HPV阳性宫颈癌细胞特异性穿膜肽PTP的穿膜特性研究

目的：证实宫颈癌细胞特异性细胞膜穿透肽特异性穿膜并优化穿膜条件。方法：将编码人乳头瘤病毒（HPV）阳性宫颈癌细胞特异性穿膜肽（PTP）的cDNA片断与编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因片断融合,克隆至原核表达质粒pET15b克隆位点,构建pET15b-GFP-PTP重组原核表达载体。转化大肠杆菌BL21(DE3)并表达GFP-PTP融合蛋白,纯化后的GFP-PTP融合蛋白作用于体外培养的HPV阳性宫颈癌细胞株HeLa,Siha,肺癌细胞株A549及正常脐静脉内皮细胞ECV304。利用合成的标记短肽探讨优化穿膜条件。结果：荧光显微镜观察发现,与融合蛋白GFP-PTP共孵育后的Hela和Siha细胞胞浆及胞核内有绿色荧光均匀分布,而A549及ECV304胞内无绿色荧光。与GFP共孵育的任何细胞内均无绿色荧光。流式细胞术分析结果显示PTP对HeLa,Siha细胞的穿膜效率分别为33.2％和28.9％。10% DMSO处理细胞后可增强PTP特异性穿透HPV阳性宫颈癌细胞株的胞膜并改善胞浆内分布。结论：本研究结果为进一步探讨PTP作为宫颈癌防治的靶向导入载体奠定了基础。     

跨膜型超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A融合蛋白的抗肿瘤作用

目的　为扩大超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)的抗瘤谱 ,制备跨膜型SEA融合蛋白 ,研究该蛋白制备的肿瘤疫苗的抗肿瘤作用。方法　在荷B16黑色素瘤的C5 7BL/ 6小鼠上 ,观察跨膜型SEA融合蛋白制备的肿瘤疫苗对荷瘤小鼠的免疫治疗作用和免疫保护作用 ,并通过乳酸脱氢酶 (LDH)释放法检测治疗组和免疫组小鼠脾细胞的天然杀伤细胞(NK)和细胞毒性T细胞 (CTL)活性。结果　融合蛋白制备的肿瘤疫苗能够显著抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长 ,并延长其生存期 ,其脾细胞的NK和CTL活性显著增强。同时 ,该肿瘤疫苗对同种肿瘤细胞攻击可产生较强的免疫保护作用。结论　跨膜型SEA融合蛋白制备的肿瘤疫苗具有显著的抗肿瘤作用 ,可有效激发荷瘤小鼠机体的特异性和非特异性抗肿瘤免疫应答 ,增强CTL和NK活性。     

丙烯酰胺致NB-1细胞突触损伤与SNARE效应相关性研究

目的构建人神经母细胞瘤NB-1细胞神经元突触损伤的细胞模型,探讨丙烯酰胺(acrylamide,ACR)对神经突触损伤的机制。方法将NB-1细胞通过二丁酰环腺苷酸(db-c AMP)诱导为成熟神经元后,MTT检测ACR不同剂量(0、25、50、100、150、200和250μg/ml)和不同染毒时间(24、48和72 h)对NB-1细胞相对存活率的影响;免疫印记(western blot)技术检测神经元突触损伤前后突触素I(Synapsin I)磷酸化和非磷酸化蛋白表达变化,光学显微镜和电子显微镜记录神经元突触损伤前后形态、结构变化,免疫共沉淀试验确定神经元突触损伤前后N-甲基马来酰胺敏感因子(NSF)附着蛋白受体(SNARE)的结合/解离的变化。结果根据MTT试验结果确定ACR染毒剂量为0、25、50和100μg/ml,染毒时间为48 h;随着ACR染毒剂量的增加Synapsin I磷酸化和非磷酸化蛋白表达降低;在25μg/ml ACR染毒剂量下可见兴奋性和抑制性神经递质,而在50μg/ml染毒剂量下可见抑制性递质;随ACR染毒剂量的增加SNARE复合体中突触融合蛋白(syntaxin)和突触小体相关蛋白(SNAP-25)呈解离状态。结论 ACR对NB-1细胞突触损伤后,SNARE复合体中syntaxin和SNAP-25结合状态与Synapsin I、P-Synapsin I蛋白表达降低呈正相关,与P-Synapsin I/Synapsin I差异性表达呈负相关;突触内特异性神经递质的传递和释放可能与P-Synapsin I/Synapsin I差异性表达所调控的SNARE复合体的解离状态导致的突触功能损伤相关。     

