维生素C在晶体蛋白光氧化中的作用及其机制

目的：观察维生素Ｃ（ＡＳＡ）在晶体蛋白发生光氧化时的作用及其机制。方法：牛日体蛋白溶液在加入或不加入ＡＳＡ时,于５天内共接受２００ｍＪ／ｃｍ＾２紫外线Ｂ（ＵＶＢ）照射,接着在３７℃继续孵育至第３周,然后测定晶体蛋白的非色氨酸我、游离巯基和进行蛋白电泳分析。结果：ＡＳＡ在溶液中易被氧化,蛋白溶液中加入ＡＳＡ促使晶体蛋白 非色氨酸荧光产生明显增强,导致非二硫键聚合形成,对晶体蛋白的游离巯基减少有保护作     

人γ-晶体蛋白的研究:Ⅴ.胚胎晶体γ_1-、γ_3-晶体蛋白在体外的非酶糖化作用

目的:比较由葡萄糖和果糖诱发不同的人胚胎γ-晶体蛋白的非酶糖化作用。方法:用Sephadex凝胶层析方法从人类胚胎晶体中分离出γ_1和γ_3-晶体蛋白,将这些γ-晶体蛋白与葡萄糖或果糖37℃下培养20天,γ-晶体蛋白产生非酶糖化作用,混浊和块状沉淀出现,还观察到SDS—PAGE图谱的变化和蓝色荧光产物。结果:虽然两种γ-晶体蛋白出现相类似的变化。但在早期阶段(3天)γ_1-晶体蛋白更容易产生聚合和不溶解。SDS—PAGE显示有聚合物产生,这些都是通过二硫键和非二硫键交联以及肽键的降解而形成。γ_3-晶体蛋白溶液糖化作用后,蓝色荧光增加。果糖与γ-晶体蛋白的糖化作用比葡萄糖更明显(如:聚合、降解、产生蓝色荧光)。结论:人类胚胎γ_1和γ_3-晶体蛋白对非酶糖化作用是敏感的,程度亦有不同(γ_1>γ_3),果糖的作用比葡萄糖强。眼科学报 1995;11:197—201     

人晶体γ-晶体蛋白的研究:I.含量的变化

本文应用凝胶层析分离获得不同年龄人晶体的低分子量晶体蛋白.结果可见:人晶体低分子量晶体蛋白主要有γ_1~-、γ_2~-和γ_3~-晶体蛋白三种.它们为单体蛋白.对于透明晶体,随着年龄的增加,γ_1~-逐渐增多,γ_2~-渐减少,而γ_3~-相对较稳定,同时三者的总量在晶体水溶性蛋白中的比例基本恒定,但在白内障晶体则都减少.合成量不同是各γ~-晶体蛋白含量变化的主要原因.γ_2~-和γ_3~-晶体蛋白在早期合成,而γ_1~-晶体蛋白则以后期合成为主。推测晶体中低分子单体蛋白在其水溶性蛋白中的比例与晶体的透明性可能有关,γ_2~-晶体蛋白的含量变化不大与其结构特性有关.     

晶状体蛋白的外消旋化及其在白内障发病机制中的研究进展

外消旋化是老年人晶状体蛋白中重要的翻译后修饰类型.多项研究发现,随着年龄的增长,α-、β-及γ-晶状体蛋白中的部分L型氨基酸残基倾向于通过外消旋化反应转化为D型氨基酸残基,导致晶状体蛋白的构象改变,聚合形成的大分子蛋白质在晶状体核区和皮质中逐渐积累,晶状体蛋白失去了原有功能而不能维持晶状体的透明度.外消旋化在晶状体蛋白年龄相关性改变中的效应和参与程度,及其对白内障发生与进展的具体机制都值得进一步研究.     

糖皮质激素对α-晶状体蛋白分子伴侣功能的影响

目的　研究糖皮质激素对α 晶状体蛋白分子伴侣功能的影响。 方法　凝胶过滤层析分离αL和βL 晶状体蛋白,αL 晶状体蛋白与 25mmol/L泼尼松龙 21 半琥珀酸(P 21 H)孵育 20d(37℃),分别于 0、2、4、10和 20d应用βL 晶状体蛋白热聚集法测定分子伴侣活性,采用PerkinElmerLB50B荧光光度仪观察色氨酸和非色氨酸荧光值,SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳监测蛋白质交联程度。 结果　被P 21 H修饰后的αL 晶状体蛋白分子伴侣功能显著降低。P 21 H可导致αL 晶状体蛋白色氨酸荧光强度明显降低,非色氨酸荧光强度向较长波长移位和增强,提示形成新的荧光色素物。孵育第 10d,伴侣活性已降低至约 3 3%,色氨酸荧光强度殆尽,约在激发波长 412nm出现新的非色氨酸荧光强度。SDS PAGE显示糖皮质激素导致αL 晶状体蛋白明显凝聚。 结论　糖皮质激素对α 晶状体蛋白的修饰和伴侣活性的降低可能参与糖皮质激素诱导白内障的形成。     

