p53上调凋亡调控因子增强胶质瘤干细胞对替莫唑胺化疗敏感性的研究

 目的　探讨不同CD133免疫原型的胶质瘤细胞对替莫唑胺（TMZ）耐药性的差异以及p53上调凋亡调控因子（PUMA）改变胶质瘤细胞对TMZ敏感性的影响。方法　利用免疫磁珠细胞分选法筛选出CD+133和CD-133的胶质瘤细胞U87MG,分别传代培养,转染Ad-PUMA,并用TMZ干预。四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT法）检测细胞增殖情况及对TMZ的半数抑制浓度（IC50）,流式细胞术观察外源性PUMA、TMZ干预前后CD+133和CD-133细胞的凋亡情况。结果　CD+133免疫磁珠分选出胶质瘤干细胞,CD+133胶质瘤细胞IC50较CD-133胶质瘤细胞高[（200±10）μmol／L比（80±11）μmol／L],转染Ad-PUMA后,两组细胞IC50均降低[（100±8）μmol／L比 （20±7）μmol／L],两组转染前后IC50差异均有统计学意义（P < 0.05）。TMZ联合PUMA组CD+133细胞凋亡率为68.05 %,对照组、TMZ组及PUMA组分别为6.05 %、32.91 %和40.61 %,联合组与其他组比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。结论　PUMA联合TMZ可以促进耐药的胶质瘤干细胞凋亡,从而增强胶质瘤对化疗的敏感性。     

GM-CSF在替莫唑胺抗高级别胶质瘤中的作用

目的 探讨粒-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GMCSF）在替莫唑胺（temozolomide, TMZ）抗高级别胶质瘤中的作用及机制。方法 选取6例高级别胶质瘤患者来源的肿瘤组织培养肿瘤细胞,待细胞状态稳定后采用MTT法进行细胞增殖毒性实验,流式细胞仪检测细胞周期变化和细胞凋亡情况,甲基化特异性PCR和免疫组织化学染色法分别检测六氧甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase, MGMT）基因启动子甲基化状态和MGMT蛋白表达水平。 结果 MTT实验显示,GM-CSF处理组的细胞存活率与对照组相比均有不同程度的增加。MGMT基因启动子甲基化的3例细胞,GM-CSF+TMZ组的细胞存活率比TMZ组显著降低（P<0.05）,另3例MGMT启动子非甲基化细胞,GM-CSF+TMZ组与TMZ组相比,其存活率差异均无统计学意义（P>0.05）。6例细胞GM-CSF组的G1期细胞比例均比对照组降低,而S期细胞比例GMCSF处理组较对照组显著增加（P<0.05）。流式细胞仪凋亡检测显示,MGMT启动子甲基化的3例细胞,GM-CSF+TMZ组凋亡率与单药TMZ组凋亡率相比均显著增加（P<0.05）,而MGMT非甲基化细胞GM-CSF+TMZ组与单药TMZ组凋亡率相比无统计学差异。结论 GM-CSF可通过诱导高级别胶质瘤细胞快速进入细胞周期,显著提高TMZ对MGMT基因启动子甲基化的高级别胶质瘤细胞的杀伤作用,而对MGMT基因启动子非甲基化高级别胶质瘤细胞的作用不明显。     

