喉癌相关基因 LCRG1蛋白的细胞亚定位及生物学特性研究

目的：研究我们实验室最近克隆的喉癌相关基因LCRG1编码蛋白的细胞定位以及其是否具有抑瘤功能。方法：采用绿色荧光蛋白（GFP）荧光定位的方法,研究该基因编码蛋白的细胞亚定位;通过绘制细胞生长曲线,以及运用转染细胞软琼脂集落形成试验和裸鼠致瘤试验,研究喉癌相关基因LCRG1在喉癌细胞系Hep-2中的生物学特性。结果：喉癌相关基因LCRG1编码的蛋白定位在细胞核内;将CLRG1cDNA导入到不表达该基因的喉癌细胞系Hep-2中,观察到明显的生长抑制作用,表现为抑制Hep－2细胞的停泊非依赖性生长和抑制裸鼠致瘤性。结论 ：喉癌相关基因LCRG1具有一定的抑瘤功能。     

绿色荧光蛋白转染胶质瘤细胞的体内实验研究

 目的　利用体外转染绿色荧光蛋白 (Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)基因的胶质瘤细胞建立大鼠移植模型 ,并探索利用该模型研究肿瘤体内侵袭的可行性。方法　携有EGFP基因的 p EGFP- N3质粒体外转染 C6胶质瘤细胞 ,筛选稳定表达 GFP的细胞克隆并以立体定向法植入 SD大鼠脑实质内建立肿瘤移植模型。 4周后处死大鼠并制作连续石蜡切片 ,相邻切片分别作 HE、免疫组化染色和荧光显微镜检测。结果　GFP于体内稳定表达 ,在荧光显微镜下可较容易区分肿瘤细胞和非肿瘤细胞 ,并能检测到侵袭至远端的单个肿瘤细胞 ,其检测效率明显高于HE和免疫组化染色。结论　EGFP基因体外转染 C6胶质瘤细胞并建立大鼠脑内肿瘤移植模型 ,是研究胶质瘤体内侵袭的有效模型和方法。     

白血病相关蛋白16亚细胞定位的研究

目的:研究白血病相关蛋白LRP16基因编码蛋白在真核细胞内的亚定位分布.方法:将LRP16全长基因序列(长型/L型)与LRP16天然缺失体编码序列(短型/S型)融合到绿色荧光蛋白pEGFP真核表达载体的N端,转染鼠成纤维NIH3T3、人乳腺癌MCF-7细胞株,观察绿色荧光的分布;采用细胞免疫荧光染色(CIF)方法和激光共聚焦显微镜进一步鉴定内源性LRP16蛋白在上皮起源性肿瘤乳腺癌MCF-7、宫颈癌Hela,人胚肾293T细胞株的亚细胞分布.结果:绿色荧光融合蛋白LRP16-pEGFP L型在NIH3T3细胞系中以细胞浆型分布为主,在MCF-7中以细胞核型分布为主,绿色荧光融合蛋白LRP16-pEGFP S型在真核细胞内呈核浆均匀分布;CIF染色结果表明内源性LRP16(长型/L型)蛋白在MCF-7、Hela和293T细胞中分别亚定位于细胞核.结论:LRP16是在上皮起源性肿瘤细胞中作为核因子参与其进展,野生型LRP16(长型/ L型)前82个氨基酸在决定LRP16亚定位方面发挥关键作用.     

