稀土离子诱导钙调蛋白构象变化的单克隆抗体制备（摘要）

钙调蛋白是广泛存在于生物体内的一种多功能的调节蛋白,它通过结合钙离子后自身的构象变化参与许多细胞代谢调控过程.已有文献报道,三价的稀土离子可以拮抗钙调蛋白的调节作用,原因可能是稀土离子和钙调蛋白结合后改变了它的构象变化. 为了研究金属离子对钙调蛋白三级结构变化的影响,我们采用免疫化学的方法,制备稀土离子诱导钙调蛋白构象变化后的单克隆抗体,来研究金属离子诱导钙调蛋白构象变化后与抗体的分子识别能力差异.牛脑钙调蛋白经超滤脱钙后,用2,4-二硝基氟苯修饰,以增强其免疫原性,再与三价的铕离子饱和,以此作为抗原免疫Balb/c小鼠.免疫后的小鼠脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,筛选克隆制备单克隆抗体.结果表明,修饰后的蛋白免疫原性得到改善,小鼠免疫一周后即在尾血中检测到了抗体的产生,血清效价为1:12000;细胞融合后经筛选得到一株细胞株2C3;ELISA结果表明该抗体与铕离子饱和后的钙调蛋白的识别能力要高于脱去金属离子后的钙调蛋白与抗体的识别能力,说明钙调蛋白分子结合稀土离子后发生了较大的构象变化.该抗体可以用于进一步研究不同金属离子对钙调蛋白构象变化的影响,以及钙调蛋白抗原决定簇的定位.     

小鼠抗天花粉蛋白单克隆抗体的制备和鉴定

<正> 天花粉蛋白Tian Hua Fen,THF或Trichosanthin Protein是从葫芦科植物栝楼根Trichosanthes Kirilowii Maxim中提取的有效引产成份,对所有滋养叶细胞来源的疾病也有治疗作用。近年来还发现该蛋白     

抗人F蛋白单克隆抗体的制备和鉴定

Ｆ蛋白是存在于哺乳动物肝细胞质中的一种水溶性不稳定的单链蛋白质,相对分子质量（Ｍｒ）为４４０００。正常人肝组织中大约含Ｆ蛋白２７４ｍｇ／ｇ〔１，２〕,而血清中仅含０．２ｍｇ／Ｌ,提示血清Ｆ蛋白作为判断肝损伤程度的可能性。为对Ｆ蛋白进行深入研究,并提高对其检测的灵敏度,１９９５年以来,我们先后制备了３株抗人Ｆ蛋白的单克隆抗体（ｍＡｂ）,并进行了初步鉴定。１材料和方法１．１材料人Ｆ蛋白抗原的制备〔３〕：取肝外伤手术切除的新鲜肝组织５０ｇ,剪成约５ｍｍ３的组织碎块后,置于含有１ｇ／ＬＩＶ型胶原酶（Ｓｉｇｍａ）…     

抗凋亡抑制蛋白——survivin单克隆抗体的制备

目的制备抗 survivin蛋白单克隆抗体。方法以大肠杆菌表达的 survivin融合蛋白为抗原 ,免疫 Balb/c小鼠 ,通过细胞融合 ,建立分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系。结果获得了 6株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系。 6株单克隆抗体均能特异识别和结合大肠杆菌表达的 survivin融合蛋白 ,但其中仅有 3株能够结合肿瘤细胞系表达的天然 survivin蛋白 ,并与某些肿瘤细胞系中 5 0 0 0 0 u±分子量的未知蛋白存在交叉反应 ,与正常人外周血淋巴细胞样本未见任何反应。结论通过单克隆抗体的免疫印迹反应 ,可以观察 survivin特定分子量蛋白的表达 ,为深入研究该蛋白的细胞凋亡调控功能提供了工具。此外 ,这些单克隆抗体对于肿瘤诊断也具有一定应用价值。     

红细胞分化相关蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

应用杂交瘤技术和电泳迁移超滞留技术筛选和制备红细胞分化相关蛋白单克隆抗体，以阐明此类蛋白的生物学功能。用杂交瘤技术制备了５８０株针对终末分化期红细胞，包括人胚肝中，晚幼红细胞和氯高铁血红素诱导分化的人红白血病细胞核蛋白的单克隆抗体。     

抗人C4结合蛋白单克隆抗体的制备及某些方法的改进

用易于获得的C4BP/C4混合抗原免疫小鼠,EAC1q4C4BP血球间接血凝法作为筛选手段,获得了分泌抗C4BP抗体的杂交瘤细胞株。用单克隆抗体制成的亲和柱分离的C4BP,有C4BP的电泳特性和抑制EAC14与C2形成C3转化酶的活性。本文同时报告单克隆抗体制备方案的某些改进:1.小鼠免疫过程中用尾尖近似定量微量采血法对血中抗体水平定期监测,选择合适的小鼠供脾;2.用戊二醛固定的检测血球筛选杂交瘤,方法简便迅速,改变了杂交瘤筛选工作繁重的局面;3.用单细胞分离法达到单克隆化,缩短工作周期。     