羟基喜树碱联合低分子肝素钠对肿瘤生长转移抑制的研究

 目的　研究羟基喜树碱（HCPT）联合低分子肝素钠对裸小鼠肝细胞癌生长转移的抑制作用。方法 建立人肝癌裸鼠转移模型。将造模成功的40只模型鼠随机分成4组，即对照组、HCPT组、低分子肝素钠组、联合组（HCPT、低分子肝素钠）。分别观察肿瘤大小、抑瘤率，测血清甲胎蛋白（AFP）、肿瘤微血管密度（MVD）、血小板内皮细胞黏附分子-1（CD31）。结果　对照组、HCPT组、低分子肝素钠组、联合组的肿瘤体积分别为（25 260±12 976）mm3、（5773±2498）mm3、（5911±3093）mm3和（1596±1207）mm3；抑瘤率分别为0、76.6 %、79.8 %和94.1 %；MVD分别为21.1±6.5、17.2±3.1、7.1±2.3和4.8±1.8；CD31分别为31.7±6.1、26.2±5.2、20.9±4.7和19.5±2.4；AFP分别为（121.9±31.4）ng／ml、（56.2±37.9）ng／ml、（75.6±28.7）ng／ml和（20.7±12.9）ng／ml；肝癌转移率分别为80 %、70 %、20 %和10 %；肺转移率分别为70 %、60 %、20 %和10 %；腹壁转移率分别为90 %、60 %、30 %和30 %；腹腔积液形成率分别为20 %、10 %、0和0。HCPT组、低分子肝素钠组、联合组分别与对照组比，对肝癌生长的抑制作用差异有统计学意义（F＝9.074，P＜0.01）。HCPT联合低分子肝素钠对肝癌的生长和转移有良好的抑制作用，与对照组及HCPT组比较差异有统计学意义（F＝24.837，P＜0.01）。结论　HCPT联合低分子肝素钠对肿瘤的生长与转移有良好的抑制作用。     

消癥抑瘤方对人类顺铂耐药卵巢癌细胞凋亡的影响

 目的　检测中药消癥抑瘤方对顺铂（DDP）耐药卵巢癌OVCAR／DDP细胞多药耐药的逆转活性,并探讨其相关作用机制。方法　OVCAR／DDP细胞接种于40只裸鼠腋下,建立移植瘤模型,按随机数字表分为4组,依据不同的药物组合分为0.9 %氯化钠溶液对照组、DDP单独用药组、低剂量消癥抑瘤方+DDP组、高剂量消癥抑瘤方+DDP组。1个月后处死裸鼠,计算各组抑瘤率,末端转移酶介导脱氧尿苷三磷酸（TUNEL）法检测OVCAR／DDP细胞的凋亡率,RT-PCR检测移植瘤组织中Survivin mRNA的表达。结果　0.9 %氯化钠溶液对照组比较,DDP单独用药组、低剂量消癥抑瘤方+DDP组、高剂量消癥抑瘤方+DDP组对卵巢癌OVCAR／DDP细胞裸鼠移植瘤的抑瘤率分别为（5.56±1.14）%、（18.42±7.73）%、（31.59±12.58）%,各组间差异有统计学意义（F＝8.64,P＜0.01）。0.9 %氯化钠溶液对照组、DDP单独用药组、低剂量消癥抑瘤方+DDP组、高剂量消癥抑瘤方+顺铂组OVCAR／DDP细胞移植瘤组织细胞凋亡率分别为（2.35±1.04）%、（4.56±1.61）%、（12.42±3.68）%、（21.59±5.17）%,0.9 %氯化钠溶液对照组与DDP单独用药组比较差异无统计学意义（t＝0.84,P＞0.05）,2个消癥抑瘤方组与DDP单独用药组比较差异均有统计学意义（t＝5.89,P＝0.004;t＝9.83,P＝0.001）。2个消癥抑瘤方组以剂量依赖性下调裸鼠移植瘤OVCAR／DDP细胞Survivin mRNA的表达。结论　消癥抑瘤方可以增加DDP对卵巢癌顺铂耐药OVCAR／DDP细胞的抗肿瘤活性,下调Survivin的表达可能是其主要的作用机制。     