Survivin基因启动子调控的肿瘤特异性表达载体的构建

目的:扩增survivin基因启动子,构建survivin启动子调控的真核表达载体,验证其在肿瘤细胞的特异性表达。方法:以Hep-2细胞基因组DNA为模板,PCR扩增survivin启动子;利用核酸内切酶双酶切sur-vivin启动子基因片段和pShuttle质粒,构建载体pSurp,酶切和测序鉴定;分别双酶切pSurp载体和pEGFP-C1载体,构建survivin启动子调控的真核表达载体pSurp-EGFP,脂质体转染Hep-2细胞及血管内皮细胞ECV304,荧光显微镜下观察EGFP的表达,Western blot方法验证该基因的蛋白表达。结果:成功扩增survivin基因启动子并构建survivin基因启动子调控的pSurp-EGFP真核表达载体。脂质体法转染Hep-2细胞和血管内皮细胞ECV304,在荧光显微镜下见Hep-2细胞发出较强的绿色荧光,而ECV304细胞没有绿色荧光;Western blot的结果也确证了EGFP蛋白仅在Hep-2细胞表达。结论:Survivin启动子的成功克隆与其真核表达载体的构建,为肿瘤的特异性基因治疗奠定了实验基础。     

Survivin基因启动子调控的肿瘤特异性表达载体的构建

目的：扩增survivin基因启动子,构建survivin启动子调控的真核表达载体,验证其在肿瘤细胞的特异性表达。方法：以Hep-2细胞基因组DNA为模板,PCR扩增survivin启动子;利用核酸内切酶双酶切sur-vivin启动子基因片段和pShuttle质粒,构建载体pSurp,酶切和测序鉴定;分别双酶切pSurp载体和pEGFP-C1载体,构建survivin启动子调控的真核表达载体pSurp-EGFP,脂质体转染Hep-2细胞及血管内皮细胞ECV304,荧光显微镜下观察EGFP的表达,Western blot方法验证该基因的蛋白表达。结果：成功扩增survivin基因启动子并构建survivin基因启动子调控的pSurp-EGFP真核表达载体。脂质体法转染Hep-2细胞和血管内皮细胞ECV304,在荧光显微镜下见Hep-2细胞发出较强的绿色荧光,而ECV304细胞没有绿色荧光;Western blot的结果也确证了EGFP蛋白仅在Hep-2细胞表达。结论：Survivin启动子的成功克隆与其真核表达载体的构建,为肿瘤的特异性基因治疗奠定了实验基础。     

染色体畸变与肿瘤发生

近年来肿瘤细胞遗传学和分子遗传学研究取得了重大进展，目前认为癌症是由多种遗传物质损伤引起的“基因疾病”，已证实肿瘤细胞染色体互易、缺失、插入和倒位致染色体特异性断裂点区域癌基因激活表达或抑癌基因缺失，导致相关编码蛋白异常和细胞生物学性状改变之间存在着某种内在联系，对此予以深入研究将有助于阐明肿瘤发生和发展机理。一、肿瘤染色体数量畸变及其生物学意义。随着免疫组织化学技术和分子生物学方法的发展和改进，已证明绝大多数肿瘤细胞中出现染色体数量异常，并存在某些特异性异常染色体。目前研究手段多采从荧光标记原…     

钙结合蛋白S100A2对肝癌细胞生长增殖的抑制作用

目的 探讨钙结合蛋白S100A2对肝癌细胞生长增殖的抑制作用。方法 构建绿色荧光蛋白－S100A2融合基因的重组表达载体,经脂质体介导转入QGY7701肝癌细胞中进行表达,应用荧光显微镜直接观察融合蛋白的表达和定位;通过肿瘤细胞集落形成实验,观察外源性S100A2表达对体外培养细胞增殖能力的影响;以流式细胞仪分析S100A2对肿瘤细胞增殖周期的影响;通过裸鼠接种实验,观察S100A2对肿瘤细胞在体内增殖能力的影响。结果 绿色荧光蛋白－S100A2融合蛋白表达、定位在胞浆和胞核,而单一的绿色荧光蛋白（载体对照）则只定位在胞浆中;细菌在液体和半固体培养基中培养的细胞集落形成率,实验组（QGY7701／A2）明显低于载体对照组（QGY7701／pc）和细胞对照组（QGY7701）;细胞周期分析显示,实验组细胞有G1和G2期阻制,DNA合成量明显减少;实验组裸鼠体内移植瘤重量明显低于两个对照组。结论 外源性S100A2可抑制QGY7701肝癌细胞在体外的集落形成和在裸鼠体内的增殖能力,并对细胞周期有阻滞作用。     

