瞬时转染和稳定转染对RNAi抑制乙型肝炎病毒S基因表达的影响

目的:构建针对乙型肝炎病毒(HBV)S基因的siRNA表达载体Psuper-S1和Psuper-S2,观察瞬时转染及稳定转染对RNAi抑制HBV基因表达作用的影响.方法:设计并合成针对HBV S基因的siRNA寡核苷酸,经退火形成双链后克隆入Psuper载体,构建成功的siRNA表达载体分别瞬时转染和稳定转染表达HBV的2.2.15细胞,对所得细胞上清中的HBsAg和HBeAg进行定量检测,RT-PCR检测siRNA对靶基因Mrna的抑制效果,并比较两种转染方式对RNAi抑制HBV基因表达作用的影响.结果:在稳定转染并经潮霉素筛选所得的单克隆细胞株中,Psuper-S1和Psuper-S2均能明显抑制HBsAg及HBeAg的分泌(P<0.01),抑制率分别为83%和78%,RT-PCR结果证实HBV的Mrna明显降低,而瞬时转染细胞在蛋白质水平上及Mrna水平上的结果则比稳定转染的结果逊色.结论:针对HBV S基因的siRNA能稳定、高效、特异地抑制HBV基因的表达,转染效率对于靶基因的RNA干涉作用有明显的影响.     

小干扰RNA分子对乙肝病毒复制的抑制作用研究

目的 筛选特异高效抗乙型肝炎病毒(HBV)的小干扰RNA分子(siRNA),评价其干扰效果.方法 在HepG2.2.15细胞内导入筛选的3条特异抗HBV的siRNA分子,用实时荧光定量RT-PCR的方法,检测干扰后HBV的mRNA表达水平;Western blot检测细胞上清中乙肝表面抗原(HBsAg),分析siRNA对HBV基因表达的抑制作用.结果 导入特异siRNA分子细胞中HBV的mRNA表达量明显降低(P＜0.05),上清中HBsAg含量显著减少.阴性对照细胞中HBV的mRNA含量和上清中HBsAg含量基本不变(P＞0.05).结论 所筛选的siRNA分子能特异性抑制HBV的mRNA和蛋白的合成.     

乙肝病毒X基因阻断降低肝癌细胞HepG2.215与纤维连接蛋白的黏附

目的探讨乙肝病毒X基因（HBX）在肝细胞癌（HCC）侵袭转移中的作用。方法利用psiRNA-hH1neo质粒,构建针对HBX的shRNA表达载体psiRNA1、psiRNA2、psiRNA3,转染肝癌细胞株HepG2.215,用荧光定量PCR仪检测siRNA对HBX mRNA表达的抑制作用,用Western blot法检测siRNA对HBX蛋白表达的抑制作用。以Transwell小室测定HepG2.215细胞与纤维连接蛋白（Fn）的体外黏附能力。结果成功构建shRNA表达载体,shRNA表达载体均可不同程度地抑制HBX的表达,其中psiRNA1对HBX的抑制作用最强,对HBX mRNA抑制率达80.27%,对HBX蛋白的抑制率为65.59%;细胞体外黏附能力受到明显抑制,在培养至48、72h后,对照组和转染组跨膜细胞数分别为442.6±57.1vs376.4±55.2和588.2±70.1vs513.6±68.5,两时相点均有明显差异（P〈0.05）。结论阻断HBX的表达可明显抑制肝癌细胞HepG2.215的体外侵袭性生长。     

乙型肝炎病毒 P区RNA干扰抑制2.2.15细胞乙型肝炎病毒表面抗原和e抗原分泌的实验研究

目的观察针对乙型肝炎病毒（HBV）P区基因的RNA干扰（RNAi）表达载体pGE—HBVP在HepG2．2．15（2．2．15）细胞中抑制HBV表面抗原（HBsAg）和e抗原（HBeAg）的分泌效应,以阐明HBVP区小干扰RNA（siRNA）抑制HBV复制和蛋白表达的影响。方法构建并鉴定pGE—HBVP,将此载体转染至完整HBV复制模型2．2．15细胞,用化学发光免疫检测法检测并分析转染后不同时间段细胞培养上清中HBsAg和HBeAg的含量变化,并用免疫细胞化学方法观察转染后细胞中HBsAg的表达变化。结果成功构建了5个针对HBVP区的RNAi表达载体pGE—HBVP1～pGE—HBVP5,其中pGE—HBVP1和pGE—HBVP2具有明显的HBsAg和HBeAg分泌抑制效应和表达抑制效应。抑制率最高的pGE—HBVP2在转染2．2．15细胞效率为30％～40％的基础上,转染后24、48、72和96h培养上清中的HBsAg分泌抑制率分别为28．88％、32．28％、29．10％和18．42％,HBeAg的分泌抑制率分别为38．33％、27．50％、33．41％和12．60％。细胞免疫细胞化学结果显示,pGE-1空载体转染后2．2．15细胞的HBsAg的表达阳性率约为82％,而pGE—HBVP2转染后2．2．15细胞的HBsAg的表达阳性率约为50％,和pGE-1空载体相比阳性率显著下降。结论针对HBVP区的RNAi可以抑制HBV病毒抗原的分泌和表达。     