糖尿病大鼠心肌肌浆网钙调蛋白基因表达的改变

目的:探讨糖尿病大鼠心肌细胞肌浆网钙调蛋白基因表达的改变。方法: 雄性SD大鼠经尾静脉注射四氧嘧啶(40 mg/kg)复制糖尿病大鼠模型,对照组注射生理盐水,分别于4,6周处死,取心室肌组织,应用逆转录-聚合酶反应技术以肌动蛋白为内参照,测定肌浆网钙调蛋白钙泵(SERCA )、磷酸受纳蛋白(phospholamban)、ryanodine受体2型(RyR₂)、1,4,5三磷酸肌醇受体2型(IP₃R₂)mRNA的变化。结果: 4,6周后糖尿病组大鼠的体重和心脏重量均低于正常对照组,但心脏/体重比显著大于正常对照组。4周糖尿病组大鼠心肌肌浆网SERCA 、磷酸受纳蛋白、RyR₂、IP₃R₂ mRNA的表达与对照组相比无显著差异;6周的糖尿病组大鼠心肌肌浆网Ca²⁺-ATP酶 的 mRNA表达无明显变化,但磷酸受纳蛋白的mRNA表达显著高于而RyR₂、IP₃R₂的mRNA表达显著低于对照组。结论: 糖尿病大鼠心肌细胞的肌浆网磷酸受纳蛋白的mRNA表达增加,RyR₂、IP₃R₂的mRNA表达下降。     

血清钙调蛋白水平与急性缺血性脑卒中神经功能缺损程度的关系

目的:观察急性缺血性脑卒中(IS)后48h血清钙调蛋白(CAM)水平变化及与美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分的关系。方法:急性IS患者(IS组,n=120),入院时采用NIHSS进行评分,并按NIHSS评分5分(A组,n=51)和NIHSS评分≤5分(B组,n=69)分为两个亚组,于IS后48h测定血清CAM值;另取体检健康人群(对照组,n=100)平行测定血清CAM值。比较IS组与对照组以及不同NIHSS评分IS患者血清CAM水平差异,分析IS组CAM水平与NIHSS评分的相关性。结果:IS组血清CAM值较对照组显著增高(t=15.34,P0.01);A组患者CAM水平明显高于B组(t=10.51,P0.01);急性IS患者血清CAM水平与NIHSS评分呈显著正相关(r=0.308,P0.01)。结论:血清CAM水平可反映IS患者急性期病情程度。     

钙调蛋白与肥厚心肌的心律失常

钙调蛋白(calmodulin,CaM)是广泛存在于真核生物体内的一种多功能蛋白质,是Ca2+在体内的一个重要受体。CaM通过Ca2+/CaM依赖的钙调神经磷酸酶及CaMKⅡ,调节心肌细胞肥大相关基因的表达;通过心肌细胞膜上钙通道的磷酸化,造成钙超载,进而诱导心肌肥厚及肥厚心肌心律失常的发生。钙调蛋白在肥厚心肌心律失常机制的阐述,对指导临床治疗和开发新的、更有效的药物具有重要的意义。     

抗重组GST单克隆抗体的制备及其在融合蛋白纯化中的应用

目的 制备抗重组GST的单克隆抗体（mAb),并用来纯化重组GST融合蛋白,方法 用含重组GST融合蛋白基因的pGEX4T-1质粒转化E.coliBL21,IPTG诱导GST融合蛋白表达,亲和层析和凝胶过滤法分离表达的重组GST融合蛋白,以此蛋白作为抗原,免疫Balb/c小鼠,按传统的杂交瘤技术制备mAb。将抗GSTmAb经ProteinA纯化后,与Sepharose4B偶联。结果 经3次亚克隆后,获得两株分泌抗GST载体特异性mAb的杂交瘤,采用该mAb对两种不同的GST融合蛋白进行亲和层析纯化后,经SDS-PAGE鉴定达到了商品化Glutathione-Resin的亲和层析纯化效果。结论 用抗GST蛋白特异性mAb亲和层析纯化融合蛋白是一种经济、实用的方法,且可用于Glutathione-Resin亲和层析纯化后的二次纯化。     

钙调蛋白激酶Ⅱ的结构及其在神经系统中的作用

钙离子（Ca²⁺ ）是通过局部信号获得特异性刺激的关键细胞内信使分子。Ca²⁺ 结合蛋白,如钙调蛋白（CaM）及其靶蛋白是Ca²⁺ 依赖性反应信号传导的关键靶点。钙/钙调蛋白依赖性蛋白酶Ⅱ（CaMKⅡ）是一种多聚体酶,它是哺乳动物前脑总蛋白的重要组成部分,并且是形成突触后致密部的主要成分。近年来国内外研究显示,CaMKⅡ包含α、β、γ 和 δ 4种亚型,其中α 和 β 主要在神经组织中表达,而 γ 和 δ 则在全身多种组织均有表达,它们参与特定的突触可塑性和记忆巩固过程,对神经系统的兴奋性及一些神经系统疾病的发生起重要作用。前期也有研究表明CaMKⅡδ在促进神经元存活中起重要作用。本文就CaMKⅡ的结构及其在神经系统中的作用和与相关神经系统疾病的关系作一综述。     