TAT-tCNTF融合蛋白对Aβ_(25-35)诱导SH-SY5Y细胞损伤的保护作用

目的确定TAT-tCNTF融合蛋白能够透过细胞膜进入细胞内,并研究其对Aβ诱导SH-SY5Y细胞损伤的保护作用。方法重组PCR获得人截短型CNTF基因后,与pBV220-TAT载体连接,在大肠杆菌中表达,细胞免疫荧光方法检测TAT蛋白运载融合蛋白穿过SH-SY5Y细胞膜的作用,Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞产生神经毒性,采用MTT(四甲基偶氮唑盐)法检测融合蛋白对细胞存活率的影响,Heochst33342/PI荧光双染法进行细胞凋亡和坏死的形态学观察,并进行LDH释放分析进一步检测TAT-tCNTF对细胞损伤后的保护作用。结果成功构建pBV220-TAT-tCNTF表达载体,Western blot结果表明重组融合蛋白可以与CNTF抗体特异性结合,细胞免疫荧光方法显示TAT-tCNTF能大量进入细胞,而rhCNTF只有微量进入细胞。对Aβ25-35诱导损伤的SH-SY5Y细胞MTT、Heochst33342/PI荧光双染法及LDH分析都表明TAT-tCNTF能明显提高细胞的存活率。结论TAT-tCNTF融合蛋白可以跨越细胞膜,能够保护Aβ25-35诱导损伤的SH-SY5Y细胞,具有促进细胞生存生长的活性。     

免疫应答过程中的分子生物学和生物化学事件

自1957年Burnet提出种系选择学说开创现代免疫学以来,免疫应答过程中免疫活性细胞如何从接受抗原(Ag)刺激开始进行分化增殖并产生与刺激物具有高度特异性的蛋白效应物质,一直被认为是免疫学的一只“黑匣子”。根据生物学中心法则,免疫应答的过程可以理解或解释为Ag信号刺激免疫活性细胞膜并产生膜事件,而膜事件信号传递到胞浆内进而再传递到核内,在与免疫相     

pET15b-pep-1-p27mt的构建、表达及意义

构建细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides,CPPs)PEP-1和细胞周期抑制蛋白p27mt的重组体,并在大肠杆菌中表达。将已构建的表达细胞周期抑制蛋白p27mt的基因,克隆入pET15b-pep-1原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)LysS内,以IPTG诱导融合蛋白表达。表达产物用SDS-PAGE及Western blot分析鉴定。结果:成功地构建PEP-1-p27mt融合蛋白原核表达载体,并在IPTG诱导下获得特异性的表达。PEP-1-p27mt融合蛋白表达载体的构建,为体内应用细胞周期抑制蛋白诱导肿瘤细胞凋亡提供了理论基础。     