阿霉素联合他莫昔芬对人子宫内膜癌裸鼠移植瘤的抑制作用

目的：分别研究阿霉素、他莫昔芬及两者联合用药对人子宫内膜癌裸鼠移植瘤的生长抑制作用及相应机制;方法：建立裸鼠活体二次移植肿瘤的动物模型,并随机分为4组,每组5只.分别为阿霉素用药组、他莫昔芬用药组、阿霉素他莫昔芬联合用药组及对照组;用药处理裸鼠移植瘤模型3周.对照组予以注射生理盐水3周.计算各组移植瘤体积、抑瘤率及裸鼠体重情况,肿瘤组织标本进行免疫组化检测Ki67蛋白的表达,并用TUNEL法检测细胞凋亡情况.结果：联合用药组与单独用药组及对照组的瘤体积比较差异均有统计学意义（P＜0.05）;用药前各组裸鼠体重差异无统计学意义（P＞0.05）,用药后对照组与单独用药组及联合用药组的体重比较差异均有统计学意义（P＜0.05）;联合用药组与单独用药组及对照组的抑瘤率比较差异均有统计学意义（P＜0.05）;用药组的Ki67表达阳性率明显低于对照组,联合用药组Ki67表达最低;TUNEL法检测联合用药组肿瘤细胞凋亡率为（32.33 ±3.68）％,明显高于阿霉素组（17.40±2.58）％、他莫昔芬（15.40±6.05）％和对照组（3.50±1.50）％,差异有统计学意义（P＜0.05）.结论：阿霉素、他莫昔芬均可抑制人子宫内膜癌裸鼠移植瘤的生长,两者联合应用较两药单独应用对人子宫内膜癌裸鼠移植瘤的抑制作用更为显著.     

塞来昔布联合5-Fu对人结肠癌裸鼠皮下移植瘤生长的影响

 目的 探讨选择性环氧化酶 2（Cyclooxygenase 2，Cox 2）抑制剂 塞来昔布（celecoxib）联合5 氟尿嘧啶（5 fluorouracil ，5 Fu）对实验性人结肠癌裸鼠皮下移植瘤生长的影响及作用机制。方法 建立人结肠癌裸鼠皮下移植瘤模型，模型建立后32只实验裸鼠随机分为四组，分别给予塞来昔布及5 Fu药物干预后观察各组皮下移植瘤体积、瘤重和裸鼠实验前后的体重变化，计算抑瘤率。电镜观察细胞凋亡形态,原位凋亡染色检测凋亡指数（AI），免疫组化及Western blot印迹法检测细胞色素C、caspase 3及caspase 9表达。结果 塞来昔布干预组、5 Fu干预组和联合干预组肿瘤生长明显抑制，塞来昔布干预组、5 Fu干预组抑瘤率分别为27.81%和53.02%，联合干预组抑瘤率为78.37%（P<0.01）。干预组较对照组肿瘤细胞凋亡明显增加，干预组各组之间凋亡指数比较差异有统计学意义（P<0.01）。透射电镜下见干预组瘤细胞呈现明显凋亡形态改变，联合干预组凋亡表现尤为典型，对照组无明显凋亡形态改变。免疫组化及Western blot印迹法显示干预组其细胞色素C、caspase 3及caspase 9的表达明显高于对照组，且干预组各组之间比较其表达差异也有统计学意义（P<0.05）。结论 塞来昔布及5 Fu均具有明显的抗肿瘤作用，联合应用时具有协同作用，可显著抑制人结肠癌裸鼠皮下移植瘤的生长，其作用机制可能与上调细胞色素C、caspase 3及caspase 9蛋白表达、激活细胞色素C依赖性凋亡信号通路有关。     

