A549细胞中B7-H4的表达,抑制A549细胞的增殖、侵袭和迁移,B7-H4可能成为肺癌基因治疗的候选靶点。     

应用RNA干扰技术抑制人膀胱癌细胞EGFR基因表达的研究

目的:应用RNA干扰(RNAi)技术抑制人膀胱癌细胞(BIU-87)EGFR基因的表达,探索采用该技术干预膀胱癌的可行性.方法:制备3个针对人EGFR基因的shRNA表达质粒,转染BIU-87细胞48 h后,RT-PCR及蛋白质印迹法检测EGFR基因的表达.结果:酶切及测序鉴定证实,3个shRNA表达质粒构建成功,将其...     

小干扰RNA沉默 TLR4表达对脂多糖促进人肺癌SPCA1细胞增殖的影响

目的:探讨Toll样受体4(TLR4)对脂多糖(LPS)促进人肺癌SPCA1细胞增殖的影响。方法:采用LPS(10μg/ml)刺激细胞,模拟慢性炎症的细胞微环境。将靶向TLR4基因的小干扰RNA(TLR4-siRNA)或阴性对照(NC-siRNA)通过脂质体介导转染人肺癌SPCA1细胞,24 h后加入10μg/ml LPS。按转染siRNA和加入LPS情况,实验分为不做任何处理的Control组、NC+10LPS组以及TLR4-siRNA+10LPS组。采用Real-time PCR和流式细胞术检测SPCA1细胞中TLR4 mRNA及蛋白的表达情况;采用CCK-8法和平板克隆形成实验检测细胞增殖能力,流式细胞术检测分析细胞周期分布情况。结果:与NC+10LPS组相比较,TLR4-siRNA+10LPS组细胞中TLR4 mRNA及蛋白的表达水平显著下降(P<0.01);与Control组和NC+10LPS组相比较,TLR4-siRNA+10LPS组SPCA1细胞的增殖明显减缓(P<0.01),TLR4-siRNA+10LPS组细胞克隆形成能力明显降低[(4.50±1.89)vs(13.33±1.81)、(15.75±1.25)个,P<0.01];TLR4-siRNA+10LPS组细胞周期阻滞于G0/G1期[(61.55±0.55)%vs(53.59±1.59)%、(51.72±0.77)%,P<0.01]。结论:TLR4-siRNA能有效沉默SPCA1细胞中TLR4的表达,能够阻滞细胞的生长,抑制细胞的增殖。     

siRNA干扰CHRNA5基因的表达抑制尼古丁对人肺癌细胞的促增殖作用

目的： 研究siRNA干扰尼古丁乙酰胆碱受体α5（cholinergic receptor nicotinic alpha 5, CHRNA5 ）基因表达后对尼古丁促人肺癌A549细胞增殖作用的影响。 方法： 设计并合成CHRNA5-siRNA片段,并经脂质体介导转染A549细胞。荧光定量PCR、Western blotting检测转染后A549细胞中 CHRNA5 mRNA和蛋白的表达,MTT法检测CHRNA5-siRNA对尼古丁促A549细胞增殖作用的影响。 结果： 成功构建了CHRNA5-siRNA并成功转染A549细胞。CHRNA5-siRNA转染组A549细胞的 CHRNA5 mRNA 表达量明显低于si-NC转染对照组（0.196±0.044 vs 0.944±0.027, P<0.01）,CHRNA5-siRNA转染组A549细胞的CHRNA5 蛋白表达量明显低于si-NC转染组（0.267±0.031 vs 0.745±0.035,P<0.01）。在无尼古丁作用时,CHRNA5-siRNA的转染不能抑制A549细胞的增殖。在尼古丁作用下,A549细胞增殖显著增加（P<001）,CHRNA5-siRNA转染可明显抑制尼古丁的促增殖作用（P<0.01）。 结论： siRNA下调肺癌A549细胞中 CHRNA5 的表达可以抑制尼古丁促细胞增殖作用, CHRNA5 可能是肺癌治疗的潜在靶点之一。     