糖基化对α-晶状体蛋白的修饰和分子伴侣活性的降低

目的　研究糖基化对 α-晶状体蛋白分子伴侣活性的作用。方法　分离牛晶状体α-晶状体蛋白 ,分别与 0 .5 mol· L- 1 果糖和 0 .5 m ol· L- 1 葡萄糖在 37℃温育 ,在第 0、2 4、32天测定 380 nm的光吸收值和 40 0 nm非色氨酸荧光值 ,高压液相色谱 ( high performanceliquid chrom atography,HPL C)和 SDS- PAGE评价蛋白质交联程度 ,采用过氧化氢酶( catalase,CAT)和βL-晶状体蛋白的热凝聚光散射值 ,作为α-晶状体蛋白的分子伴侣活性指标。结果　果糖和葡萄糖可导致时间依赖性 α-晶状体蛋白在 380 nm吸收值的增加 ,非色氨酸荧光值升高 ;HPL C和 SDS- PAGE提示糖与α-晶状体蛋白形成交联复合物。果糖较葡萄糖作用明显。糖基化导致 α-晶状体蛋白抑制 CAT和 βL-晶状体蛋白热凝聚作用降低 ,孵育第 2 4天 ,葡萄糖组α-晶状体蛋白分子伴侣活性分别降低约 12 %和 19% ,果糖组约7%和 9% .结论　糖基化导致 α-晶状体蛋白形成高分子聚合物、凝聚、交联 ,分子伴侣活性丧失 ,这在老化和糖尿病性白内障形成过程中起重要作用。     

紫外线-B激光照射对α晶状体蛋白的影响及3-吲哚甲醇对其分子伴侣活性的保护作用

背景 紫外线照射是年龄相关性白内障形成的诱因之一.研究表明,3-吲哚甲醇(I3C)可抑制氧化作用导致的细胞损害及淀粉样纤维变性的形成,氧化损伤及淀粉样纤维变性的形成均与白内障有关,而I3C与α晶状体蛋白活性的关系尚有待证实. 目的 评估紫外线-B激光照射对α晶状体蛋白结构和分子伴侣功能的影响,探讨I3C对α晶状体蛋白分子伴侣功能的保护作用.方法 取新鲜1岁龄牛眼球的晶状体,采用凝胶层析法提纯牛的α晶状体蛋白,并按照快速蛋白液相色谱( FPLC)吸收谱线收集α晶状体蛋白.然后分别以23.75、118.75、475.00、1187.50、2375.00、4750.00、11 875.00和23 750.00mJ/cm2的紫外线-B激光照射在凸透镜后一固定位置的α晶状体蛋白,然后通过改变α晶状体蛋白在凸透镜后的位置达到改变照射能量的目的,使各组照射能量分别为28 535.00、6730.00、3435.00、1910.00、1040.00 mJ/cm2.使用紫外分光光度仪测量紫外线-B激光照射前后α晶状体蛋白的紫外吸收谱线(色氨酸荧光谱).在照射能量为475.00、1187.50、2375.00、4750.00、11 875.00mJ/cm2照射后的α晶状体蛋白溶液中分别加入50μmol/L和100 μmol/L的I3C,并进行过氧化氢酶(CAT)热凝聚实验,判断α晶状体蛋白分子伴侣活性,未加入50 μmol/L和100 μmol/L I3C的α晶状体蛋白溶液进行相同的实验作为对照,采用分光光度仪测量360 nm波长处各组α晶状体蛋白抑制CAT热凝聚的吸光度(A360)值,计算各干预组与对照组A值的百分数作为评价分子伴侣活性的指标. 结果 α晶状体蛋白紫外吸收谱测定发现,紫外线-B激光照射能量为1187.50 mJ/cm2时,α晶状体蛋白A280值降到10％左右,当照射能量达到23.75 J/cm2时,α晶状体蛋白A280值降到2％以下,二者呈负相关(R2=0.925).色氨酸荧光光谱测定表明,紫外线-B激光照射强度与色氨酸荧光强度呈负相关(R2=0.996),而与色氨酸代谢产物N-甲酰犬尿氨酸(N-FK)的荧光强度呈正相关(R2=0.949).CAT热凝聚实验表明,加入50 μmol/L和100μmol/L的I3C后,各强度的激光照射组α晶状体蛋白的相对A360值均明显高于对照组,差异有统计学意义(P=0.000)；α晶状体蛋白分子伴侣功能下降幅度低于对照组,差异有统计学意义(P=0.000).分子伴侣活性随着激光照射能量的增加与不加入I3C的α晶状体蛋白相比降低变慢.结论 紫外线-B激光照射可以造成α晶状体蛋白分子结构的变化及分子伴侣活性的降低,I3C对于α晶状体蛋白分子伴侣活性具有保护作用.     

