共转染EGFP和hMnSOD基因对猴骨髓源神经干细胞抗氧化能力的影响

目的：人正义、反义MnSOD基因和EGFP共转染恒河猴骨髓源神经干细胞，观察MnSOD基因对猴骨髓源神经干细胞抗氧化能力和报告基因表达的影响。方法：应用NucleofectorTM核转染仪将人正义、反义MnSOD基因和荧光真核表达载体共转染体外培养的恒河猴骨髓源神经干细胞，荧光显微镜下观察荧光蛋白在细胞内的表达，并检测转染细胞的超氧化物歧化酶(SOD)活性。结果：①转染24h后，共转染细胞可见荧光蛋白在骨髓源神经干细胞内有效表达，荧光显微镜下发强绿色荧光，其转染率约为80％。②转染人正义MnSOD基因的细胞的总SOD活性[(8．03&;#177;0.74)NU／mg]与转染人反义MnSOD基因细胞的总SOD活性[7．19&;#177;0．86)NU／mg]差异无显著性意义，但MnSOD活性前者明显高于后者1．89倍。结论：MnSOD基因与EGFP基因共转染骨髓源神经干细胞，均有效表达，提高了细胞内MnSOD活性，为多基因联合治疗帕金森病提供了可行的技术平台。     

食蟹猴骨髓源神经干细胞移植的实验研究

背景：目前的研究显示骨髓基质细胞(bone marrow stormal ceils，BMSCs)，可通过培养转分化为神经干细胞，但神经干细胞通过何种方法对脑皮质创伤灶进行修复以及在脑皮质创伤灶中是否具有生长、迁移能力等情况尚不清楚。目的：探讨食蟹猴自体骨髓基质细胞诱导分化成神经干细胞后移植到脑内的生长情况。设计：以实验动物为研究对象，前瞻性、对照研究。单位：一所军医大学医院的神经外科。材料：实验在解放军第一军医大学珠江医院全军神经医学研究所中心实验室进行，实验动物是由华南灵长类动物中心提供健康成年食蟹猴6只。千预：对6只食蟹猴进行了骨髓基质干细胞体外培养、诱导分化成神经干细胞，经BrdU标记后进行自体脑移植。主要观察指标：对接受实验干预的脑组织进行苏木精-伊红染色和免疫组化染色，光镜下观察。、结果：苏木精-伊红染色显示即时移植和延迟移植的创伤区细胞数量都明显多于假移植治疗对照；免疫组织化学染色显示即时移植组和延迟移植组两组动物在干细胞移植后1—6个月脑皮质创伤灶内均有BrdU阳性表达细胞，移植后半年的动物在移植区邻近的脑白质内也可观察到有BrdU阳性表达的细胞，而创伤对照动物、假移植治疗动物和正常脑组织中则未见BrdU阳性表达。结论：BMSCs体外培养得到的神经干细胞经过自体移植能在脑皮质内存活，并且能增殖、分化和迁移，可成为神经干细胞的替代细胞或来源细胞；干细胞移植到陈旧性的脑皮质损伤灶也具有成活、增殖和迁移能力。     

食蟹猴骨髓源神经干细胞移植的实验研究

背景目前的研究显示骨髓基质细胞(bone marrow stormal cells,BMSCs),可通过培养转分化为神经干细胞,但神经干细胞通过何种方法对脑皮质创伤灶进行修复以及在脑皮质创伤灶中是否具有生长、迁移能力等情况尚不清楚.目的探讨食蟹猴自体骨髓基质细胞诱导分化成神经干细胞后移植到脑内的生长情况.设计以实验动物为研究对象,前瞻性、对照研究.单位一所军医大学医院的神经外科.材料实验在解放军第一军医大学珠江医院全军神经医学研究所中心实验室进行,实验动物是由华南灵长类动物中心提供健康成年食蟹猴6只.干预对6只食蟹猴进行了骨髓基质干细胞体外培养、诱导分化成神经干细胞,经BrdU标记后进行自体脑移植.主要观察指标对接受实验干预的脑组织进行苏木精-伊红染色和免疫组化染色,光镜下观察.结果苏木精-伊红染色显示即时移植和延迟移植的创伤区细胞数量都明显多于假移植治疗对照;免疫组织化学染色显示即时移植组和延迟移植组两组动物在干细胞移植后1～6个月脑皮质创伤灶内均有BrdU阳性表达细胞,移植后半年的动物在移植区邻近的脑白质内也可观察到有BrdU阳性表达的细胞,而创伤对照动物、假移植治疗动物和正常脑组织中则未见BrdU阳性表达.结论BMSCs体外培养得到的神经干细胞经过自体移植能在脑皮质内存活,并且能增殖、分化和迁移,可成为神经干细胞的替代细胞或来源细胞;干细胞移植到陈旧性的脑皮质损伤灶也具有成活、增殖和迁移能力.     