抑制HBV复制的小干扰RNA的重组腺病毒构建与鉴定

目的构建可同时表达绿荧光蛋白（GFP）和针对HBVS区基因的小干扰RNA（siRNA）的重组腺病毒,并研究该siRNA在体外对HBV的抑制作用。方法采用PCR技术自质粒pEGFP-C1中扩增含CMV启动子的GFP表达框,自质粒pAVU6＋4sh579中扩增含U6启动子的针对HBV S 区579-597位基因的siRNA表达框,分别将两个表达框克隆至穿梭载体质粒pShuttle内,与质粒pADEasy-1在大肠杆菌BJ5183内进行同源重组,将阳性重组体DNA转染至人胚肾细胞株HEK293细胞中进行包装、扩增,并在HepG2.2.15细胞中初步观察其对HBV复制的抑制疗效。结果构建了可同时表达GFP和siRNA的重组腺病毒,其可在HEK293细胞中进行包装、扩增,并在HepG2.2.15细胞中对HBV-DNA、HBsAg和HBeAg的表达具有抑制作用。结论成功构建了可同时表达GFP和针对HBV的siRNA的重组腺病毒,并在体外实验中证实了其对HBV复制具有抑制作用。     

以S区为靶位的小干扰RNA抗乙型肝炎病毒的实验研究

目的以乙型肝炎病毒（HBV）S基因区为靶位,构建表达siRNA的质粒载体pSilencer3．1-H1hygro,体外观察siRNA抗HBV的效果。方法以HepG2．2．15细胞为靶细胞,利用脂质体Metafectene转染表达siRNA的质粒载体pSilencer3．1-H1hygro于细胞中,用时间分辨免疫荧光分析法（IFMA法）检测细胞上清中HBsAg和HBeAg,用定量聚合酶链反应（FQ—PCR）检测细胞上清DNA,用逆转录（RT）-PCR检测HBV mRNA。结果成功构建了表达siRNA的转录质粒载体,siRNA可抑制HBV的抗原表达和病毒复制,1、2、4μgsiRNA对HBsAg的抑制率分别为75％、82％、89％;对HBeAg的抑制率分别为32％、38％、43％;对HBVDNA的抑制率分别为30％、43％、49％;对HBVRNA的抑制率分别为30％、70％、90％。结论靶向HBVS区的siRNA能抑制HBV的抗原表达和复制;siRNA抑制作用呈剂量依赖性和序列特异性。     

APOBEC3G真核表达载体构建及抗HBV复制的初步研究

目的构建人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3G（APOBEC3G）真核表达载体,并探讨其抗乙型肝炎病毒（HBV）复制的作用。方法采用RT-PCR法从健康人外周血单个核细胞中克隆APOBEC3G基因编码区片段,构建pcDNA3.1-A3G真核表达载体,利用脂质体转染法将pcDNA3.1-A3G转染HepG2.2.15细胞,分别于转染后第24、48、72 h收集细胞培养上清液和细胞总蛋白,Western blot检测HBx蛋白表达情况,ELISA法检测细胞上清液中HBsAg和HBeAg表达情况。结果测序结果显示pcDNA3.1-A3G真核表达载体中APOBEC3G编码区序列存在1处碱基同义突变;HepG2.2.15细胞经APOBEC3G蛋白干扰后,HBx、HBsAg和HBeAg表达量逐渐降低,于72h表达量显著降低。结论成功构建了APOBEC3G真核表达载体pcDNA3.1-A3G;APOBEC3G在体外可以抑制HBV复制,为深入研究APOBEC3G作为抗HBV药物提供了实验基础。     

