氢气预处理对乳鼠海马神经元细胞缺氧/复氧损伤后细胞活力的影响

目的探讨氢气对乳鼠海马神经元细胞缺氧/复氧损伤后细胞活力的影响。方法原代培养的SD乳鼠海马神经元细胞,随机分成对照组,缺氧/复氧组和氢气预处理组。对照组常规培养;缺氧/复氧组在100%N2中培养15min后复氧30min;氢气预处理组在2%H2+98%N2中培养15min后复氧30min。采用MTT法检测乳鼠海马神经元细胞活力。结果氢气预处理能够增强细胞活力(P<0.05)。结论氢气预处理对海马神经元细胞缺氧/复氧损伤具有保护作用,可能与提高细胞活力有关。     

CircTLK1通过miR-424-5p/FBXO3轴对氧糖剥夺/复氧诱导的神经细胞损伤的影响

目的 探讨环状RNA TLK1(CircRNA TLK1,CircTLK1)对氧糖剥夺/复氧(Oxygen glucose deprivation/Reoxygenation,OGD/R)诱导的神经元HT22损伤的影响以及对微小RNA(microRNA,miR)-424-5p/F-box蛋白3(F-box protein 3,FBXO3)的调控作用。方法 将HT22细胞分为对照组、OGD/R组、sh-NC组、沉默环状RNA TLK1(Silencing circular RNA tlk1,sh-circTLK1)组、sh-circTLK1+抑制剂NC组、sh-circTLK1+miR-424-5p抑制剂组、sh-circTLK1+miR-424-5p抑制剂+sh NC组、sh-circTLK1+miR-424-5p抑制剂+sh FBXO3组,除对照组外其余各组细胞均行OGD/R操作,细胞计数试剂盒8(Cell counting Kit 8,CCK-8)法测定HT22细胞活力; 脂连蛋白V-异硫氰酸荧光素(Adiponectin V-fluorescein isothiocyanate,Annexin V-FITC)细胞凋亡试剂盒测定HT22细胞凋亡; 测定HT22细胞乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)漏出率; 实时荧光定量聚合酶链反应(Real time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RT-qRCR)法测定HT22细胞miR-424-5p,FBXO3 mRNA水平; 蛋白免疫印记法(Western Blot)检测B淋巴细胞瘤-2关联基因X(B lymphoma-2 gene association X,Bax)、活化半胱天冬酶-3(Cleaved caspase-3)、FBXO3水平; 双荧光素酶测定CircTLK1与miR-424-5p以及miR-424-5p与FBXO3靶向关系,并使用RNA下拉实验验证CircTLK1与miR-424-5p关系。结果 与对照组比较,OGD/R组miR-424-5p,HT22细胞活力降低(P<0.05),circTLK1,FBXO3 mRNA水平,HT22细胞凋亡率、Bax,Cleaved caspase-3水平、LDH漏出率升高(P<0.05); 与OGD/R组比较,sh-circTLK1组HT22细胞活力增加(P<0.05),HT22细胞凋亡率、Bax,Cleaved caspase-3水平,LDH漏出率降低(P<0.05); 与sh-circTLK1组比较,sh-circTLK1+miR-424-5p抑制剂组细胞活力降低(P<0.05),HT22细胞凋亡率、Bax,Cleaved caspase-3水平、LDH漏出率升高(P<0.05); 与sh-circTLK1+miR-424-5p抑制剂组比较,sh-circTLK1+miR-424-5p抑制剂+sh FBXO3组细胞活力升高(P<0.05),HT22细胞凋亡率、Bax,Cleaved caspase-3水平、LDH漏出率降低(P<0.05); CircTLK1与miR-424-5p以及miR-424-5p与FBXO3均存在靶向关系。结论 CircTLK1沉默可能通过调控miR-424-5p/FBXO3对OGD/R诱导的HT22细胞损伤来发挥保护作用。     