辛伐他汀联合阿糖胞苷对K562细胞增殖与凋亡的影响

 目的　探讨辛伐他汀（SV）联合阿糖胞苷（Ara-C）对K562 细胞增殖与凋亡的影响。方法　不同浓度SV和Ara-C单用或者联合处理K562细胞,对照组为K562细胞。药物作用24、48、72 h后收集细胞,分别观察各组细胞形态,采用MTT法检测不同组别细胞的生长抑制率,采用流式细胞术检测细胞早期凋亡率、细胞坏死比例。结果　SV联合Ara-C组与单药组相比细胞形态明显有核固缩现象,且可见凋亡小体形成,并且随着处理时间的增加,抑制率也增大。其中15 μmol／L SV联合20 μmol／L Ara-C的细胞抑制作用最为显著,72 h细胞抑制率为（72±1）%,明显高于15 μmol／L SV组的（45±2）%和20 μmol／L Ara-C组的（44±0）%（P＜0.01）,表现为协同抑制作用（24、48 h金氏Q值为1.24和1.19）。流式细胞术检测发现20、15和 10 μmol／L SV组K562细胞早期凋亡率AnnexinV明显高于对照K562细胞（P＜0.01）,而且随着时间延长和剂量的增大早期凋亡率也增加（P＜0.05）。20和15 μmol／L SV组早期凋亡率均高于10 μmol／L SV组,而前两者之间差异无统计学意义（P＞0.05）。晚期凋亡细胞率（PI）各组中差异均无统计学意义（P＞0.05）。结论　SV 体外抑制K562细胞增殖及诱导细胞凋亡,SV 与Ara-C具有协同作用,增加了K562细胞对化疗药物的敏感性。15 μmol／L 可能为SV体外最佳作用浓度。     

lncRNA POU3F3 通过调节MGMT的表达影响高级别脑胶质瘤细胞对替莫唑胺耐药

[摘要] 目的：探讨lncRNA POU3F3 通过调节MGMT的表达影响高级别脑胶质瘤细胞对替莫唑胺(temozolomide,TMZ)耐药及其作用机制。方法：选取2016 年1 月至2018 年1 月北京大学国际医院神经外科收治的60 例患者组织标本,其中,脑外伤患者12 例（正常组）、初发高级别脑胶质瘤患者30 例（初发组）、复发高级别脑胶质瘤患者[复发组,已经接受了手术治疗+TMZ综合治疗再次复发的人群]18 例。采用1、2、4 及8 μg/ml TMZ诱导U251 细胞并维持正常生长1 周以构建抵抗U251 TMZ耐药细胞系（U251 TMZ-resistance,U251-TR）;正常组采用相同体积的0.9%生理盐水处理U251 细胞。采用qPCR和Wb检测正常脑组织及神经胶质瘤细胞中POU3F3 和甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（methylguanine DNA methyltransferase,MGMT）mRNA和蛋白的表达水平。慢病毒转染构建稳定干扰POU3F3 的U251-TR细胞系（U251-TR stable interference POU3F3,U251-TR siPOU3F3）,MTT法验证U251-TR 细胞并检测细胞TMZ IC50值,Wb检测细胞中MGMT蛋白的表达水平。结果：与正常组及初发组比较,复发组POU3F3 表达显著增高（P<0.01）,U251-TR细胞TMZ IC50值显著高于U251 细胞（P<0.01）,U251-TR siPOU3F3 细胞TMZ IC50值显著低于U251-TR细胞（均P<0.01）,但高于U251 细胞（P<0.01）;U251-TR细胞POU3F3 及MGMT mRNA和蛋白的表达水平均高于U251 细胞（均P<0.01）,U251-TR siPOU3F3 细胞POU3F3 及MGMT mRNA和蛋白表达水平均低于U251-TR 细胞（均P<0.01）。结论：lncRNA POU3F3 是促进高级别脑胶质瘤细胞TMZ耐药性的关键因素,可能对临床上TMZ耐药的研究有一定的意义。     