siRNA抑制乙型肝炎病毒在HepG2.2.15细胞中的复制与表达

目的 探讨靶向HBV S基因的siRNA表达质粒在HepG2.2.15细胞中对HBV病毒的复制与表达的抑制效应及其抗病毒活性.方法 设计并构建了两个靶向HBV S基因的siRNA表达质粒S1和S2,随机设计的用于对照的非同源siRNA表达质粒S3.首先在HepG2.2.15细胞中通过实时荧光定量PCR评估该siRNA表达质粒对HBV mRNA表达的抑制效应,接着在HepG2.2.15细胞中通过ELISA方法进一步枪测它们的抗病毒活性细胞上清液中HBV标志性蛋白HBsAg、HBeAg的表达水平.结果 在siRNA表达质粒转染HepG2.2.15细胞后48 h,HBV S基因mRNA表达量下降64%～88%,HBsAg和HBeAg的表达水平分别降低了60%～82%和56%～78%.S1+S2联合使用转染细胞中显著抑制HBV病毒的复制与表达的效率,而对照组S3无抑制效果.结论 发现靶向HBV S基因的siRNA表达质粒能够在HepG2.2.15细胞中有效的抑制HBV病毒的复制与表达,并能够降低细胞上清液中HBsAg和HBeAg的表达水平.S1+S2联合使用转染细胞中可以显著抑制HBV的复制与表达的效率.RNAi可能成为防治HBV感染有效的全新的抗病毒防御策略.     

针对HBVS区的siRNA的抗病毒活性

目的: 体外观察siRNA对HepG2 2.2.15细胞中乙型肝炎病毒(HBV)S-mRNA及HBsAg,HBeAg产生的影响. 方法: 设计并合成针对HBV S区的三条siRNA,构建含上述siRNA的表达载体pSilencer ZY1,pSilencer ZY2和pSilencer ZY3,pSilencer HK2测序及酶切鉴定后用脂质体介导重组质粒转染HepG2 2.2.15细胞,用酶免分析法对HepG2 2.2.15细胞上清中HBsAg,HBeAg进行检测,用逆转录聚合酶链反应检测HBV S-mRNA.结果: 成功构建了针对HBV S区的siRNA的表达载体,三条siRNA均可程度不同地抑制HepG2 2.2.15细胞上清中HBsAg,HBeAg的分泌,72 h抑制率达高峰,对HBsAg的抑制率分别为81%,29%及78%,对HBeAg的抑制率分别为35%,3%及49%,并有抑制HBV S-mRNA的作用.结论: 针对HBV S区的siRNA能明显抑制HBV的复制.     

Screening of Efficient siRNA Target Sites Directed against Gatekeeper Genes for DNA Repair

DNA double-strand breaks (DSBs) are common le-sions that occur in cells. They are caused by exogenous sources such as ionizing radiation, and by endogenous sources such as radicals generated during metabolic processes[1]. In mammalian cells, DSBs are repaired ei-ther by the homologous recombination (HR) pathways or by the non-homologous end joining (NHEJ)[2] pathways to maintain the fidelity of human genome. The basic mechanism and factor requirements of the two pathways are different. V…     

RNA干涉对乙型肝炎病毒复制和表达的影响

目的：观察HBV S区和C区特异性的小发夹RNA（shRNA）表达载体对HepG2.2.15细胞中HBV复制和表达的影响。方法：采用含有pol Ⅲ启动子的真核表达载体pSilenceCircle-U6构建针对HBV S区和C区的特异性shRNA表达质粒SC-S和SC-C。实验设立SC-S组、SC-C组、无关对照SC-N组和空白对照组,采用不同浓度的重组载体转染HepG2.2.15细胞,并作用不同时间。应用ELISA方法检测细胞上清液中的HBeAg和HBsAg,用斑点杂交方法检测细胞上清中的HBV DNA。结果：成功构建了含目的序列的重组质粒SC-S和SC-C。SC-S对HBeAg和HBsAg表达的抑制率明显高于SC-C;随着给药浓度的增加,SC-S对HBeAg和HBsAg表达的抑制率逐渐增强;SC-S转染HepG2.2.15细胞后第3天产生明显抑制效应,对HBeAg及HBsAg表达的抑制率在第6天达高峰,第9天抑制率仍较高。斑点杂交结果显示,SC-S对HBV复制的抑制效应强于SC-C。结论：构建的HBV S区和C区特异性shRNA表达质粒有明显、高效抑制HBV复制和表达的作用。     