GST-TAT-P53c融合蛋白的表达及对p53基因突变型肿瘤细胞的促凋亡作用

目的研究P53蛋白C端(P53c)对p53基因突变型肿瘤细胞SW480的促凋亡作用。方法用人类免疫缺陷病毒TAT蛋白的蛋白转导域(TAT)将P53c运载进入肿瘤细胞,用氧依赖性降解区域(ODD)控制P53c在组织中的稳定性。通过PCR方法制备TAT-ODD-p53c(TOPc),TAT-p53c(TPc)及p53c基因,与pGEX4T载体连接后在大肠杆菌中表达谷胱甘肽-S-转移酶(GST)-TAT-ODD-P53c(GST-TOPc),GST-TAT-P53c(GST-TPc)及GST-P53c等融合蛋白。免疫组化方法检测TAT蛋白运载融合蛋白穿过SW480细胞膜的作用,MTT法检测融合蛋白对SW480细胞活力的影响,流式细胞仪检测致SW480细胞凋亡作用。结果成功构建pGEX系列表达载体,并在大肠杆菌中可溶性表达。Western印迹结果表明,重组蛋白可以和GST单克隆抗体特异性结合。免疫组化显示GST-TPc,GST-TOPcm及GST-TOPc均能进入SW480细胞,GST-TPc能明显降低SW480细胞活性,导致SW480细胞凋亡。含ODD的融合蛋白在常氧环境中对肿瘤细胞有轻度促凋亡作用。结论TAT可以介导其融合蛋白跨越细胞膜。GST-TPc可引起p53突变型肿瘤细胞凋亡。     

重组融合蛋白抗CD20Fab-LDM的构建、表达及体外活性研究

目的构建和表达抗CD20Fab-LDP(力达霉素辅基蛋白)融合蛋白,制备强化融合蛋白抗CD20Fab-LDM(力达霉素),并测定该融合蛋白的生物学活性。方法采用PCR和overlapPCR方法构建抗CD20Fab-LDP融合蛋白,并用双脱氧终止法测定DNA序列;采用亲和层析法纯化该产物,并用Western blot鉴定纯化产物;采用FACS方法鉴定纯化产物与靶细胞的结合活性;采用冷乙二醇法制备强化融合蛋白抗CD20Fab-LDM;采用MTT法鉴定抗CD20Fab-LDM对CD20+Raji细胞特异性的细胞毒作用。结果DNA序列测定结果表明抗CD20Fab-LDP融合蛋白已构建成功,可溶性表达产物的产量可达4mg.L-1以上,具有与Raji细胞(CD20+)结合的活性,与抗CD20Fab的亲合常数相当,抗CD20Fab-LDM体外能特异性杀伤Raji细胞,IC50值为0.9×10-10mol.L-1。结论成功地构建了抗CD20Fab-LDP融合蛋白,并获得可溶性高效表达,表达产物具有与相应靶抗原结合的活性,并成功制备了抗CD20Fab-LDM强化融合蛋白,体外能特异性杀伤CD20+的Raji细胞。     

mB7.1-GPI膜表面修饰的结肠癌细胞疫苗的抗肿瘤作用研究

目的制备mB7.1-GPI膜表面修饰的结肠癌细胞疫苗,并探讨其抗肿瘤作用。方法将mB7.1-GPI融合蛋白锚定于小鼠结肠癌细胞膜上,制备结肠癌细胞疫苗,并采用流式细胞术检测该蛋白的细胞膜锚定效果;建立C57BL/6小鼠结肠癌模型,检测mB7.1-GPI融合蛋白肿瘤疫苗对荷瘤小鼠的免疫治疗作用。结果 mB7.1-GPI融合蛋白可锚定在小鼠结肠癌细胞膜上,并有效刺激小鼠脾细胞增殖和分泌IL-2和IFN-γ,mB7.1-GPI膜表面修饰的结肠癌细胞疫苗能够显著抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长,并延长其生存期。结论 mB7.1-GPI融合蛋白制备的结肠癌细胞疫苗具有较强的抗肿瘤作用,可能成为一种有效的、用于结肠癌的治疗和预防的新型疫苗。     

抗人EGFRvⅢex单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的研制抗人表皮生长因子受体突变体Ⅲ胞外区(EGFRvⅢex)单克隆抗体(mAb),并鉴定其特性。方法采用原核表达的EGFRvⅢex蛋白免疫BALB/c小鼠,以间接ELISA法筛选分泌特异性mAb的杂交瘤细胞,采用蛋白印迹、间接免疫荧光和免疫组化染色鉴定mAb的特异性。结果获得1株可稳定分泌mAb的杂交瘤细胞株。mAb的Ig亚类为IgM,效价为10-6。mAb可识别U87细胞膜上稳定转染的人EGFRvⅢex和SPC-A1细胞膜上高表达的EGFR。结论成功制备1株抗EGFRvⅢex的mAb,经蛋白印迹、免疫荧光和免疫组化染色检测,mAb的特异性良好,能够检测细胞上的EGFR和EGFRvⅢex,为肿瘤的治疗提供了良好的手段。     