PC12细胞化学缺氧复氧损伤与缺氧诱导因子1表达的关系

目的 研究缺氧诱导因子1(HIF1)在PC12细胞化学缺氧复氧损伤中的作用。方法 在培养液中加入和去除氯化钴模拟化学缺氧和复氧，以乳酸脱氢酶(LDH)漏出和细胞超微结构改变作为细胞损伤指标，观察化学缺氧和复氧后不同时间细胞损伤和HIF1 α蛋白变化。结果 在氯化钴模拟化学缺氧实验中，LDH漏出明显增加，8h达高峰，随后逐渐下降，电镜结果与LDH改变相一致，HIF1 α蛋白表达在化学缺氧后2，4，8和12h均明显增加，8h达高峰，提示化学缺氧8h后细胞损伤逐渐减轻可能与HIF1 α蛋白水平升高有关。在模拟复氧实验中，LDH和细胞形态学改变都显示化学复氧8h细胞损伤最为严重，而HIF1 α蛋白表达在化学复氧4和8h均明显下降，提示细胞化学复氧损伤可能与HIF1 α蛋白水平下降有关。结论 HIF1对神经细胞化学缺氧复氧损伤具有保护作用。     

制备神经细胞实验性缺氧缺糖模型的简易方法

背景: 在神经细胞培养中实验性缺氧缺糖在一定程度上模拟缺血性卒中,对于研究缺血性神经元损伤的进程和病理生理学机制有非常重要的用处。 目的：在神经元培养时制作实验性缺氧缺糖模型。 设计、时间及地点：分组对照观察,实验于2007-01/2008-03在北京大学第三医院中心实验室完成。 材料：17~19 d胎龄的Wistar大鼠。 方法：细胞培养取17~19 d胎龄的Wistar大鼠的皮质神经元做原代细胞培养,并且去掉污染的非神经原细胞。缺氧缺糖的诱导分为3组：实验组将第7天的皮质神经元置于无糖平衡盐溶液和2%去氧酶中,在37 ℃的潮湿保温箱中培育。空白对照组培养基为含20 mmol/L葡萄糖的无去氧酶平衡盐溶液。假性实验组培养基为含20 mmol/L葡萄糖和失活的去氧酶平衡盐溶液。 主要观察指标：以血气分析进行氧浓度的测定;以相差显微镜观察实验组培养细胞神经元死亡状况;以用乳酸脱氢酶检测盒检测乳酸脱氢酶活性;以锥虫蓝染色观察缺氧缺糖对神经元存活力的影响。 结果：氧浓度测定显示在加入去氧酶后培养基迅速产生缺氧状态;乳酸脱氢酶检测显示在用去氧酶和无糖平衡盐处理后,培养基中乳酸脱氢酶释放显著增加;锥虫蓝染色和相差显微镜检查显示经去氧酶和无糖平衡盐处理后实验组的细胞活力明显下降,大部分神经元在6 h死亡。 结论：实验结果显示去氧酶与无糖平衡盐液可联合用于神经元培养时产生缺氧缺糖状态, 其在体外模拟脑缺血的相关研究中有重要作用。     

γ-羟基丁酸对神经细胞缺氧复氧损伤的保护作用与γ-氨基丁酸及其A受体的关系

目的探讨γ-羟基丁酸(GHBA)对大鼠皮层神经元缺氧复氧损伤的保护作用与γ-氨基丁酸(GABA)和GABA受体A型α1亚型(GABAARα1)阳性神经元表达的关系。方法采用原代培养新生大鼠皮层神经元缺氧复氧损伤模型,分为缺氧前GHBA干预组、缺氧后GHBA干预组和未干预组．于复氧24h后,观察细胞存活数、GABA和GABAARα1阳性神经元的表达。结果(1)GHBA干预各组皮层神经元细胞存活数、GABA和GABAARα1阳性细胞数均高于相应未干预组(P<0．05)。(2)缺氧前GHBA干预组细胞存活数、GABA和GABAARα1阳性细胞表达数均高于相对应缺氧后干预组(P<0．05)。结论GHBA可通过上调GABA和GABAARα1阳性神经元的表达水平对缺氧复氧皮层神经元发挥保护作用。     

缺氧／复氧对星形胶质细胞AQP4表达的影响

目的 探讨缺氧/复氧对于体外培养星形胶质细胞表达AQP4的影响及缺血性脑血管病脑水肿的发病机制.方法 选取新生24 h Wistar大鼠脑组织行星形胶质细胞原代培养并建立缺氧/复氧模型,应用Western blot和免疫细胞化学法检测星形胶质细胞AQP4的表达变化.结果 与对照组比较,缺氧3 h和6 h星形胶质细胞AQP4蛋白表达减少(P<0.01),复氧后6 h和9 h其表达明显增高(P<0.01).结论 AQP4表达变化与细胞损害相关.     