过表达程序性细胞死亡基因5 提高脑神经胶质瘤细胞对替莫唑胺的化疗敏感性

[摘要] 目的：探讨抑癌基因程序性细胞死亡基因5（programmed cell death 5 gene, PDCD5）对脑神经胶质瘤细胞增殖及替莫唑胺（temozolomide，TMZ）化疗敏感性的影响。方法：收集吉林大学第一临床医院神经外科2009 年1 月至2014 年12 月间收治的脑神经胶质瘤患者116 例。分别利用qPCR、WB及免疫组化方法检测神经胶质瘤细胞系U87、U251、稳定克隆U87-PDCD5 细胞、转染si-PDCD5 后的脑胶质瘤细胞以及原发性神经胶质瘤组织中PDCD5 mRNA及蛋白质的表达情况。MTT法检测过表达或敲降PDCD5 对胶质瘤细胞生长及TMZ化疗敏感性的影响。建立脑胶质瘤细胞系U87 裸鼠皮下荷瘤模型，随机分为对照组、TMZ组、PDCD5 组和TMZ+外源性PDCD5 重组表达载体联合组，治疗20 d 后断颈处死动物，切取瘤组织，测量瘤体积并称瘤质量。采用qPCR、WB 法检测移植瘤组织中PDCD5 的表达水平，分析PDCD5 联合TMZ 治疗对脑神经胶质瘤生长的影响。结果：PDCD5 mRNA和蛋白在U87 细胞中的相对表达量明显低于在U251 细胞中的相对表达量（均P<0.05）；在高级别脑神经胶质瘤组织中，PDCD5 mRNA和蛋白的表达明显低于低级别组织（均P<0.05）；U87-PDCD5 和U251 细胞对TMZ的敏感性均高于U87 细胞（均P<0.05），U87-PDCD5-siRNA、U251-siRNA 组细胞对TMZ的敏感性均明显低于对照组（均P<0.05）。比较裸鼠移植瘤的瘤体积和质量，对照组>TMZ组>PDCD5 组>联合组（均P<0.05）；各组移植瘤组织内PDCD5 mRNA及蛋白的表达水平趋势与之相反（均P<0.05）。结论：PDCD5 过表达可增强脑神经胶质瘤细胞对TMZ的化疗敏感性，而沉默PDCD5 表达作用则相反，PDCD5 与TMZ联合应用可更好地抑制脑神经胶质瘤裸鼠移植瘤的生长。     

125I粒子植入联合放射治疗对A549裸鼠移植瘤生长及HIF-1表达的影响

 【摘要】　目的　研究125I粒子植入联合放射治疗对A549裸鼠移植瘤生长及乏氧诱导因子-1α（HIF-1α）表达的影响。方法　应用裸鼠建立肺腺癌A549移植瘤模型,待平均瘤体积达到（300±50）mm3时40只裸鼠随机分成4组（每组10只）,对照组 ：不做任何处理;单纯放射治疗组 ：第1天予单次外照射,6 MV-X线,10 Gy;125I粒子植入组 ：肿瘤中心植入1枚活度27.75 MBq的125I粒子;放疗加125I粒子植入组（联合治疗组）：第1天在肿瘤中心植入1枚活度27.75 MBq的125I粒子的同时予单次外照射,6MV-X线,10 Gy。治疗后共观察15 d,绘制肿瘤生长曲线,测量各组肿瘤体积并计算抑瘤率,分别用免疫组织化学及蛋白免疫印迹方法测定HIF-1α的表达。结果　治疗第8天起,瘤体积联合治疗组（209±21）mm3与对照组（322±30）mm3相比差异有统计学意义（t＝46.4,P＝0.000）。第15天后,单纯放射治疗组、125I粒子植入组、联合治疗组抑瘤率依次为45.9 %、44.4 %、69.4 %,联合治疗组与单纯放射治疗组比较差异有统计学意义（t＝52.03,P＝0.000）,联合治疗组与125I粒子植入组比较差异有统计学意义（t＝53.98,P＝0.000）,单纯放射治疗组和125I粒子植入组相比,差异无统计学意义（t＝0.591,P＝0.596）。联合治疗组与其他各组相比HIF-1α改变差异均无统计学意义（P＝0.342）。结论　放射治疗联合125I粒子植入能显著抑制转染人类肺腺癌A549裸鼠移植肿瘤的生长,但未抑制肿瘤细胞HIF-1α的表达。     