治疗慢性粒细胞白血病新药imatinib

慢性粒细胞白血病（CML）患者体内有异常染色体形成并产生BCR－ABL融合蛋白,该融合蛋白能激活酪氨酸激酶,刺激细胞过度增生导致慢性粒细胞白血病的发生。imatinib(格列卫）能特异性抑制BCR－ABL,抑制信号传导,减少细胞增生并使细胞凋亡,从而有效治疗慢性粒细胞白血病。     

新穿膜融合蛋白His-T1-绿色荧光蛋白的跨膜效率及其对细胞存活的影响

目的研究穿膜融合蛋白His-T1-绿色荧光蛋白(GFP)的跨膜效率及其对细胞存活的影响。方法以浓度为500mg·L-1的His-T1-GFP与人鼻咽癌CNE2或大鼠肾小管上皮NRK52E细胞孵育6h,应用荧光显微镜观察His-T1-GFP跨膜进入细胞的情况。应用多功能酶标仪检测细胞荧光强度,研究His-T1-GFP跨膜的动力学因素:以浓度为500mg·L-1的His-T1-GFP与CNE2或NRK52E细胞孵育10min至24h,观察孵育时间对穿膜作用的影响;以浓度为25mg·L-1至1.0g·L-1的His-T1-GFP与两种细胞孵育6h,观察蛋白浓度对跨膜效率的影响;以浓度为500mg·L-1的His-T1-GFP与两种细胞分别在4℃和37℃的条件下孵育6h,观察温度对蛋白跨膜效率的影响。用细胞乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒和MTT法来评价5.0g·L-1浓度的His-T1-GFP对细胞存活的影响。结果在一定浓度范围内,His-T1-GFP能够有效穿透CNE2和NRK52E细胞膜,且对NRK52E细胞的跨膜效率明显高于His-TAT-GFP。His-T1-GFP在10min内就能有效跨膜进入细胞,并且在6h内进入细胞的量与时间成正相关。在一定浓度范围(25mg·L-1~1.0g·L-1)内,该蛋白进入细胞的量与自身浓度成正相关,而在4℃时该蛋白仍具有跨膜能力。当其终浓度高达5.0g·L-1时,对CNE2和NRK52E两种细胞几乎无毒性作用。结论His-T1-GFP蛋白是一种跨膜效率高且低毒的穿膜融合蛋白。     

真核表达重组小鼠IL-15/Fc融合蛋白的制备和活性鉴定

目的 制备真核表达小鼠白细胞介素15(IL-15)和IgGγ1 Fc段融合蛋白,并探讨其对抗原特异性CD8+T细胞的作用.方法 运用RT-PCR方法,从B6小鼠脾细胞中分离小鼠IL-15和IgG γ1绞链区-CH2-CH3 Fc cDNA.在IL-15 3'端和Fc 5'端引入BamH I酶切位点,将IL-15和Fc直接连接,构建小鼠IL-15/Fe融合蛋白基因,再连接到真核表达质粒载体pcDNA3.1(a+)上,转化CHO-S细胞表达、纯化后,研究其活性.结果 融合蛋白486 bp的编码由162个氨基酸组成,其中含48个信号肽氨基酸的小鼠IL-15前体蛋白和由681 bp编码227个氨基酸的IgGγ1-CH2-CH3功能区构成;表达蛋白在IL-15信号肽引导下能高效分泌到培养液中,有二聚体和三聚体两种天然结构,单体分子量约50 kDa,能特异性的结合IL-15R并抑制抗原诱导的CD8+T细胞的增殖反应.结论 成功构建了小鼠IL-15/Fc融合蛋白真核表达载体,并在CHO-S细胞中得到高效表达.此融合蛋白具有较高的生物学活性,可有效地抑制抗原特异性CD8+细胞的增殖反应.     

