用随机扩增多态DNA(RAPD)区分青海血蜱与日本血蜱

目的用随机扩增多态DNA(RAPD)技术确定青海血蜱与日本血蜱的分类地位。方法分别提取青海血蜱与日本血蜱的DNA，确定聚合酶链反应(PCR)总体积、反应条件。选取8条不同的随机排列碱基顺序的多聚核苷酸单链为引物，进行RAPD—PCR扩增反应。将扩增产物制备成DNA图谱，比较青海血蜱与日本血蜱基因组DNA多态性，从DNA水平鉴定这2种蜱。结果2种蜱仅有少部分DNA条带相同，大部分条带不同。结论RAPD技术可准确地鉴别青海血蜱与日本血蜱这2种形态特征十分相似的蜱种。     

不同地区草原革蜱基因组DNA多态性研究

目的研究我国不同地区草原革蜱是否有种型差异。方法从新疆阿尔泰、甘肃省武威、平凉地区采集草原革蜱标本，并分别提取它们的DNA，选取9条随机排列碱基序列片段，利用随机扩增多态DNA技术(Random Amplifted Polymorphic DNA，RAPD)，确定聚合酶链反应(PCR)总体积、反应条件。将扩增产物制备成DNA图谱，比较不同地区草原革蜱基因组DNA的多态性，从分子水平对不同地区草原革蜱进行差异分析。结果3个地区的草原革蜱部分DNA条带相同，但也有完全不同的DNA条带。结论3个地区的草原革蜱DNA存在差异。     

用PCR/RFLP技术对福建省宁化林区鼠蜱类中斑点热群立克次体的检测

目的 了解福建省宁化林区斑点热自然疫源地存在情况.方法 用聚合酶链反应(PCR)对该林区鼠、蜱类中感染斑点热群立克次体(SFGR)进行扩增.用限制性酶切片段长度多态分析(RFLP)法对分离株NH-97进行鉴定,并同已知的西伯利亚立克次体等国际标准株进行比较.结果 从越原血蜱、金泽革蜱、微小牛蜱中扩增出SFGR特异的DNA片段,NH-97分离株的PCR产物经PstI和RsaI酶切后发现它们的酶切图谱与西伯利亚立克次体246国际标准株相同.从社鼠,黄胸鼠脏器中扩增出康氏立克次体DNA片段.由不同来源批次的越原血蜱中扩增出近缘于日本立克体DNA片段和相关序列提示:可能是斑点热群立克次体新成员.结论 福建宁化林区除存在西伯利亚立克次体外,还可能存在康氏立克次体,日本立克次体等多种斑点热群立克次体的疫源地.     

嗜人按蚊不同地理株基因组RAPD分析

目的 为进一步确定我国嗜人按蚊是否存在不同的种型提供研究依据。方法 通过随机引物多态性DNA(RAPD)技术获取四川、云南、江苏等三个不同分布区嗜人按蚊的DNA指纹图谱，比较嗜人按蚊不同地理株基因组DNA的多态性，从分子水平上对不同分布区嗜人按蚊进行分析。结果 各地理区域嗜人按蚊之间的DNA片段在绝大部分相同的情况下存在差异，一方面三个不同地理株的嗜人按蚊基本上具有共同的扩增片段，反映了各地理区域基因组DNA的同源性；另一方面各个地理株所特有的片段及条带亮度(扩增片段强度)上又有差别。结论 不同地理株的嗜人按蚊在DNA水平上在绝大部分相同的前提下存在差异，这种差异的发现将为鉴定形态学上无法区分的嗜人按蚊地理种型提供分子水平上的分类依据。     

对福建省宁化林区鼠蜱类中斑点热群立克次体的检测

目的 了解福建省宁化林区斑点热自然疫源地存在情况。方法 用聚合酶链反应对该林区鼠、蜱类中感染斑点热群立克次体(SFGR)进行扩增。用限制性酶切片段长度多态分析(RFIP)法对分离株NH-97进行鉴定,并同已知的西伯利亚立克次体等国际标准株进行比较。结果 从越原血蜱、金泽革蜱、微小牛蜱中扩增出SFGR特异的DNA片段,NH-97分离株的聚合酶链反应产物经PstI和RsaI酶切后发现它们的酶切图谱与西伯利亚立克次体246国际标准株相同。从社鼠、黄胸鼠脏器中扩增出康氏立克次体DNA片段。由不同来源批次的越原血蜱中扩增出近缘于日本立克体DNA片段和相关序列提示：可能是斑点热群立克次体新成员。结论 福建宁化林区除存在西伯利亚立克次体外,还可能存在康氏立克次体、日本立克次体等多种斑点热群立克次体的疫源地。     

首次在长角血蜱中检测到汉赛巴尔通体

目的检测长角血蜱中汉赛巴尔通体的携带情况。方法将采获于石家庄市灵寿县的长角血蜱分组,经无菌处理后研磨匀浆,一部分直接提取DNA进行PCR检测,另一部分接种于含5%去纤维羊血的胰酶大豆培养基上,在37℃,5%CO2的培养箱中进行培养后,挑取疑似菌落进行PCR检测。对所得阳性条带的PCR产物测序,并将所测核酸序列在Gen Bank中进行序列比对。结果菌落提取的DNA样品中有2个样品出现阳性条带,但测序未得结果;直接提取的DNA样品中有1个样品出现阳性条带,经过同源性比对后为汉赛巴尔通体。结论石家庄市灵寿县采集到的长角血蜱中存在汉赛巴尔通体感染,这是首次在长角血蜱中检测到汉赛巴尔通体。     