姜黄素抑制MGMT基因表达增强恶性胶质瘤对替莫唑胺化疗的敏感性

目的 探讨姜黄素对高水平O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)的调控作用及其对恶性胶质瘤化疗敏感性的影响.方法 通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)测定姜黄素、替莫唑胺单药和二者联合对MGMT表达阳性恶性胶质瘤C6及U87细胞株、复发或耐药恶性胶质瘤原代细胞MGMT表达水平的影响.CCK-8检测细胞增殖变化,流式细胞检测细胞凋亡的变化.结果 与姜黄素(C6:0.64 ±0.03;U87:0.63±0.06;原代细胞:0.51±0.07)、替莫唑胺(C6:0.53 ±0.06;U87:0.51±0.04;原代细胞:0.79±0.03)单药比较,姜黄素、替莫唑胺二者联合(C6:0.14±0.01;U87:0.12±0.03;原代细胞:0.29±0.02)能明显降低C6及U87细胞株、复发或耐药恶性胶质瘤原代细胞株中MGMT的表达,组间差异具有统计学意义(C6:F=23.675,P=0.006;U87:F=29.021,P=0.001;原代细胞株:F=25.534,P=0.001).与姜黄素、替莫唑胺单药比较,二者联合均能抑制细胞的增殖,半数抑制浓度(IC50)值降低,差异具有统计学意义(C6:F=6.731,P=0.012;U87:F=17.321,P=0.008;原代细胞株:F=18.857,P=0.007).姜黄素和替莫唑胺二者联合作用后细胞的凋亡率较单药作用后明显增加,组间差异具有统计学意义(C6:F=25.871,P=0.001;U87:F=6.847,P=0.009;原代细胞株:F =36.641,P=0.000).结论 姜黄素与替莫唑胺能协同降低MGMT的表达,增强恶性胶质瘤对替莫唑胺的化疗敏感性,为替莫唑胺耐药的恶性胶质瘤的治疗提供新的思路和方法.     

老年胶质母细胞瘤患者MGMT甲基化状态对放化疗及预后影响

目的:探讨O-6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)基因启动子甲基化状态对老年胶质母细胞瘤(GBM)治疗及预后的影响。方法:回顾性分析天津市环湖医院2012—2018年收治的65例新诊断的老年GBM患者的临床资料。所有患者均在术后接受了调强放疗,49例患者接受了替莫唑胺单药化疗。依据MGMT启动子甲基化状态分为M...     

Certain imidazotetrazines escape O6-methylguanine-DNA methyltransferase and mismatch repair

Resistance to temozolomide (TMZ), conferred by O6-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT) or mismatch repair (MMR) deficiency, presents obstacles to successful glioblastoma multiforme (GBM) treatment. Activities of novel TMZ analogs, designed to overcome resistance, were tested against isogenic SNB19 and U373 GBM cell lines (V = vector control, low MGMT; M = MGMT overexpression). TMZ and triazene MTIC demonstrated >9-fold resistance in SNB19M cells (cf SNB19V). N-3 methyl ester analog 11 and corresponding triazene 12 inhibited growth of TMZ-sensitive (V) and TMZ-resistant (M) cells (GI(50) <50 μM). Ethyl ester 13 and triazene 14 gave similar profiles. MMR-deficient colorectal carcinoma cells, resistant to TMZ (GI(50) >500 μM), responded to analog 11 and 13 treatment. Cross-resistance to these agents was not observed in cell lines possessing acquired TMZ resistance (SNB19VR; U373VR). Methyl ester 11 blocked SNB19V, SNB19M and SNB19VR cells in S and G(2)/M, causing dose- and time-dependent apoptosis. DNA damage, recruiting excision repair was detected by alkaline comet assay; H2AX phosphorylation indicated a lethal DNA double-strand break formation following analog 11 exposure. Compounds 11 and 13 demonstrated 3.7- and 5.1-fold enhanced activity in base excision repair-deficient Chinese hamster ovary cells; furthermore, poly (ADP-ribose) polymerase-1 inhibition potentiated HCT-116 cells' sensitivity to analog 11. In conclusion, analogs 11 and 13 exert anticancer activity irrespective of MGMT and MMR.     