孕酮对原代培养海马神经细胞谷氨酸损伤的保护作用

目的观察孕酮对原代培养海马神经细胞谷氨酸损伤的保护作用。方法取新生大鼠海马神经细胞进行体外原代培养,建立谷氨酸对培养海马神经细胞兴奋毒性损伤模型,在相差显微镜下观察孕酮处理前后神经细胞形态变化,乳酸脱氢酶活性测定试剂盒检测细胞培养上清乳酸脱氢酶漏出量。结果孕酮组神经细胞部分形态保持较好,生长情况明显好于谷氨酸组,乳酸脱氢酶漏出量较谷氨酸组减少。结论孕酮对体外培养的海马神经细胞谷氨酸兴奋毒性损伤具有保护作用。     

p38MAPK在体外培养星形胶质细胞缺氧/复氧损伤中的表达

目的 建立SD大鼠星形胶质细胞缺氧复氧损伤模型,探讨p38MAPK活性变化与星形胶质细胞损伤的关系.方法 体外培养新生SD大鼠星形胶质细胞,实验设正常对照组（N）、SB203580组（SB组,10 μmol/L）、缺氧/复氧组（H/R组）和缺氧/复氧组＋SB203580阻断p38MAPK组（H/R＋SB组）.应用MTT法、WB法、ELISA法检测缺氧4 h、8 h、复氧6 h、12 h、24 h、48 h时细胞存活率,p38MAPK、p-p38（磷酸化p38MAPK）及TNF-α的变化.结果 培养星形胶质细胞GFAP阳性表达率大于97%.缺氧/复氧使星形胶质细胞活力降低,SB203580阻断p38MAPK细胞活力高于H/R组,各组星形胶质细胞总p38MAPK水平无显著变化,缺氧复氧干预后p-p38表达上调,TNF-α水平显著增高.用SB203580阻断p38MAPK通路后,SB＋H/R组较H/R组p-p38、TNF-α水平降低.SB组总p38MAPK、p-p38、TNF-α水平与N组比较无显著变化.结论 p38MAPK信号通路参与了星形胶质细胞缺氧复氧损伤过程.     

大鼠成年海马神经干细胞体外氧糖剥夺/复氧模型的建立

目的 探讨一种简便、稳定、可重复的大鼠成年神经干细胞体外氧糖剥夺/复氧模型的制备方法 .方法 以来自于成年Fisher344大鼠的海马神经干细胞系为研究对象,以无血清培养基培养并传代,并用nestin和DAPI免疫荧光双染确认其生物学特性.将三气培养箱氧气浓度调至1％以制备缺氧环境,将培养基换为不含葡萄糖的Earle′s平衡盐溶液,分别缺氧缺糖2h、4h、6h、8h、10h后取出细胞,恢复正常条件继续培养24 h后倒置显微镜下观察细胞形态学变化,CCK-8比色法检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡率.同时设置常氧常糖的正常对照组.结果 与正常对照组相比,缺氧缺糖2h组细胞吸光度值明显升高,细胞存活率有一定的增长,但差异无统计学意义(P＞0.05).随着缺氧缺糖时间延长,神经干细胞形态学损伤逐渐加重,细胞吸光度值逐渐下降,缺氧缺糖6h后与正常对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05);缺氧缺糖6h起细胞存活率均较正常对照组明显下降,比较差异有统计学意义(P＜0.05);神经干细胞凋亡率逐渐增高,且均明显高于正常对照组,差异有统计学意义(P＜0.05),其中缺氧缺糖6h时细胞的凋亡率已超过50％.结论 利用三气培养箱物理缺氧方法 可成功建立一种简便、有效的神经干细胞体外氧糖剥夺/复氧模型.     