RNA干扰沉默mdm2治疗骨肉瘤的实验研究

目的 观察靶向mdm2的小干扰RNA(siRNA)对骨肉瘤生长的影响.方法 构建PGCsilencerTM-mdm2 siRNA,转染至骨肉瘤细胞U2OS.应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot方法检测siRNA对mdm2的沉默效果,采用二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)法检测siRNA对细胞增殖的影响,应用流式细胞术检测诱导细胞凋亡的情况.通过裸鼠移植瘤模型观察siRNA对骨肉瘤体内治疗效果.结果 成功构建simdm2质粒.在转染simdm2的U20S细胞中,simdm2-1组和simdm2-2组的mdm2 mRNA表达量分别下降至空白对照组的35.6%和42.1%(P<0.05),mdm2蛋白表达分别降低至空白对照组的34.0%和47.2%(P<0.05),而且增殖能力显著降低,发生明显凋亡,simdm2-1组和simdm2-2组的细胞凋亡率分别为29.9%和20.9%.阴性对照组和空白对照组的差异无统计学意义.裸鼠移植瘤实验结果显示,simdm2转染组的肿瘤受到抑制,而且mdm2基因和蛋白表达明显下调.结论 simdm2能有效的抑制骨肉瘤生长,并抑制mdm2基因和蛋白的表达.     

Galectin-3表达抑制对BT-549细胞系增殖和凋亡影响观察

目的：观察抑制Galectin-3表达与BT-549细胞系增殖和凋亡的关系,探讨利用RNA干扰技术作为三阴性乳腺癌基因治疗方法的可行性。方法：设计并化学合成Galectin-3小干扰片段并顺势转染乳腺癌细胞系BT-549（为Galec—tin-3siRNA组）,以未转染细胞为空白对照,以转染阴性干扰为阴性对照,荧光倒置显微镜和实时定量PCR验证干扰结果,XTT方法观察干扰后24、48、72和96h各组细胞增殖吸光度（A值）,流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况,划痕实验和Tral2swell实验比较不同组间细胞迁移和侵袭情况,以上实验均重复3次。结果：空白对照组、阴性对照组和Galectin一3siRNA组Galectin-3mRNA相对含量分别为（0．078±0．003）、（0．069±0．004）和（0．015±0．001）,差异有统计学意义,F=486．97,P〈O．001。XTT法检测结果显示,同一组不同时间点之间差异有统计学意义,P值均〈O．00l;同一时间点各组之间差异亦有统计学意义,P值均〈O．001。随着时间推移,空白组和阴性对照组细胞继续生长,Galectin-3siRNA组细胞生长抑制,数量逐渐减少,干扰时间和实验分组之间存在交互效应,F=26．43,P〈0．001。流式细胞仪检测结果显示,Galectin-3siRNA组、空白对照组和阴性对照组凋亡率分别为（26．83±2．15）％、（2．73土0．18）％和（5．86土0．51）％,差异有统计学意义,F=24537．92,P〈0．00l。空白对熙组、阴性对照组和Galectin-3siRNA组愈合率分别为（91．47±4．39）％、（82．36土3．68）％和（52．26士1．95）％,差异有统计学意义,F=213．71,P〈0。001。转染Galectin-3siRNA的乳腺癌细胞浸润穿过Matrigel膜的细胞数（169．36±23．71）要比空白对照组（480．80土30．80）和阴性对照组（320．70±28．12）的细胞数显著减少,差异有统计学意义,F=115．20,P〈0．001。结论：Galectin-3siRNA成功转染入BT-549细胞,并抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,降低其迁移侵袭能力,为三阴性乳腺癌基因治疗提供实验依据。     

Rab25 siRNA对人卵巢上皮性癌细胞生长和增殖的作用

目的：通过RNA干涉抑制Rab25在人卵巢上皮性癌的过表达,观察Rab25基因的siRNA对肿瘤细胞的生长和增殖作用.方法：构建针对Rab25基因的siRNA重组质粒,稳定转染A2780细胞,通过RT-PCR检测Rab25的表达;MTT法观察细胞增殖,绘制细胞生长曲线;克隆形成实验检测肿瘤细胞的集落形成能力.结果：成功构建Rab25基因的siRNA,稳定转染靶细胞后可显著降低Rab25的表达,细胞生长速度减慢、增殖能力下降.结论：Rab25基因的siRNA对肿瘤细胞的抑制作用,为卵巢癌基因治疗开辟新途径.