反式激活蛋白-氧依赖性降解结构融合结构域介导蛋白跨膜转运和氧依赖性降解作用

目的研究反式激活蛋白(TAT)蛋白转导结构域介导的融合蛋白的跨膜转运,以及氧依赖性降解(ODD)结构域介导融合蛋白在体内外不同氧分压环境中的降解作用。方法将TAT,ODD以及增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因序列进行融合,构建了TAT-ODD-EGFP融合蛋白基因。将该序列克隆到原核表达载体pET28a中,在BL21工程菌中进行表达,通过亲和柱层析法纯化,得到高纯度的融合蛋白。同方法制备EGFP和TAT-EGFP融合蛋白作为对照。在20%O2和1%O2将融合蛋白与A549,H1299和MDA-MB-231细胞系孵育,荧光显微镜下观察融合蛋白在细胞中的分布以及稳定性。小鼠尾静脉注射不同融合蛋白(10 mg.kg-1),分别在注射后1,6和12 h处死动物,取脏器在荧光显微镜下观察融合蛋白的分布及稳定性。结果由于EGFP相对分子质量大,无法穿透细胞及组织。TAT可以有效地介导TAT-EGFP进入细胞和动物实体组织,其稳定性不受细胞或组织中氧分压的影响,而TAT-ODD-EGFP进入细胞或组织后,在20%O2条件下迅速降解,但可稳定存在于1%O2细胞及组织中。结论 TAT可以有效地转导融合蛋白穿过细胞膜。引入ODD,20%O2下融合蛋白TAT-ODD-EGFP迅速降解,但可以稳定存在于1%O2细胞和组织中,说明TAT-ODD可以转导蛋白进入并靶向存在于低氧的肿瘤组织中。     

揭示登革热的治疗靶点

近期资料表明，登革热病毒包膜蛋白在与宿主细胞融合过程中发生形态改变，为一些病毒性疾病治疗药物的开发提供了重要线索。包膜病毒被膜中的特异性蛋白被分成两类：一类融合蛋白存在于HIV和流感病毒及其他一些病毒的表面，在结构上与二类融合蛋白存在区别；二类蛋白存在于另外一些病毒的被膜上，这些病毒是如下疾病的主要起因：如登革热、丙型肝炎、西尼罗河热和黄热病。     

pET15b-GFP-HCTP、pETl5b-Apoptin-HCTP原核表达载体的构建、表达及其意义

目的：HCTP（HPV tansformed cervical cancer cell targeting penetratin HCTP）是新近发现的一种能特异性识别并穿透HPV转化宫颈癌细胞胞膜的短肽。构建HCTP与绿色荧光蛋白（GFP）、凋亡素（Apoptin）的重组表达载体，原核系统表达并纯化出GFP-HCTP、Apoptin-HCTP融合蛋白，研究HCTP的特异性靶向穿膜效应。方法：根据美国NIH基因库收藏的Apoptin基因序列，利用多重PCR技术拼接出Apoptin cDNA、运用PCR方法以pEGFP-C1质粒为模版扩增获得GFP cDNA片段，将Apoptin及GFP cDNA分别与退火形成的HCTP双链连接并克隆至原核表达载体pETl5b，成功构建pETl5b-GFP-HCTP、pETl5b-Apoptin-HCTP重组表达载体。DNA测序证实重组构建无误，用上述两个重组表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3）．以IPTG诱导融合蛋白表达并用Ni-NTA His-Bind Resin蛋白纯化试剂纯化，获得可溶性基因重组融合蛋白GFP-HCTP和Apoptin-HCTP。运用SDS-PAGE及Western blot分析鉴定目的蛋白。结果：成功构建pETl5b-GFP-HCTP、pETl5b-Apoptin-HCTP原核表达载体，经表达、纯化制备了GFP-HCTP和Apoptin-HCTP基因重组融合蛋白。结论：我们使用基因工程技术，经原核表达系统表达制备的GFP-HCTP和Apoptin-HCTP融合蛋白将为进一步研究HCTP的特异穿膜效应以及探讨HCTP作为宫颈癌治疗药物的靶向运送载体提供实验基础。     