灯盏细辛对缺氧复氧损伤的PC12细胞保护机制的研究

目的 探讨灯盏细辛对缺氧复氧（HR）损伤的PC12细胞保护机制。方法 将体外培养的PC12细胞分为正常对照（NC）组、HR组、灯盏细辛10μmol／L（E1）组、20μmol／L（E2）组、30μmol／L（E3）组。将HR组及E1～E3组细胞经HR处理后,测定各组细胞的存活率;通过Western Blot方法观察各组细胞Bcl-2和Bax蛋白含量的变化。结果 （1）与NC组比较,HR组的细胞存活率明显下降（P〈0．01）;与HR组比较,E1-E3组细胞存活率明显升高（均P〈0．01）,且呈剂量依赖性（P〈0．01）。（2）与NC组比较,HR组PC12细胞Bcl-2蛋白表达明显下降,Bax蛋白表达明显增加（均P〈0．01）;与HR组比较,E1-E3组PC12细胞Bcl-2表达明显增加,Bax表达明显下降,并呈剂量依赖性（均P〈0．01）。结论 灯盏细辛对HR损伤的PC12细胞保护作用是通过增加Bcl-2表达、抑制Bax表达的抗凋亡作用实现的。     

Triptolide protects astrocytes from hypoxia/ reoxygenation injury

Astrocytes in an in vitro murine astrocyte model of oxygen and glucose deprivation/hypoxia and reoxygenation were treated with different concentrations of triptolide (250, 500, 1 000 ng/mL) in a broader attempt to elucidate the protection and mechanism underlying triptolide treatment on astrocytes exposed to hypoxia/reoxygenation injury. The results showed that the matrix metalloproteinase-9, interleukin-1β, tumor necrosis factor α and interleukin-6 expressions were significantly decreased after triptolide ...     

低氧预适应小鼠脑匀浆液提取液对大鼠鼠胚海马神经元缺氧复氧后神经细胞的影响

目的 探讨低氧预适应小鼠脑匀浆液提取液对大鼠鼠胚海马神经元缺氧复氧后神经细胞活性和凋亡的影响. 方法在96孔培养板中将大鼠鼠胚海马神经细胞原代培养至8 d,将培养细胞按照处理的不同分为以下5组:(1)正常对照组(仅加入PBS)、(2)H<,4>R<,48>组(缺氧4 h/复氧48h后加PBS)、(3)H0组(缺氧4 h/复氧48 h前加正常小鼠脑匀浆提取液)、(4)H1组(缺氧4h/复氧48h前加急性低氧对照小鼠脑匀浆提取液)、(5)H4组(缺氧4 h/复氧48 h前加低氧预适应小鼠脑匀浆提取液),分别用酶标仪和流式细胞仪测定神经细胞活性和凋亡情况.结果 正常对照组细胞活性明显高于H<,4>R<,48>组,H0、H1和H4组分别与H<,4>R<,48>组相比,细胞活性明显增加,且H4组细胞活性又明显高于H0、H1组;正常对照组仅有极少量的凋亡细胞,而H<,4>R<,48>组凋亡细胞显著增多,H0、H1和H4组分别与H<,4>R<,48>组相比凋亡细胞明显减少,且H4组又分别明显少于H0、H1组.结论低氧预适应小鼠脑匀浆液提取液可能通过增加大鼠鼠胚海马神经元缺氧复氧后神经细胞活性和减少神经细胞凋亡起到抗缺氧性损伤作用.     

Fasudil,a Rho kinase inhibitor,drives mobilization of adult neural stem cells after hypoxia/reoxygenation injury in mice

Rho kinase (ROCK) is important in fundamental processes of cell proliferation and survival. Blockade of ROCK promotes stem cell survival in vitro and axonal regeneration in vivo, exhibiting therapeutic potential such as spinal cord injuries and stroke. Here, we used the model of hypoxia/reoxygenation (H/R) injury to explore the possibility whether Fasudil, a ROCK inhibitor in clinical application for subarachnoid hemorrhage and stroke, mobilizes adult neural stem cells in vivo. Most interestingly, Fasudil triggers neurogenesis especially in the subventricular zone after H/R. The increase of Brdu+ cholinergic neurons was observed in striatum and forebrain cortex of Fasudil-treated mice after 30 days. Further observation demonstrates that both levels of granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) and astrocytes expressing G-CSF were elevated in mice treated with Fasudil, as compared to mice injected with saline. In vitro H/R model of cultured astrocytes, Fasudil promoted astrocytes to produce G-CSF in a dose-dependent manner. In addition, antibody neutralization and receptor blocking of the G-CSF pathway clearly demonstrate that Fasudil-induced neurogenesis was mediated partially through astrocyte-derived G-CSF. Our results indicate that Fasudil might represent a promising therapeutic perspective by mobilizating endogenous adult neural stem cells in the CNS.     