表达增强型绿色荧光蛋白的小鼠骨肉瘤体外和体内荷瘤模型的建立

背景与目的：小鼠骨肉瘤模型在骨恶性肿瘤的研究中应用较为广泛，良好的活细胞标记方法将有利于研究骨肉瘤的侵袭和转移生物学行为，本研究拟建立稳定表达增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）基因的小鼠骨肉瘤S180细胞株，同时对EGFP-S180细胞进行体内和体外的初步研究。方法：采用电穿孔转染法将EGFP基因导入小鼠骨肉瘤S180细胞，通过G418筛选,建立稳定表达EGFP蛋白的小鼠骨肉瘤EGFP-S180细胞株；激光共聚焦显微镜检测转染前后癌基因c-Myc的表达；建立相应的皮下接种和腹腔接种荷瘤小鼠模型。结果：建立了稳定表达EGFP的EGFP-S180细胞株，转染与未转染细胞的c-Myc表达差异无统计学意义（P〉0.05），小鼠皮下接种和腹腔接种成瘤的时间无显著性差异（P〉0.05）。结论：稳定表达EGFP的S180细胞株没有显著改变肿瘤细胞S180的生物学行为，建立稳定表达EGFP的S180细胞株在体内外研究的方法是可行的，为骨肉瘤体内外的示踪研究提供了实验基础。     

绿色荧光蛋白表达对检测胶质细胞瘤体内侵袭的意义

利用体外转染绿色荧光蛋白基因的胶质瘤细胞大鼠移植瘤模型,研究胶质瘤体内侵袭行为。方法：携有增强型绿色荧光蛋白（ＥｎｈａｎｃｅｄＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎ,ＥＧＦＰ）基因的ｐＥＧＦＰ－Ｎ３质粒体转染Ｃ６胶瘤细胞,筛选稳定表达绿色荧光蛋白的细胞克隆,并作流式细胞仪和电镜检测,以立体定向法植入ＳＤ大鼠脑实质内建立大鼠移植模型。４周后处死大鼠并作鼠脑连续石蜡切片,相邻切片分别作苏木素－     

eGFP标记肿瘤细胞小鼠模型的建立与应用

目的〖HT5"SS〗： 以携带绿色荧光蛋白基因（eGFP）的重组逆转录病毒（RV）标记肿瘤细胞,建立小鼠体内长期、系统肿瘤细胞研究模型,并初步探讨其应用。〖HT5W〗方法〖HT5"SS〗： 制备高滴度eGFPRV,感染小鼠白血病P388细胞,有限稀释法获得eGFP＋的单细胞克隆;在体外和DBA/2小鼠体内,分别以流式细胞术、荧光倒置显微镜、冰冻切片和普通病理切片、半固体集落培养和PCR等方法,观察小鼠体内eGFP标记肿瘤细胞的效率、定位和时效。〖HT5W〗结果 〖HT5"SS〗： eGFP基因导入率达80.2%,经克隆筛选后eGFP＋率>99.2%。P388eGFP细胞体外传代3个月后eGFP＋率为95.2%,体内序贯接种(56.3±1.25)d后eGFP+率为(93.3±0.50)% (n=3)。eGFP基因导入未影响P388细胞的体内外生物学特性。多聚甲醛灌注固定法和液氮速冻法可有效保存组织中的荧光,灌注固定法制备的标本适用于多种病理和组化染色观察;外周血、肝、脾、脑等脏器中eGFP＋细胞的分布、增殖,可用流式细胞仪和荧光显微镜等动态、定量观察,并可通过外周血的荧光细胞变化动态观察肿瘤细胞对治疗的反应;无菌获得的eGFP＋细胞可用于体外培养或体内序贯移植;PCR等技术可提高微量肿瘤细胞检测的敏感性。〖HT5W〗结论〖HT5"SS〗： 成功建立的模型可在体内外以多种方法长期、动态、敏感地追踪观察荧光标记的肿瘤细胞,可广泛应用于肿瘤和细胞组织工程等领域。