抗SARS病毒融合蛋白单克隆抗体的制备与初步鉴定

用基因工程技术表达的SARS-CoV S蛋白片段和N蛋白片段的融合蛋白作抗原免疫Balb/c小鼠,将免疫鼠脾细胞与Sp2/0细胞融合,经ELISA法筛选阳性克隆及测定效价,用免疫印迹法进行特异性鉴定。最终获得2株(1F11和3D2)能稳定分泌抗SARS-CoV融合蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。其培养上清的ELISA效价分别为1∶1024和1∶512;腹水效价分别为:1×10-6,2×10-5。1F11株识别融合蛋白上的N抗原表位,3D2识别其上的S抗原表位。该单抗可望成为快速诊断SARS-CoV感染的特异性抗体。     

FGF21-Fc融合蛋白体外活性试验的建立和优化

成纤维细胞生长因子-21(FGF21)-Fc融合蛋白体外活性试验的建立分为蛋白水平的结合活性试验和细胞水平的生物学活性试验2种。该研究建立了均相时间分辨荧光(HTRF)法用于检测FGF21-Fc融合蛋白与β-Klotho配体蛋白的结合活性;并自主构建了报告基因细胞,当FGF21-Fc融合蛋白与β-Klotho的结合,激活其FGF受体和诱导胞内信号转导所必需的共同受体,可通过检测萤光素酶活性,间接定量测定生物学活性。在建立过程中,分别对结合活性试验中样品和配体的浓度、供体和配体的稀释比例以及孵育时间进行优化,并进行了方法学验证,证明该HTRF技术具有良好的重复性和特异性,可用于FGF21-Fc融合蛋白和β-Klotho的结合活性检测。随后,对生物学活性试验中胎牛血清的浓度、报告基因细胞的密度、试验板的类型以及细胞种板形式进行优化,并进行了方法学验证,证明该报告基因法具有良好的重复性和特异性,可用于FGF21-Fc融合蛋白的生物学活性检测。本研究建立了FGF21-Fc融合蛋白的质控方法,为有同样活性检测难点的药物提供了一种分析技术参考,填补了国内外空白。     

作用于病毒细胞融合过程的药物

美国Trimeris制药公司正在开发一类阻挡病毒进入细胞的化合物。他们正注重于包膜病毒与细胞膜的融合过程，这个病毒生命循环的关键步骤允许病毒将其遗传物质DNA或RNA注入宿主细胞。膜融合是真核细胞的普遍过程，对于免疫缺陷病毒（HIV），感染的细胞之间的传递也是一种融合过程。导向化合物Pentafuside来自于HIV一1包膜糖蛋白的一部分，它是HIV-1融合抑制剂。HIV－1的表面带有糖蛋白gP120和gP41的寡聚复合体，在自然和静止状态下，两个gP120和两个gP41的杂寡聚物通过非共价蛋白-蛋白作用相联，gP41介导与细胞的融合，“融合区”被…     

抗体——超抗原融合蛋白及其应用的研究进展

超抗原(Superantigen,SAg)是一类具有多种免疫活性的蛋白分子,在一定条件下能比普通抗原十至数千倍激活T细胞和抗原呈递细胞。超抗原能引导T细胞产生细胞毒作用(SDCC)和诱导产生一些细胞因子来杀伤肿瘤细胞。然而单用SAg效果差,毒副作用强,其作用受到限制。研究表明使用肿瘤特异性的单抗Fab-SAg融合蛋白,能比单用SAg取得更稳定、更明显的效果。该融合蛋白对肿瘤部位的靶向性强、亲和力高,并能很好地减少系统的免疫原性。另外发现使用突变的Fab-SAg融合蛋白,能进一步增加动物的耐受性、降低毒副作用。目前已有多个用单抗Fab-SAg融合蛋白药物进入临床研究,该药物将会为治疗人类恶性肿瘤带来希望。