静脉注射α-晶体蛋白对视网膜神经节细胞的保护作用及对重要脏器的影响

目的 观察静脉注射α-晶体蛋白对Long Evans大鼠视神经损伤后视网膜神经节细胞(RGC)存活的保护作用及对重要脏器的影响.方法 23只Long Evans大鼠用于本实验.荧光金经双侧上丘及外侧膝状体逆行标记RGC,7 d后制作视神经钳夹伤模型.3只作为正常对照组,其余20只随机分为生理盐水对照组以及1×10-2g/L、1×10-1 g/L、1 g/Lα-晶体蛋白组,每组5只大鼠.视神经钳夹伤后经尾静脉分别注射1.25 ml的等渗生理盐水及3个浓度的α-晶体蛋白,每2天重复注射1次,共7次.2周后对实验大鼠行RGC计数,并对肝、肾、脑、脾、肺等脏器进行病理观察.结果 正常对照组RGC计数(2074±150)个/mm2,视神经钳夹伤后2周时RGC计数,生理盐水对照组(85±15)个/mm2,1×10-2g/L α-晶体蛋白组(124±26)个/mm2,1×10-1g/L α-晶体蛋白组(128±31)个/mm2,1 g/Lα-晶体蛋白组(164±20)个/mm2.正常对照组RGC计数显著高于其他组,3个浓度α-晶体蛋白组存活的RGC数均显著高于生理盐水对照组(F=18.660,P＜0.01).各组肝、肾、脑、脾、肺病理观察未见充血、肿大、炎症等病理改变.结论 静脉注射α-晶体蛋白对视神经损伤后RGC存活具有一定保护作用,所用α-晶体蛋白浓度对重要脏器无病理性影响.

Abstract：

Objective To investigate the effects of intravenous injection of α-crystallin on retinal ganglion cells (RGC) and some important organs of the Long Evans rats. Methods RGC were retrogradelabeled by fluorogold through bilateral superior colliculus and lateral geniculate body for seven days before optic nerve crush injury. Twenty-three Long Evans rats were used for this study, including three rats of normal control group and 20 rats of experimental group. Twenty rats were randomly divided into saline control group and three α-crystallin injection groups, which received tail vein injection of 1.25 ml isotonic saline and three different concentrations (1 × 10-2 , 1 × 10-1 and 1 g/L) of α-crystallin respectively, once every two days and totally seven times. After two weeks, the labeled RGC were counted, and the pathological changes on liver, kidney, brain, spleen and the lungs were investigated. Results Compared with the normal control group, although the number of RGC markedly decreased after two weeks of optic nerve crush injury in every group, the number of RGC in α-crystallin-treated groups was more than those in the saline control group. There were 2074± 150 RGC per mm2 in normal control group, 85 ± 15 RGC per mm2 in saline control group, 124±26 RGC per mm2 in 1 × 10-2 g/L α-crystallin group, 128± 31 RGC per mm2 in 1 × 10-1 g/L α-crystallin group, 164 ± 20 RGC per mm2 in 1 g/L α-crystallin group (F= 18. 660,P＜0. 01). No congestion, swelling, inflammation and other pathological changes were found in liver,kidney, brain, spleen and lung. Conclusions Intravenous injection of α-crystallin protein has protective effects on RGC after the optic nerve crush injury, and no significant effects on important organs.     

补骨脂素长波紫外线疗法的眼内并发症及其预防

目前已有足够的材料证实紫外线(300-400nm)照射是产生晶体内荧光化合物的重要因素。光化反应可诱发使晶体老化的色素数量及浓度的进行性增加;某些色素基(Chromophores)似乎可以并发晶体蛋白交键结合及随后发生不可溶性蛋白的增加。不可溶性晶体蛋白的增加与晶体内荧光化合物的数量及浓度是2个已经明确的晶体老化参数。业已证实,波长超过300 nm的紫外线,照射动物及人的晶体均可产生白内障。而正常角膜,尤其是年青人几乎可以全部透过超过300nm的紫外线。除紫外线对晶体的直接光化学效应之外,由于晶体某些药物的积蓄也能以光敏反应的方式增加光生物学效应的损伤。已有报告,用大剂量补骨脂素并暴露于长波紫外线中的动物,产生了实验性白内障。近十年内,补骨脂素及长波紫外线疗法已广泛用于治疗牛皮癣等皮肤病。在活体中该药的光敏作用与DNA分子中胸腺嘧啶形成环丁烷光加反应(Cyctobutane photoaddition reaction)有     

发光二极管照射对大鼠高糖视网膜血管内皮细胞的光生物调节作用及其机制

目的：观察发光二极管照射对大鼠高糖视网膜血管内皮细胞中的光生物调节作用及其机制。

方法：大鼠视网膜血管内皮细胞随机分为三组：正常对照组、高糖模型组、高糖模型发光二极管照射组,高糖模型发光二极管组的细胞在造模48h后开始采用发光二极管对培养箱中的细胞进行照射。MTT细胞凋亡实验检测各组细胞凋亡率; 激光共聚焦显微镜观察各组视网膜血管内皮细胞胞内钙离子变化; Western blot 法检测各组磷酸化丝氨酸-苏氨酸激酶(P-AKT)蛋白表达。

结果：正常对照组、高糖模型组、高糖模型发光二极管照射组凋亡率分别为7.54%±2.67%,31.69%±5.74%,21.65%±3.52%(P<0.05)。正常对照组细胞质微弱Ca²⁺荧光染色呈现出绿色的荧光,其荧光像素值为192.65±50.54; 高糖模型组中,细胞质呈现较强烈的绿色荧光,其荧光像素值为710.69±100.38; 发光二极管照射组中,绿色荧光像素值为430.47±80.67,明显高于正常对照组,但明显低于高糖模型组。三组间细胞中内Ca²⁺荧光像素值有差异(P<0.05)。这三组细胞P-AKT蛋白量分别为10.26±2.47、2.35±0.16、7.46±1.64(P<0.05)。