MGMT不同表达水平与替莫唑胺对胃肠胰神经内分泌肿瘤疗效的相关性

目的:通过检测肿瘤组织中O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）的表达,探讨其与胃肠胰神经内分泌瘤以替莫唑胺为基础化疗患者预后的相关性。方法:收集2017年至2019年在我院接受替莫唑胺联合替吉奥化疗的15例晚期胃肠胰神经内分泌瘤患者的肿瘤组织,采用免疫组织化学法检测肿瘤组织中MGMT蛋白表达情况,根据表达情况分为MGMT阴性组和MGMT阳性组,并对患者长期随访,进行无进展生存时间和药物安全性的评定,对MGMT表达水平与替莫唑胺治疗效果行相关性分析。结果:15例患者肿瘤组织MGMT表达阴性者为8例（53.3%）,MGMT表达阳性者为7例（46.7%）;MGMT阴性组患者化疗6个疗程后,客观缓解率（ORR）为35.7%(3/8),明显高于MGMT阳性组的0(0/7);MGMT表达阳性组患者的中位无进展生存时间（mPFS）为6个月,而MGMT表达阴性组患者的mPFS目前无法得出,但明显长于MGMT阳性组,两组间差异具有统计学意义（P=0.000 2）。化疗不良反应均为2级以下的骨髓抑制和消化道反应。结论:基于替莫唑胺化疗方案的疗效与MGMT在肿瘤组织中的表达状态相关,MGMT表达与否可以用作胃肠胰神经内分泌瘤患者对替莫唑胺治疗反应的生物学指标。     

替莫唑胺联合干扰素α/β治疗胶质瘤移植瘤的实验研究

背景与目的:6-氧甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(06-methylguanine-DNA-methyl transferase,MGMT)是肿瘤对甲基化类药物耐药的重要原因之一.替莫唑胺(temozolomide,TMZ)常规方案对MGMT阳性胶质瘤的化疗效果不理想.本实验在动物体内观察干扰素α/β(interfero...     

In vivo selection of autologous MGMT gene-modified cells following reduced-intensity conditioning with BCNU and temozolomide in the dog model

Chemotherapy with 1,3-bis (2-chloroethyl)-1-nitrosourea (BCNU) and temozolomide (TMZ) is commonly used for the treatment of glioblastoma multiforme (GBM) and other cancers. In preparation for a clinical gene therapy study in patients with glioblastoma, we wished to study whether these reagents could be used as a reduced-intensity conditioning regimen for autologous transplantation of gene-modified cells. We used an MGMT(P140K)-expressing lentivirus vector to modify dog CD34(+) cells and tested in four dogs whether these autologous cells engraft and provide chemoprotection after transplantation. Treatment with O(6)-benzylguanine (O6BG)/TMZ after transplantation resulted in gene marking levels up to 75%, without significant hematopoietic cytopenia, which is consistent with hematopoietic chemoprotection. Retrovirus integration analysis showed that multiple clones contribute to hematopoiesis. These studies demonstrate the ability to achieve stable engraftment of MGMT(P140K)-modified autologous hematopoietic stem cells (HSCs) after a novel reduced-intensity conditioning protocol using a combination of BCNU and TMZ. Furthermore, we show that MGMT(P140K)-HSC engraftment provides chemoprotection during TMZ dose escalation. Clinically, chemoconditioning with BCNU and TMZ should facilitate engraftment of MGMT(P140K)-modified cells while providing antitumor activity for patients with poor prognosis glioblastoma or alkylating agent-sensitive tumors, thereby supporting dose-intensified chemotherapy regimens.     

FHL2通过MGMT影响胶质母细胞瘤U87细胞对替莫唑胺的耐药性

目的：探讨干扰四个半LIM结构域蛋白2(FHL2)的表达对胶质母细胞瘤U87细胞中O⁶-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)表达的影响，以及对U87细胞替莫唑胺(TMZ)耐药性的影响。方法：利用慢病毒感染技术分别将携带不同FHL2干扰序列的慢病毒(shFHL2-1#、shFHL2-4#)及其阴性对照(shN)感染U87细胞，分别命名为shFHL2-1#、shFHL2-4#和shN组；采用siRNA转染技术将siMGMT-1#、siMGMT-4#和siN转染至U87细胞，为siMGMT-1#、siMGMT-4#和siN组，qPCR和WB法验证FHL2或MGMT的敲低效果。用TMZ处理上述各组细胞(以DMSO处理组为对照)，随后以CCK-8法和细胞克隆形成实验检测TMZ处理前后FHL2或MGMT敲低组细胞的增殖情况，FCM检测TMZ处理前后FHL2敲低组细胞的凋亡情况，WB法和免疫荧光法检测敲低FHL2对U87细胞中MGMT表达的影响，WB法检测TMZ处理对各组细胞中FHL2和MGMT表达水平的影响。结果：成功构建敲低FHL2或MGMT表达的U87细胞。与shN组相...     