抗人脑髓鞘碱性蛋白单克隆抗体的制备及初步鉴定

人脑髓鞘碱性蛋白 (ｈｕｍａｎｂｒａｉｎｍｙｅｌｉｎｂａｓｉｃｐｒｏｔｅｎ ,ＭＢＰ)是组成中枢神经系统 (ＣＮＳ)神经纤维的重要蛋白质 ,由ＣＮＳ少突细胞合成 ,占髓鞘蛋白质总量的 30 % ,在神经纤维的绝缘和快速传递过程中起重要作用[1] 。ＭＢＰ能诱发实验性变应性脑脊髓炎 (ＥＡＥ) ,并作为人脱髓鞘疾病多发性硬化(ＭＳ)的动物模型 ,其在ＭＳ发病机制中的作用也倍受关注[2 ] 。我室曾报道抗人脑ＭＢＰ多克隆抗体的制备[3 ] ,为研究人ＭＢＰ分子各特异性表位的结构和功能 ,本室研制了抗ＭＢＰ单克隆抗体 (ｍＡｂ)。1　材料和方法1.1　…     

抗转化生长因子β诱导蛋白单克隆抗体的制备

转化生长因子β诱导蛋白(transforming growthfactor-β-induced protein,TGFBIp)是一个多功能细胞外基质分子,在细胞黏附、迁移、增殖、分化中起十分重要作用[1,2]。近期Kim HJ等[3]及Rowley JW等[4]研究     

巨噬细胞中钙调蛋白2的缺失可缓解小鼠炎症性关节炎

目的研究探讨抑制巨噬细胞中钙调蛋白2的表达治疗炎症性关节炎的作用和相关机制。方法取野生型小鼠(wild type,WT)和钙调蛋白2敲除(knock out, KO)小鼠构建胶原诱导炎症性关节炎模型(collagen induced arthritis,CIA),检测炎症相关因子TNF-α、IL-1β、IL-6和TGF-β的mRNA及蛋白表达变化、小鼠足趾肿胀容积变化以及炎症组织细胞大小和增殖变化。进一步在293T细胞中检测钙调蛋白2和CCL3(macrophage inflammatory protein 1-α, MIP-1α)的结合情况。在骨髓单核巨噬细胞(bone marrow macrophages,BMMs)细胞中转染钙调蛋白2过表达和抑制慢病毒,检测钙调蛋白2潜在下游CCL3的表达。最后,使用抑制钙调蛋白2的慢病毒进行炎症性关节炎小鼠的治疗作用探索,进行上述病理性检测。结果荧光定量PCR和免疫印迹实验显示,钙调蛋白2 KO小鼠关节炎组织炎症因子分泌明显降低;足趾肿胀容积明显减小;炎症组织细胞明显变大,细胞增殖明显增多。荧光素酶实验和染色质免疫共沉淀实验结果显示,钙调蛋白2...     

人胎盘层粘连蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

目的获得能特异性识别人层粘连蛋白（hLN）的单克隆抗体（McAb）。方法用纯化的人层粘连蛋白（hLN）作抗原免疫Balb/C小鼠,以细胞融合、酶联免疫吸附实验（ELISA）筛选和克隆化技术获得抗hLN的杂交瘤细胞株;用生物学方法鉴定杂交瘤细胞,用免疫学方法鉴定McAb的特异性。结果获得4株稳定分泌抗人LN的杂交瘤细胞株（2A1、3B5、2C4、4D1）,培养上清的ELISA效价分别为：1∶512、1∶1024、1∶512、1∶256;腹水效价分别为：1×10^6、1×10^7、1×10^6、1×10^5;采用ELISA相加法表明2A1、4D1与3B5、2C4识别的hLN上的抗原决定簇和识别的不同,4株单抗均属实IgG。结论成功建立了4株稳定分泌抗人LNMcAb的杂交瘤细胞株,它们分别识别hLN上2个不同的抗原位点,有望作为hLN定量检测的特异性抗体。     

抗人跨膜激活剂及钙调亲环素配体相互作用分子单克隆抗体的制备

目的：制备抗人跨膜激活剂及钙调亲环素配体相互作用分子(TACI)单克隆抗体(mAb)，研究TACI分子的细胞分布。方法：应用淋巴细胞杂交技术制备鼠源性抗TACI mAb。用免疫荧光染色、流式细胞术及免疫组织化学染色法，对TACI在外周血单个核细胞(PBMC)上的分布进行鉴定。结果：获得两株分泌抗TACI mAb的杂交瘤细胞株。mAb的腹水效价达10^-7，均为IgGl亚类，可识别T细胞表面天然的TACI分子，在PHA活化的模型中，TACI主要表达于活化的CD4^ T细胞上。结论：获得两株能特异性识别天然TACl分子的mAb，为进一步研究TACl分子的结构和功能奠定了基础。