结论：高糖环境抑制苏氨酸激酶通路活性,对大鼠视网膜血管内皮细胞钙稳态产生影响,促使细胞凋亡,低强度的发光二极管照射可激活苏氨酸激酶通路,降低高糖引起的细胞凋亡率。     

发光二极管照射对高糖培养的视网膜神经元凋亡的光生物调节作用及其机制

背景 研究糖尿病视网膜病变(DR)的发病机制及防治具有重要的临床意义.近年来随着生物医学光子学研究的发展,国际上利用光生物调节进行疾病防治的研究越来越受到重视,但关于光生物调节对DR的防治作用研究鲜见报道. 目的 探讨光生物调节对高糖环境下视网膜神经元凋亡的抑制作用及其机制,为光生物调节在DR治疗方面的应用提供依据.方法 采用免疫磁珠分离法分离Wistar大鼠视网膜神经元并进行传代培养,采用Nissl染色法对培养的细胞进行鉴定.将培养的细胞分为正常对照组、高糖模型组和高糖+发光二极管(LED)组,正常对照组细胞采用Neurobasal培养基进行培养,高糖模型组细胞在Neurobasal培养基中添加25 mmol/L葡萄糖,高糖+LED组细胞造模后48 h在培养箱中用LED红光光源进行照射,光源波长为620 nm,最大功率为1W,中心光辐射照度为6.67 mW/cm2.光源置于细胞上方2 cm处,光斑直径为2.0cm,使光斑完全覆盖1个培养孔,每次连续照射300 s,12h后重复照射1次,共照射3次.培养后48 h采用流式细胞仪测定各组细胞凋亡情况;采用激光扫描共焦显微镜观察各组细胞内Ca2+浓度变化;Western blot法检测各组细胞中磷酸化丝氨酸-苏氨酸激酶(p-AKT)蛋白的相对表达量.结果 培养后2～3d,倒置显微镜下可见细胞呈多边形和椭圆形,可见细胞核及核仁.培养后5～7d神经元突起增多,经Nissl染色后细胞质呈蓝紫色,神经元与神经胶质细胞的比例达91％.正常对照组、高糖模型组和高糖+LED组细胞凋亡率分别为(7.634_±3.176)％、(33.642±9.315)％和(23.914±6.375)％,其中高糖模型组和高糖+LED组细胞凋亡率均明显高于正常对照组,高糖+ LED组细胞凋亡率明显低于高糖模型组,差异均有统计学意义(均P＜0.0l).激光扫描共焦显微镜下可见高糖模型组和高糖+LED组细胞中Ca2+荧光像素值均明显高于正常对照组,高糖+LED组细胞中Ca2+荧光像素值明显低于高糖模型组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).Westen blot法检测显示正常对照组、高糖模型组和高糖+LED组细胞中p-AKT蛋白相对表达量分别为10.34±3.18、2.16±0.46和7.15±1.72,高糖+LED组细胞中p-AKT蛋白相对表达量明显低于高糖模型组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 高糖环境抑制抗凋亡的PI3K/AKT通路活性并影响视网膜神经元钙稳态,导致细胞凋亡.低强度LED光照射可激活PI3K/AKT通路,减少高糖引起的细胞凋亡.     

胚胎千细胞诱导分化为视网膜祖细胞的体外研究

目的 探讨小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cell,mESC)诱导为视网膜祖细(retinal progenitor cells,RPC)的体外培养方法,为致盲性视网膜变性疾病的治疗提供种子细胞.方法 用细胞免疫荧光染色法和流式细胞术对mESC进行mESC标记物阶段特异性胚胎抗原1、细胞增殖核抗原Ki67、细胞周期和碱性磷酸酶进行鉴定后,在无血清条件下悬浮培养形成拟胚体(embryoid bodies,EB)并添加抑制因子1、左右决定因子A和γ-促分泌酶抑制剂等诱导分化为RPC,并对其分化的细胞进行标记物兔来源配对盒基因6(paired box6,Pax6)、兔来源性别决定区Y框蛋白(Sox2)和鼠来源转录因子同源异型框蛋白(orthodentical homeobox2,Otx2)的检测以及增殖能力和细胞周期的检测.结果 mESC标记物碱性磷酸酶阳性表达,特异性胚胎抗原1阳性率为(80.66±0.64)％,Ki67和细胞周期检测显示有较高增殖能力.定向诱导分化后,RPC标记物Pax6、Sox2和Otx2阳性率分别为(50.87±2.97)％、(49.10±2.60)％和(32.01±3.87)％,Ki67和细胞周期检测均显示诱导后的RPC具有一定的增殖能力.结论 在特定的细胞因子作用下,mESC可以诱导分化为RPC.     