cAMP和NO在后适应保护缺氧/复氧损伤心肌细胞中的作用

目的：cAMP和NO在后适应保护缺氧/复氧心肌细胞机制中的作用还不清楚。 方法：①实验材料及分组： 1~3 日龄SD乳鼠,原代培养心肌细胞,建立心肌细胞缺氧/复氧 (Hypoxia/Reoxygenation, H/R) 损伤模型。随机分为11组：正常组,H/R组,后适应组,咯利普兰、SQ22536或左旋精氨酸 后适应组,咯利普兰、SQ22536或各浓度N-硝基精氨酸 H/R组。采用四唑盐比色法测心肌细胞活力,相应试剂盒检测培养液乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)活性和一氧化氮(NO)含量,Realtime-PCR检测TNF-α和IL-1βmRNA表达。 结果：①心肌细胞活力和LDH、CK：后适应和20μM的N-硝基精氨酸能显著改善心肌细胞活力,并减少H/R导致的两酶释放,1000μM N-硝基精氨酸则能显著减弱心肌细胞活力。咯利普兰能显著增强后适应的作用,而SQ22536则显著减弱（P < 0.05）。②NO释放：后适应和N-硝基精氨酸均能显著减少NO释放。咯利普兰能显著增强后适应的该作用,而SQ22536则能显著减弱之（P < 0.05）。L-arginine能增加培养液中NO含量（P < 0.05）。③TNF-α和IL-1βmRNA的表达： 后适应和20μM N-硝基精氨酸能显著降低TNF-α和IL-1β的mRNA表达,咯利普兰能显著增强后适应作用,SQ22536则能减弱后适应的该作用（P < 0.05）。 结论：后适应对H/R损伤心肌细胞的保护机制,可能是通过增强cAMP信号而抑制炎症过程,NO信号在其中也发挥一定的作用。     

一种大鼠激光脑损伤模型的建立

目的建立一种稳定、可靠的大鼠激光脑损伤动物模型。方法成年SD大鼠100只,体质量（220±30）g,随机分为假手术对照组（n=25）和激光脑损伤组（n=75）;激光脑损伤组分别用14J、28J和56J能量激光照射致伤动物,根据伤后处理时间点每组再分为5个亚组,即伤后6h、24h、48h、72h和7d组,每亚组5只;假手术组不予激光照射。检测照射后不同时间点脑水肿指数、神经功能评分、血压和光、电镜病理形态变化。结果不同能量组伤后脑水肿指数、神经功能评分、血压和光、电镜病理形态变化不同;假手术对照组无明显改变。结论工作距离0．5cm,工作电流0．2mA,波长10．64μm,28J能量激光可以造成稳定的激光脑损伤动物模型。     

The roles of aquaporin-4 in brain edema following neonatal hypoxia ischemia and reoxygenation in a cultured rat astrocyte model

Aquaporin-4 (AQP4), a water channel protein, is abundantly expressed in astrocytes and plays a key role in the development of brain edema. However, it is not clear whether AQP4 contributes to astrocytic swelling in hypoxia-ischemia (HI). To investigate the roles of AQP4 in astrocytic swelling during HI and reoxygenation, we measured AQP4 expression and astrocytic cellular volume in cultured rat astrocytes following HI and reoxygenation. RNA interference was used to knockdown AQP4 expression (AQP4(-/-)). Real-time polymerase chain reaction and Western blot analysis were used to detect the inhibitory efficiency of AQP4. We found that the maximal inhibition of AQP4 mRNA and protein in astrocytes after AQP4 siRNA transfection (AQP4(-/-)) was approximately 77 and 85%, respectively, compared to wild-type AQP4 (AQP4(+/+)) expression. Cellular volume in both AQP4(-/-) and AQP4(+/+) astrocytes was significantly increased during HI compared to cells cultured in normoxia (P<0.05). However, cellular volume during HI in AQP4(-/-) astrocytes was significantly less than that in AQP4(+/+) astrocytes (P<0.05). After reoxygenation, the cellular volume gradually decreased to control levels at 7 days in AQP4(-/-) but at 5 days in AQP4(+/+) astrocytes. The different roles of AQP4 during HI and reoxygenation suggest that AQP4 knockdown may protect against water influx in the formation of astrocyte swelling during HI, and may also delay water clearance in the resolution of astrocyte swelling during reoxygenation. In conclusion, AQP4 mediates bidirectional transport of water across astrocytes during HI and reoxygenation. AQP4 manipulation may serve as a novel therapeutic strategy during different periods of hypoxic-ischemic brain edema in neonates.     