用随机扩增多态DNA(RAPD)技术研究不同地理株埃及伊蚊的分化

目的 用RAPD技术对实验室饲养的广东、海南、台湾和印尼Baro等4个不同地理株的8只雌蚊进行随机扩增多态DNA分析。方法 随机扩增多态性DNA(RAPD)技术。结果 选用20个随机引物进行扩增，有8个引物表现清晰的RAPD谱带并呈显著多态性。UPGMA法构建的分子系统树表明埃及伊蚊4个地理株之间存在着一定程度的遗传分化。结论 用RAPD方法可以区分不同地理株埃及伊蚊。     

随机扩增多态性DNA技术用于青藏高原型鼠疫菌的比较

目的对青海、西藏和甘肃省（自治区）境内不同宿主体内分离的21株青藏高原型鼠疫耶尔森菌（鼠疫菌）的基因进行分析,旨在比较不同宿主鼠疫菌之间的关系。方法采用随机扩增多态性DNA（RAPD）技术。结果扩增产物在凝胶电泳上显示的条带,其中16007、28001、01080号菌株相同,且与其余18株菌株存在差别。结论该实验中不同宿主体内检出的21株青藏高原型鼠疫菌在遗传学上属于同源。     

肠炎沙门菌随机扩增多态性DNA分子分型

目的对不同来源的12株肠炎沙门菌分离株进行分子分型。方法分别提取不同菌株基因组DNA,建立和优化随机扩增多态性DNA（RAPD）反应体系,试用22条随机引物对不同菌株进行RAPD扩增,筛选清晰稳定的扩增条带做统计分析。结果筛选到OPG-03、OPG-06、OPG-07和OPG-13共4条随机引物具有鉴别作用,每一菌株均可扩增出4~10条DNA片段,大多数片段在100~2000bp之间,共扩增出42条RAPD条带,其中共有条带7条,多态性条带35条,多态性为83.3%。不同来源的肠炎沙门菌分离株之间的遗传相似系数在42.6%~100%之间,在0.850的相似性水平上可将12株肠炎沙门菌分离株分为5个不同的亚型。结论应用RAPD技术在分子水平上对肠炎沙门菌进行鉴别和分型具有简便、快速和辨别能力高的优势,对肠炎沙门菌的分子流行病学研究具有较好的应用前景。     

不同地区嗜人按蚊基因组DNA差异分析

目的：为进一步确定我国嗜人按蚊是否存在不同的种型提供依据。方法;通过随机引物多态性DNA（RAPD）技术获取四川、云南、江苏3个不同地区嗜人按蚊的DNA指纹图谱,比较嗜人按蚊不同地区基因组DNA的多态性,从分子水平上对不同分布区嗜人按蚊进行差异分析。结果：不同地区嗜人按蚊之间的DNA片段在绝大部分相同的情况下存在差异,3个不同地区基本上具有共同的扩增片段,反映了各地理区域基因组DNA的同源性;同时各个地区所特有的片段及条带亮度（扩增片段强度）又有差别。结论：不同地区嗜人按蚊在DNA水平绝大部分相同的前提下存在差异,这种差异的发现将为鉴定形态学上无法区分的嗜人按蚊地理种型提供水平的分类依据。     

不同地区嗜人按蚊基因组DNA差异分析

[目的]为进一步确定我国嗜人按蚊是否存在不同的种型提供研究依据。[方法]通过随机引物多态性DNA(RAPD)技术获取四川、云南、江苏3个不同地区嗜人按蚊的DNA指纹图谱,比较嗜人按蚊不同地区基因组DNA的多态性,从分子水平上对不同分布区嗜人按蚊进行差异分析。[结果]不同地区的嗜人按蚊之间的DNA片段在绝大部分相同的情况下存在差异,3个不同地区基本上具有共同的扩增片段,反映了各地理区域基因组DNA的同源性;同时各个地区所特有的片段及条带亮度(扩增片段强度)又有差别。[结论]不同地区的嗜人按蚊在DNA水平绝大部分相同的前提下存在差异,这种差异的发现将为鉴定形态学上无法区分的嗜人按蚊地理种型提供分子水平的分类依据。     

单核细胞增生李斯特菌PCR鉴定技术的研究

目的建立单核细胞增生李斯特菌PCR鉴定技术.方法选择Hly Inl基因设计扩展片段分别为300～400bp、600～700bp的二对特异性引物,进行PCR扩增.结果单增李斯特菌标准菌株及本实验室分离保存的单增李斯特菌均扩增出两条明显条带,其它食品中常见致病菌及非单核细胞增生李斯特菌均不见扩增条带.52株李斯特菌生化符合菌中,有30株菌同时扩增出两条明显条带,与Mini-VIDSA测定法比较,两者符合率达92.31%.结论本实验建立的PCR鉴定技术为一种简便、快速、敏感、特异的单增李斯特菌鉴定方法.     