miR-31-5p过表达对兔自身免疫性干眼外周血Th17细胞的免疫调控作用

目的探讨慢病毒介导微小RNA(miR)-31-5p过表达对兔自身免疫性干眼模型外周血辅助性T细胞17(Th17)的免疫调控作用。方法构建miR-31-5p重组慢病毒载体。包装miR-31-5p过表达及其对照慢病毒, 进行浓缩和滴度测定。建立兔自身免疫性干眼模型, 并分离模型兔外周血单个核细胞(PBMC), 分别感染miR-31-5p及阴性对照慢病毒颗粒作为miR-31-5p过表达组和对照组, 采用实时荧光定量PCR法检测miR-31-5p的表达水平。将2个组PBMC与经γ射线照射后的泪腺上皮细胞共培养, 采用实时荧光定量PCR法检测2个组PBMC中Th17细胞特异性转录因子维甲酸相关孤儿核受体C(RORC)、标志性细胞因子白细胞介素-17(IL-17)及Th17细胞极化相关细胞因子IL-1β、IL-6和IL-23的mRNA表达水平;采用Western blot法检测PBMC中IL-17的蛋白表达水平。结果通过测序验证, 成功构建miR-31-5p重组慢病毒载体。包装并浓缩miR-31-5p过表达和对照慢病毒颗粒, 滴度测定结果分别为3.82×107 TU/ml和3.50×107 TU/...     

蓝光照射对人视网膜色素上皮细胞钙离子蛋白激酶C信号通路的影响

 目的 观察蓝光照射对人视网膜色素上皮细胞钙离子（Ca2+）蛋白激酶C（PKC）信号通路的影响。方法 体外培养并鉴定人视网膜色素上皮（RPE）细胞,取第4代人RPE细胞随机分组进行实验。采用蛋白免疫印迹法测定培养细胞PKC蛋白表达,检测佛波酯（PMA）和钙磷酸结合蛋白（calphostin C）对PKC活性的影响,确定PMA与calphostin C影响PKC活性的最适宜浓度。采用非放射性核素法测定蓝光照射处理对培养细胞PKC活性的影响。采用20 W,波长450～500 nm医用蓝光灯作为光源,光照强度（2000±500） Lux,照射6 h,24 h后终止培养,以此制造体外培养人RPE细胞光损伤。将培养细胞随机分成5个组,即无光照、单纯光照、光照联合硝苯地平、光照联合calphostin C、光照联合PMA组。其中,无光照组不接受光照;单纯光照组仅接受光照;光照联合硝苯地平组接受光照和0.1 mmol/L的硝苯地平;光照联合calphostin C组接受光照和100.0 nmol/L的calphostin C;光照联合PMA组接受光照和100.0 nmol/L的PMA。用乙酰氧基甲基酯Ca²⁺荧光探针标记各组培养细胞,激光扫描共焦显微镜测定各组细胞内Ca2+浓度。比较各组细胞内Ca2+浓度差异。结果 经鉴定,体外培养人RPE细胞成功。100.0、200.0 nmol/L PMA处理的RPE细胞中PKC蛋白相对表达量高于0.1、1.0、10.0、50.0 nmol/L PMA处理的RPE细胞,差异有统计学意义（F=217.537,P＜0.05）,但100.0、200.0 nmol/L PMA处理组间PKC蛋白相对表达量比较,差异无统计学意义（P=0.072）。100.0、200.0 nmol/L calphostin C处理的RPE细胞中PKC蛋白相对表达量低于5.0、25.0、50.0、75.0 nmol/L calphostin C处理的RPE细胞,差异有统计学意义（F=164.543,P＜0.05）,但100.0、200.0 nmol/L calphostin C处理组间PKC蛋白相对表达量比较,差异无统计学意义（P=0.385）。蓝光照射处理后,RPE细胞的PKC活性显著升高,与未接受蓝光照射处理的RPE细胞的PKC活性比较,差异有统计学意义（t=-9.869,P＜0.05）。单纯光照、光照联合硝苯地平、光照联合Calphostin C、光照联合PMA组的RPE细胞内Ca²⁺浓度均高于无光照组,差异有统计学意义（F=26 764.92,P＜0.05）;光照联合PMA组RPE细胞内Ca²⁺浓度高于单纯光照、光照联合硝苯地平及光照联合calphostin C组（P＜0.05）,单纯光照组高于光照联合硝苯地平和光照联合calphostin C组（P＜0.05）。结论 蓝光照射后人RPE细胞内PKC活性增高,Ca²⁺浓度增高。硝苯地平和calphostin C均能降低蓝光照射后人RPE细胞内Ca²⁺浓度,PMA增加细胞内Ca²⁺浓度。     