Prognostic significance of O6-methylguanine-DNA methyltransferase protein expression in patients with recurrent glioblastoma treated with temozolomide

BACKGROUND: Temozolomide (TMZ) is active against newly diagnosed glioblastoma (GBM), and O(6)-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT) is implicated in resistance to TMZ and nitrosoureas. We evaluated the efficacy and safety of the standard 5-day TMZ regimen in patients with recurrent GBM after initial therapy including nitrosourea-based chemotherapy, in conjunction with an analysis of the prognostic value of MGMT protein expression regarding response to TMZ and survival. METHODS: From September 2003 to January 2007, 30 patients having recurrent GBM received 150-200 mg/m(2)/day of TMZ for five consecutive days every 28 days. Tumor tissue from 19 patients was analysed for MGMT protein expression using western blotting, and 17 of them were assessable for a response. RESULTS: The overall response rate was 23.5% (one complete response and three partial responses). Six patients had stable disease (35.3%). Median progression-free survival (PFS) time was 2.2 months, and median overall survival (OS) time was 9.9 months from the initiation of TMZ therapy. Patients with low MGMT protein expression had a significantly improved PFS (P = 0.016) and OS (P = 0.019) compared to those with high expression. Both low MGMT expression (P = 0.040) and re-resection at relapse (P = 0.014) persisted as significant independent favorable prognostic factors for OS. The most common grade 3 and 4 hematological toxicity was lymphopenia (22.2%). CONCLUSIONS: The standard 5-day TMZ regimen resulted in moderate antitumor activity with an acceptable safety profile in patients with nitrosourea-pretreated recurrent GBM, and protein expression of MGMT is an important prognostic factor for patients treated with TMZ even after recurrence.     

Effect of lomeguatrib–temozolomide combination on MGMT promoter methylation and expression in primary glioblastoma tumor cells

Temozolomide (TMZ) is commonly used in the treatment of glioblastoma (GBM). The MGMT repair enzyme (O ⁶-methylguanine-DNA methyltransferase) is an important factor causing chemotherapeutic resistance. MGMT prevents the formation of toxic effects of alkyl adducts by removing them from the DNA. Therefore, MGMT inhibition is an interesting therapeutic approach to circumvent TMZ resistance. The aim of the study was to investigate the effect of the combination of lomeguatrib (an MGMT inactivator) with TMZ, on MGMT expression and methylation. Primary cell cultures were obtained from GBM tumor tissues. The sensitivity of primary GBM cell cultures and GBM cell lines to TMZ, and to the combination of TMZ and lomeguatrib, was determined by a cytotoxicity assay (MTT). MGMT and p53 expression, and MGMT methylation were investigated after drug application. In addition, the proportion of apoptotic cells and DNA fragmentation was analyzed. The combination of TMZ and lomeguatrib in primary GBM cell cultures and glioma cell lines decreased MGMT expression, increased p53 expression, and did not change MGMT methylation. Moreover, apoptosis was induced and DNA fragmentation was increased in cells. In addition, we also showed that lomeguatrib–TMZ combination did not have any effect on the cell cycle. Finally, we determined that the sensitivity of each primary GBM cells and glioma cell lines to the lomeguatrib–TMZ combination was different and significantly associated with the structure of MGMT methylation. Our study suggests that lomeguatrib can be used with TMZ for GBM treatment, although further clinical studies will be needed so as to determine the feasibility of this therapeutic approach.