利用纳米和RNA干扰技术抑制HBV-DNA 在HepG2 2.2.15细胞中的复制和表达

目的：通过RNA干扰和纳米技术抑制HBV-DNA在体外的复制和HBV核心抗原的表达。方法：制备靶向HBV核心抗原（HBcAg）的纳米小干扰RNA（siRNA）,利用U6启动子质粒转染入HepG2 2.2.15细胞;RT-PCR和Western印迹检测转染细胞HBV核心抗原在mRNA和蛋白水平的表达情况;real-time PCR 检测上清液HBV-DNA,放射免疫法检测细胞HBV表面抗原（HBsAg）、e抗原（HBeAg）、核心抗原（HBcAg）。结果：成功构建了含磁性纳米的siRNA质粒;多种方法检测均显示转染后的细胞HBV核心抗原表达明显下降;其表面抗原、e抗原和HBV-DNA值均较对照组降低。结论：RNA干扰联合纳米技术可明显下调HBV核心抗原的表达,抑制HBV-DNA复制。     

核酶对乙型肝炎病毒基因表达的抑制作用

目的 探讨核酶在细胞内抑制乙型肝炎病毒基因表达的作用。方法 计算机设计针对Ｃ基因的三个切点的核酶Ｒｚ１,Ｒｚ２,Ｒｚ３,合成核酶基因并将三个核酶基因两两组合克隆入ｐＧＥＭ７ｚｆ（一）质粒中,经体外转 录后切割靶ＲＮＡ;选择Ｒｚ２和Ｒｚ３串联的双位点核酶基因构建入逆转录病毒载体ｐＢＢＳ２１２中,重组质粒转染２．２．１５细胞,ＥＬＩＳＡ方法惭型肝炎病毒基因表达的抑制作用。结果 三种不同组合的核酶均可有     

抗HBV反义寡核苷酸的筛选

目的 筛选出对HBV有抑制作用的反义寡核苷酸(AS-ONs),为HBV的预防和治疗提供基础.方法 合成5条与HBV互补的反义寡核苷酸,转染HepG2.2.15细胞,运用荧光定量PCR和酶联免疫法测定反义寡核昔酸对细胞培养液中HBVDNA和HBsAg、HBeAg的抑制作用.结果 寡核苷酸序列Ⅰ(TAC CTC TYG T...     

小分子干扰RNA抑制大鼠肾细胞Ppif基因的表达

目的 研究siRNA 对大鼠肾细胞(NRK)Ppif 基因的抑制作用.方法 根据大鼠Ppif 基因序列设计并化学合成3对siRNA 及1对阴性对照siRNA,并在5′端标记FAM 羧基荧光素,以Lipofectamine~(TM)2000 转染入大鼠肾细胞,用RT-PCR 和Western blot 分别检测Ppif 基因和蛋白表达量的改变,验证所设计的siRNA 的抑制效应.结果以Lipofectamine~(TM)2000转染所设计的siRNA 进入NRK 细胞,转染效率＞90%.起始于405、556位点的siRNA 在基因水平对Ppif 无明显抑制效应(P＞0.05),起始于198位点的siRNA 在基因和蛋白水平均有明显的抑制效应,基因水平下降75.25%(P＜0.05);蛋白水平下降72.13 %(P＜0.05).结论 起始于198位点的siRNA 对大鼠肾细胞的Ppif 基因有明显的抑制效应.     

靶向La的外源性microRNA抑制HBV复制和表达的实验研究

目的 设计并构建靶向La的microRNA表达载体,观察其对La基因的抑制作用,探讨其在HBV感染基因治疗中的应用价值.方法 以La为靶基因,设计并构建3个针对La不同位点的microRNA表达载体,通过脂质体方法转染HepG2.2.15细胞,RT-PCR和Western blot检测其对La mRNA和蛋白的抑制作用...     

Apobec3B的真核表达及其抗HBV效应

目的：在真核细胞中表达Apobec3B,并探讨其在体外对HBV复制和表达的抑制作用。方法：应用RT-PCR法从人PBMC细胞中扩增Apobec3B基因,构建真核表达载体pcDNA3.1-Apo-bec3B,转染Hep G2 2.2.15细胞。W estern-blot鉴定细胞中Apobec3B蛋白的表达。ELISA法检测细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg水平,RT-PCR检测HBV DNA和HBV mRNA水平。结果：经酶切及测序鉴定pcDNA3.1-Apobec3B成功构建,Apobec3B蛋白可在Hep G22.2.15细胞中成功表达。转染pcDNA3.1-Apobec3B重组质粒的Hep G2 2.2.15细胞的HBsAg、HBeAg、HBV DNA及HBVmRNA水平均明显低于转染空载体组的Hep G2 2.2.15细胞。结论：成功在真核细胞中表达Apo-bec3B,其可明显抑制了Hep G22.2.15细胞中HBV的复制与表达,为深入研究Apobec3B抗HBV的作用机制奠定基础。