聚乙烯亚胺修饰的荧光素钠纳米颗粒在荧光素眼底血管造影术的应用和安全性

目的　探讨聚乙烯亚胺修饰的荧光素钠（PEI-NHAc-FS）纳米颗粒（nanoparticles,NPs）在荧光素眼底血管造影术的应用和安全性。方法　选取90只健康棕色雄性挪威大鼠作为实验动物。将1 mL 荧光素钠（200 g·L^-1）加入10 mol的1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐（EDC）混合物中搅拌30 min,再加入10 mol的N-羟基琥珀酰亚胺搅拌3 h。然后将该溶液加入到5 mL聚乙烯亚胺（polyethyleneimine,PEI）（76 g·L^-1）中,剧烈搅拌3 d获得PEI-NH₂-FS。将2 mL三乙胺加入到PEI-NH₂-FS原液中,30 min后再将1 mL的乙酸酐加入混合物中搅拌24 h,合成PEI-NHAc-FS。使用核磁共振波谱仪和紫外可见光吸收光谱观察PEI-NHAc-FS的结构,并对合成的NPs结构进行表征;CCK-8检测其细胞毒性。选取30只大鼠,根据荧光素钠和PEI-NHAc-FS NPs的浓度（5 g·L^-1、10 g·L^-1、50 g·L^-1）将大鼠分为6组,每组5只,分别于注射前及注射后5 min、20 min、30 min和60 min进行眼底摄像,采集大鼠眼底血管荧光素图像。用激光诱导大鼠脉络膜新生血管模型后,取10只大鼠,随机分为10 g·L^-1荧光素钠组和PEI-NHAc-FS NPs组,每组5只,分别于注射前及注射后5 min、20 min、30 min和60 min通过眼底血管造影成像观察病灶处渗漏。另取40只大鼠,随机分为10 g·L^-1荧光素钠组和PEI-NHAc-FS NPs组,每组20只,于注射后10 min、20 min、30 min和60 min进行荧光冰冻切片。将10只大鼠随机分为对照组（注射生理盐水）和PEI-NHAc-FS NPs组,每组5只,行组织切片HE染色和视网膜电图检测。采用HE染色和视网膜电图观察PEI-NHAc-FS NPs在体内的生物安全性。结果　通过核磁共振和紫外可见光吸收光谱观察到荧光素钠与PEI成功耦合。发射荧光光谱显示,游离荧光素钠和PEI-NHAc-FS NPs的最大发射波长分别出现在546 nm和544 nm处。CCK-8检测结果表明,不同浓度的荧光素钠和PEI-NHAc-FS NPs处理人脐静脉内皮细胞12 h、24 h后,细胞活性差异无统计学意义（P>0.05）。即使用10 μmol·L^-1 PEI-NHAc-FS NPs处理24 h和未处理之间细胞存活率差异亦无统计学意义（P>0.05）。在5 g·L^-1游离荧光素钠组和PEI-NHAc-FS NPs组中,均仅显影视网膜主要血管,不能用于荧光素眼底血管造影的诊断。而在10 g·L^-1游离荧光素钠组和PEI-NHAc-FS NPs组可清晰地显示视网膜主要血管及微血管的结构,且在注射后30 min时血管荧光强度基本相同。PEI-NHAc-FS NPs组在60 min时荧光强度已基本消失,而游离荧光素钠组仍保持较强的荧光强度。10 g·L^-1游离荧光素钠组和PEI-NHAc-FS NPs组荧光素眼底血管造影结果显示,经尾静脉注射造影剂后,视网膜血管内可见荧光成像;同时病灶部位可见荧光渗漏。游离荧光素钠组在视网膜组织中荧光较强,对视网膜组织有较强的吸附和渗透作用,而PEI-NHAc-FS NPs组在视网膜组织中荧光较弱,对视网膜组织吸附较弱。HE染色和视网膜电图对造影剂进行体内生物安全性分析结果显示,PEI-NHAc-FS NPs安全性较好。结论　PEI-NHAc-FS NPs能够安全、有效地用于荧光素眼底血管造影。     

左旋多巴及胞二磷胆碱对单眼形觉剥夺大鼠视皮质α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异嗯唑丙酸-GluR2表达的影响、

背景研究表明α-氨基-3-羟基-5-甲基±异嗯唑丙酸（AMPA）．GluR2与弱视的发生发展有关,左旋多巴及胞二磷胆碱对改善弱视患者的视功能有一定的疗效,但其作用机制尚不完全明了。目的检测敏感期单眼形觉剥夺（MD）大鼠分别应用左旋多巴及胞二磷胆碱后视皮质中AMPA—GluR2的表达情况,探讨左旋多巴及胞二磷胆碱改善视功能的作用机制。方法2周龄健康SD大鼠60只行单侧眼睑缝合31d制作MD动物模型,造模成功后与年龄匹配的正常大鼠15只在自然光条件下一起饲养。将大鼠用随机数字表法随机分为正常对照组、MD组、左旋多巴组、胞二磷胆碱组和生理盐水组,每组15只大鼠。造模后第32天左旋多巴组大鼠给予溶于1ml生理盐水中的左旋多巴40mg／kg灌胃,每日1次;胞二磷胆碱组大鼠给予胞二磷胆碱80mg／kg肌内注射,每日1次;生理盐水组给予1ml生理盐水灌胃,均连续给药28d。分别采用免疫组织化学法、Westernblot法、实时荧光定量PCR法检测各组大鼠视皮质中AMPA—GluR2的表达情况。结果MD组大鼠视皮质中AMPA—GluR2蛋白及mRNA表达均低于正常对照组,差异有统计学意义（0．32±O．02VS．0．64±0．05,t=13．287,P〈0．05;0．30±0．01VS．0．8±t-O．03,t=38．184,P〈0．05）;左旋多巴组视皮质中AMPA—GluR2蛋白及mRNA表达均高于生理盐水组（0．59±0．04VS．0．33±0．03,t=11．628,P〈0．05;0．71±0．06VS．0．33±0．02,t=13．435,P〈0．05）;胞二磷胆碱组大鼠视皮质中AMPA—GluR2蛋白及mRNA表达均高于生理盐水组,差异有统计学意义（0．52±0．04VS．0．33±0．03,t=8．497,P〈0．05;0．48±0．04VS．0．33±0．02,t=7．500,P〈0．05）。结论AMPA-GluR2与视觉发育的可塑性有关,左旋多巴、胞二磷胆碱能够在一定程度上逆转MD引起的AMPA．GluR2表达下降。这一机制可能与其能够改善视功能的作用有关,其作用部位可能在视皮质。     