Melatonin protects primary cultures of rat cortical neurones from NMDA excitotoxicity and hypoxia/reoxygenation

Studies on rat cortical cultures show that glutamate (10 μM) or hypoxia followed by reoxygenation causes damage to the cells as indexed by a release of lactate dehydrogenase (LDH). These effects could be counteracted by the N-methyl-

Full-size image

-aspartate (NMDA) antagonist MK-801 (2 μM) but not by the kainate/AMPA antagonist CNQX (100 μM). These data favour the view that the damage caused to the cells by glutamate and hypoxia/reperfusion is mediated via NMDA receptors. The damage to the cells could also be prevented by melatonin (100 μM). The melatonin effect is not mediated by specific receptors because it was not blunted by the melatonin antagonist, luzindole. Moreover, NMDA stimulated an accumulation of

Full-size image

by cortical neurones, but although this effect was counteracted by MK-801, melatonin was ineffective, which showed that the neuroprotective effect of melatonin is not elicited by direct action with NMDA receptors. Ascorbate and iron stimulated the production of free radicals in a retinal cell preparation. Chelation of the iron with deferoxamine prevented this process as did melatonin while MK-801 had no effect. The combined findings suggest that melatonin counteracts the in vitro destructive effects of NMDA or hypoxia/reperfusion by preventing accumulation of excessive free radicals.     

抗坏血酸诱导新生鼠神经干细胞向多巴胺能神经元的分化

背景：针对帕金森病进行细胞移植治疗的研究进程中,除寻求合适的细胞系外,如何将各种有分化潜能的细胞诱导为含量丰富、有功能的多巴胺能神经元尤为关键。 目的：观察不同浓度抗坏血酸对神经干细胞向多巴胺能神经元分化的影响。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2007-01/12在广西医科大学科学实验中心完成。 材料：清洁级新生24 h内SD大鼠30只,由广西医科大学实验动物中心提供。抗坏血酸为Sigma产品。 方法：取新生鼠脑组织,组织块胰蛋白酶消化法体外分离培养神经干细胞,传至第2代以5×108 L-1密度接种。设立4组：空白对照组不给予抗坏血酸,仅加入含体积分数为10%的胎牛血清、2% B27的DMEM/F12培养基;剩余3组在此基础上分别加入50,100,200 μmol/L抗坏血酸进行诱导,10 d后终止诱导。 主要观察指标：RT-PCR检测诱导后细胞酪氨酸羟化酶基因mRNA的表达,免疫细胞化学染色鉴定神经干细胞,检测神经干细胞向多巴胺能神经元分化率。 结果：各浓度抗坏血酸诱导组均得到795 bp的扩增片断,即均表达酪氨酸羟化酶 mRNA。神经球具有自我更新和表达巢蛋白的能力,诱导分化后的细胞能表达神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞特异性抗原。与空白对照组比较,50,100,200μmol/L抗坏血酸诱导组酪氨酸羟化酶阳性细胞率均明显升高(P < 0.05);且100,200 μmol/L抗坏血酸诱导组升高幅度明显高于50 μmol/L (P < 0.05),100,200 μmol/L抗坏血酸诱导组间比较无明显差异(P > 0.05)。 结论：从新生鼠脑组织分离出的神经干细胞在体外具有自我更新、多向分化潜能及表达巢蛋白的能力。50~200 μmol/L抗坏血酸均能促进神经干细胞向多巴胺能神经元分化,抗坏血酸浓度从100 μmol/L增加至200 μmol/L时酪氨酸羟化酶阳性细胞率无明显变化。