随机扩增多态性DNA在淋球菌基因分型中的应用

目的 建立随机扩增多态性DNA(RAPD)对淋球菌进行基因分型的方法。方法 用4种不同的预处理方法提取淋球菌基因组DNA,对其优劣进行比较;并运用RAPD对淋球菌菌株进行区分及对经性伴传播的淋病病例进行RAPD指纹图谱比较。结果 运用经典的十六烷基三乙基溴化铵法可以抽提较完整的基因组DNA,获得良好的RAPD指纹图谱;各菌株的RAPD指纹图谱间有明显不同DNA多态性;性伴传播的病例中获得了非常相似的RAPD指纹。结论 选择最佳的DNA抽提技术,运用RAPD可以对淋球菌进行有效基因分型,并可用于分子流行病学对传染源的追踪。     

Differentiation of field isolates and vaccine strains of infectious laryngotracheitis virus by DNA sequencing

Two different regions of the infected cell protein 4 (ICP4) gene of infectious laryngotracheitis virus (ILTV) were amplified and sequenced for characterization of field isolates and tissue culture-origin (TCO) and chicken embryo-origin (CEO) vaccine strains. Phylogenetic analysis of the two regions showed differences in nucleotide and amino acid sequences between field isolates and attenuated vaccines. The PCR-RFLP results were identical to those obtained by DNA sequencing and validated their use to differentiate ILTV strains. The approach using the sequencing of the two fragments of the ICP4 gene showed to be an efficient and practical procedure to differentiate between field isolates and vaccine strains of ILTV.     

浙江省散发猪链球菌病临床分离株存在89K候选致病岛

目的 对浙江省临床分离猪链球菌血清2型(SS2)菌株进行89K候选致病岛检测.方法 用多种特异性引物进行PCR扩增检测,同时对89K的3个扩增片段进行测序,并结合有关资料进行生物信息学和流行病学分析.结果 8株SS2菌株,均检出89K(1&2)、89K(3&4)、89K(5&6)候选致病岛特异片段和种特异性16S rDNA、cps2J、mrp毒力基因,和1998年江苏省暴发疫情的菌株结果一致.ZJ0501号SS2分离株89K候选致病岛的3个PCR扩增片段序列和1998年江苏省暴发疫情的菌株有99%以上的相似性,其中编码DNA重组蛋白的序列片段和病乳链球菌及无乳链球菌有较高的同源性.结论 近年来在浙江省临床分离Ss2菌株中,存在89K候选致病岛片段.     

基于hsp65基因的PCR-RFLP用于快速鉴定分枝杆菌菌种的初步研究

目的 基于hsp65基因的PCR-限制性酶切片段长度多态性(PCR-RFLP)用于快速鉴定分枝杆菌菌种的方法的建立和评价.方法 选择分枝杆菌hsp65基因作为目的 基因,对分枝杆菌标准株进行PCR扩增,扩增产物经HaeⅢ和Bstp Ⅰ两种限制性内切酶酶切,酶切产物采用4%MetaPhor琼脂糖凝胶电泳,根据电泳条带位置,计算条带分子量,确定不同菌种的特异指纹图谱.结果 共对40种(株)分枝杆菌进行分析,6株结核分枝杆菌复合体菌株呈现两种指纹图谱,34株非结核分枝杆菌标准株均具有惟一的指纹图谱.结论 基于hsp65基因的PCR-RFLP可用于分枝杆菌菌种的快速鉴定,且方法简便,易于标准化.     

Construction of a replacement vector to disrupt pksCT gene for the mycotoxin citrinin biosynthesis in Monascus aurantiacus and maintain food red pigment production

More and more people pay attention to citrinin produced by Monascus, which has nephrotoxic activity in mammals. It was reported that pksCT gene is responsible for citrinin biosynthesis in Monascus purpureus. In this paper, two DNA fragments in both ends of pksCT were amplified by genomic PCR from fourteen Monascus spp. strains. The PCR products were gained from all of the strains. It is suggested that pksCT gene was highly conserved in different citrinin-producing Monascus strains. A pksCT-replacement vector (pHD106) was constructed to disrupt pksCT with a hygromycin resistance gene as the selection marker, and was transformed into M. aurantiacus Li AS3.4384. Three transformants (M. aurantiacus PHDS18, PHDS26, PHDS31) were selected from transformant selective plates. The targeting fragment D was gained by genomic PCR from PHDS18 and PHDS26 except PHDS31. The expressing citrinin capacities of PHDS26 was decreased by about 98%, while PHDS18 was reserved the high capacity of producing citrinin, after 10 days of growth on YM medium. The results indicated that PHDS26 is a pksCT-disrupted strain. There are maybe other genes besides pksCT responsible for citrinin biosynthesis in M. aurantiacus. It is the effective way to solve the problem of citrinin in M. aurantiacus products by constructing replacement vectors to disrupt the genes responsible for citrinin biosynthesis to reduce the capacity of expressing citrinin.