内质网应激对光照诱导的人视网膜色素上皮细胞损伤的促进作用

背景 视网膜色素上皮(RPE)细胞的光损伤模型是多种视网膜变性类疾病的研究工具,光诱导RPE细胞损伤的主要病理基础是凋亡及炎症反应,但是内质网应激(ERS)反应是否参与其病理机制的研究国内外少有报道. 目的 探讨ERS对光损伤诱导的人RPE细胞凋亡的作用及其机制.方法 体外培养人RPE细胞株(ARPE-19),将培养的细胞分为正常对照组及光照3、6、12和24 h组,各光照组在培养箱内以(2 000± 500) lx的白色荧光灯光照细胞建立光损伤模型,正常对照组细胞在暗环境中培养且不给予光照射,筛选实验最适光照时间.将细胞分为正常对照组、光照组(光照12h)和苯基丁酸(4-PBA)预处理+光照组,4-PBA预处理+光照组先用ERS抑制剂4-PBA培养细胞30 min,然后光照细胞12h.采用流式细胞仪检测各组人RPE细胞的凋亡率和细胞内活性氧(ROS)的荧光强度;采用ELISA法检测各组细胞上清液中炎性因子白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)质量浓度;分别采用实时荧光定量PCR和Western blot法检测人RPE细胞中ERS标志物活化转录因子-6(ATF-6)、C/增强结合蛋白同源蛋白(CHOP)和细胞凋亡标志物半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12(caspase-12) mRNA及其蛋白的表达. 结果 光照后细胞形态呈长梭形改变,边界不清,细胞质脱颗粒,细胞碎片增多,且随光照时间的延长而加重.流式细胞仪检测发现,随光照时间的延长,人RPE细胞内ROS含量逐渐增加,细胞凋亡率逐渐升高,差异均有统计学意义(F=763.00、119.30,均P＜0.01).ELISA法检测发现,与正常对照组比较,光照后6h细胞上清液中IL-1β和TNF-α质量浓度均明显升高,12h达峰.实时荧光定量PCR和Western blot检测显示,与正常对照组比较,光照后人RPE细胞中ATF-6、CHOP和caspase-12 mRNA及其蛋白的相对表达量均明显升高,均于光照后12h达峰或升高,故选择光照12 h为最适光照时间作为后续研究.4-PBA预处理+光照组细胞中ATF-6、CHOP和caspase-12 mRNA的相对表达量均明显低于光照组,差异均有统计学意义(F=281.69、473.88、308.45,均P＜0.01);ATF-6、CHOP和caspase-12蛋白的相对表达量均明显低于光照组,差异均有统计学意义(F=47.86、57.93、106.59,均P＜0.01);细胞凋亡率、细胞上清液中IL-1β和TNF-α质量浓度均明显低于光照组,差异均有统计学意义(F=88.64、245.47、101.01,均P＜0.01). 结论 (2 000±500)lx的光照可诱导人RPE细胞内ROS增加,并激活细胞的ERS反应,导致RPE细胞凋亡及炎症反应.ERS抑制剂4-PBA可抑制光损伤导致的ERS反应,进而降低RPE细胞凋亡率并抑制炎症反应过程.     

白细胞介素-23受体过表达对实验性自身免疫性葡萄膜炎小鼠辅助性T细胞17/调节性T细胞平衡的影响

目的初步探讨白细胞介素(IL)-23受体(IL-23R)过表达对实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)模型小鼠辅助性T细胞17 (Th17细胞)/调节性T细胞(Treg细胞)平衡的影响。方法 8周龄雌性C57BL/6J小鼠12只, 随机分为LV-Ctrl组、LV-IL-23R组, 每组各6只。两组小鼠经尾静脉分别注射LV-Ctrl、LV-IL-23R慢病毒;注射后7 d采用光感受器间维生素A类结合蛋白1-20主动免疫构建EAU小鼠模型。免疫后13 d开始, 每2天使用间接检眼镜观察小鼠眼底并进行临床评分。免疫后30 d, 苏木精-伊红染色观察小鼠视网膜组织病理学改变。酶联免疫吸附测定检测两组小鼠血清中IL-17水平;流式细胞仪检测Th17细胞和Treg细胞比例;实时荧光定量聚合酶链反应检测IL-23R、IL-17、维甲酸相关孤儿受体γt (RORγt)、IL-10和叉头状转录因子p3 (Foxp3) mRNA相对表达量。组间比较采用重复测量方差分析、独立样本Mann-WhitneyU检验和独立样本t检验。结果与LV-Ctrl组比较, LV-IL-23R组小鼠视网膜炎症反应更重。免疫后13 ...     

间充质干细胞来源小胞外囊泡对视网膜光损伤的治疗作用及其机制

目的研究间充质干细胞(MSCs)来源小胞外囊泡(sEVs)对小鼠视网膜光损伤的作用及其可能的机制。方法人脐带来源MSCs采用流式细胞术鉴定表面标记蛋白, 收集第3～5代MSCs培养上清, 超速离心收集sEVs并采用透射电子显微镜鉴定形态。将65只清洁级8～10周龄健康雌性BALB/c小鼠按照随机数字表法随机分为正常组(17只)、磷酸盐缓冲液(PBS)组(24只)和sEVs组(24只)。PBS组和sEVs组小鼠右眼玻璃体腔分别注射2 μl PBS和2 μl sEVs后, 在蓝光照度930 lx的环境下照射6 h;正常组小鼠不做处理。分组处理后3 d, 采用苏木精-伊红染色观察视网膜结构, 原位末端转移酶标记(TUNEL)染色进行凋亡细胞计数, 视网膜电图(ERG)检测小鼠视网膜功能, mRNA转录组测序技术检测PBS组与sEVs组小鼠视网膜mRNA表达差异情况, 并进行差异基因KEGG聚类分析, 实时荧光定量PCR法进一步验证差异基因表达。结果培养的MSCs中CD90、CD105表达阳性, 而CD34、CD45表达阴性, 提取的MSC-sEVs呈直径为80～140 nm的双层膜囊泡结构。...     

后囊膜混浊的体外上皮-间质转化模型的建立

背景 上皮-间质转化(EMT)是导致后囊膜混浊(PCO)的主要发病机制之一,研究LECs的EMT过程对PCO的防治具有重要意义,但目前缺乏研究EMT的PCO体外细胞模型. 目的 建立新的人晶状体囊外摘出术PCO的体外囊袋培养模型,探讨PCO形成过程中LECs EMT的发生情况.方法 利用健康供体的40只尸眼行体外模拟的白内障摘出术,游离晶状体囊袋后用昆虫针固定于培养皿,置于含体积分数10％胎牛血清的DMEM/F12培养液中培养4周,分别于培养后0、3、7、14和28 d在光学显微镜下观察培养囊袋中LECs的生长情况;收集0、3、7和28 d的囊袋组织制备组织病理学切片,采用苏木精-伊红染色法检测囊袋上LECs的细胞形态;采用免疫组织化学染色法检测EMT标志物α-SMA、E-cadherin和Vimentin蛋白在囊袋上LECs中的表达和定位;采用实时荧光定量PCR和Western blot法检测不同时间点囊袋上LECs中α-SMA、E-cadherin和Vimentin mRNA及其蛋白的表达变化. 结果 未进行培养的囊袋后囊膜上未发现LECs生长,囊袋培养后3d可见后囊膜周边出现LECs并逐渐向中央区增生,培养后7 d LECs完全覆盖后囊膜,略呈铺路石样外观并出现皱褶,此后随着培养时间的延长皱褶的数量增多并伸长,囊袋张力增强.免疫组织化学染色结果显示,随培养时间的延长,囊袋上LECs中E-cadherin的表达强度逐渐下降,而α-SMA和Vimentin的表达强度逐渐增强.实时荧光定量PCR检测表明,培养后0、3、7、14和28 d囊袋上LECs中E-cadherin mRNA的相对表达量分别为3.35±0.13、1.47±0.20、1.13±0.14、1.00±0.85和0.23±0.03,Vimentin mRNA的相对表达量分别为1.00±0.73、1.05±0.14、2.24±0.43、2.84±0.34和8.570±0.40,α-SMA mRNA的相对表达量分别为1.00±0.06、2.68±0.28、4.24±0.05、2.05±0.90和15.30±0.19,总体比较差异均有统计学意义(E-cadherin mRNA:F=23.430,P=0.000;Vimentin mRNA:F=8.915,P=0.002;α-SMA mRNA:F=103.500,P=0.000),其中培养后28 d囊袋上LECs中E-cadherin mRNA的相对表达量最低,而Vimentin mRNA和α-SMA mRNA的相对表达量均最高,差异均有统计学意义(均P＜0.01).Western blot检测结果表明,培养后0、3和28 d囊袋上LECs中E-cadherhin蛋白表达的灰度值分别为1.443±0.017、1.023±0.003和0.568±0.018,Vimentin蛋白表达的灰度值分别为0.565±0.012,1.156±0.007和1.241 ±0.009,α-SMA蛋白表达的灰度值分别为0.195±0.045,0.693±0.036和1.501±0.005,总体比较差异均有统计学意义(E-cadherhin:F=2 787.000,P=0.000:Vimentin:F=4 488.000,P=0.000;α-SMA:F=1 173.000,P=0.000),其中培养后3、28 d LECs中E-cadherhin蛋白表达明显低于0d,而Vimentin和α-SMA蛋白表达明显高于0d,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 本研究中的新囊袋模型进行LECs体外培养能模拟体内白内障术后晶状体后囊LECs的EMT自然过程,是探讨PCO发生机制和方法新的体外细胞模型.