经Nurr1基因转染的骨髓间充质干细胞移植对帕金森病大鼠旋转行为及纹状体多种神经因子的影响

目的：观察对中脑腹侧多巴胺能神经元分化、成熟及存活起重要作用的Nurr1基因修饰大鼠骨髓间充质干细胞脑内移植后，对帕金森病大鼠旋转行为及纹状体多巴胺、二羟苯乙酸及高香草酸含量比值的影响。方法：实验于2003-08／2004-12在中山大学附属第一医院神经病学国家重点实验室进行。取SD雄性大鼠，右侧中脑黑质致密区注入6-羟基多巴(2g／L)3μL制备帕金森病模型，4周后将69只成功帕金森病模型随机分为3组：①对照组24只：右侧纹状体尾状核头部注入生理盐水4．5μL。②骨髓间充质干细胞组24只：相同部位注入培养纯化的骨髓间充质干细胞4．5μL。③转Nurr1基因骨髓间充质干细胞组21只：用脂质体转染法转染PcDNA3．1(+)-Nurr1入大鼠骨髓间充质干细胞并稳定表达，然后移植入模型大鼠脑内，部位和剂量与其他两组相同。观察各组大鼠旋转行为学变化，并用免疫组化、反转录-聚合酶链反应等方法检测移植细胞的Nurr1，DAT和酪氨酸羟化酶表达；利用高效液相色谱检测大鼠脑内多巴胺、二羟苯乙酸和高香草酸含量。结果：59只大鼠进入结果分析。①旋转行为学变化：与对照组相比，移植前1周无明显差异(P&;gt;0．05)，移植后2～8周，另2组大鼠旋转行为明显改善(P＜0．05)；转Nurr1基因骨髓间充质干细胞组在移植后2～4周较骨髓间充质干细胞组轻(P＜0．05)，但至8周时两组无差异(P&;gt;0．05)，②Norr1及DAT和酪氨酸羟化酶阳性表达：免疫组化结果显示转Nurr1基因骨髓间充质干细胞组移植区能够稳定表达Nurr1且少量细胞表达DAT，但未发现酪氨酸羟化酶阳性细胞，其他两组移植区未发现阳性细胞。③Nurr1及DAT和酪氨酸羟化酶mRNA表达：移植后2～8周，聚合酶链反应产物经电泳、3组大鼠术侧纹状体染色后均可见1030bp片段(DAT)，241bp片段(Nurr1)，438bp片段(β-actin)，但未发现酪氨酸羟化酶条带(647bp)。④脑内纹状体多巴胺、二羟苯乙酸、高香草酸术侧与健侧比值：移植后2，8周，两治疗组均较对照组增高(P＜0．05)，但8周时两治疗组比较无差异(P&;gt;0．05)。结论：转Nurr1基因大鼠骨髓间充质干细胞在帕金森病大鼠模型纹状体内可以存活(8周以上)，在该环境中Nurr1基因的过表达可以促进大鼠骨髓间充质干细胞的DAT基因表达，能显著改善帕金森病大鼠的旋转行为，并在一定时期内维持纹状体内相对较高的多巴胺、二羟苯乙酸、高香草酸水平。     

白细胞介素1α与胶质细胞源神经营养因子不同组合对骨髓源性神经干细胞体外诱导分化的影响

目的：比较白细胞介素1α与胶质细胞源神经营养因子不同组合条件下骨髓基质细胞分化情况，探讨骨髓基质细胞诱导分化为神经干细胞及多巴胺能神经元的分化条件。方法：2005-03／09在解放军第一军医大学珠江医院全军神经医学研究所进行。①实验分组：实验分为空白对照组；胶质细胞源神经营养因子＋白细胞介素ld组，后者又分为10μg/L＋100ng/L,10μg/L＋200ng/L,20μg/L＋100ng/L,20μg/L＋200ng/L,1000μg/L＋100ng/L组。②细胞模型制作：用全骨髓法培养骨髓基质细胞。③骨髓基质细胞以5&;#215;10^8L^-1接种，悬浮于本实验室配制的神经干细胞培养基中。空白对照组：血清终浓度为体积分数为0．1的胎牛血清。细胞接种48h后，胶质细胞源神经营养因子＋白细胞介素1α各组分别加人相应质量浓度的胶质细胞源神经营养因子＋白细胞介素1α。④应用Olympus光学显微镜观察细胞抗-神经巢蛋白和D2受体阳性染色阳性细胞数目计数。结果：①加人胶质细胞源神经营养因子、白细胞介素1α增殖培养48h可见细胞分裂相。②诱导6d，部分细胞有神经巢蛋白成分表达。③3周测出DA受体D2检测阳性，胶质细胞源神经营养因子＋白细胞介素1α 10μg/L＋100ng／L组细胞诱导分化率显著高于10μg/L＋200ng／L，20μg/L＋100ng／L，20μg/L＋200ng／L，1000μg/L＋100ng／L组及空白对照组[依次为：（11.70&;#177;0.55）％，（3.62&;#177;0．78）％，（4．14&;#177;0．41）％，（3.3&;#177;0．63）％，（4．92&;#177;0．34）％，（1．61&;#177;0．68）％，P〈0．05或0.01].结论：骨髓基质细胞在体外培养条件下，经过胶质细胞源神经营养因子、白细胞介素1α诱导分化作用，配合使用高浓度（体积分数为0．1）血清可获得巢蛋白阳性的神经前体细胞及表达D2受体阳性的多巴胺能神经元；10μg/L＋100ng／L为最佳诱导分化质量浓度。     

经Nurr1基因转染的骨髓间充质干细胞移植对帕金森病大鼠旋转行为及纹状体多种神经因子的影响

目的:观察对中脑腹侧多巴胺能神经元分化、成熟及存活起重要作用的Nurr1基因修饰大鼠骨髓间充质干细胞脑内移植后,对帕金森病大鼠旋转行为及纹状体多巴胺、二羟苯乙酸及高香草酸含量比值的影响。方法:实验于2003-08/2004-12在中山大学附属第一医院神经病学国家重点实验室进行。取SD雄性大鼠,右侧中脑黑质致密区注入6-羟基多巴(2g/L)3μL制备帕金森病模型,4周后将69只成功帕金森病模型随机分为3组:①对照组24只:右侧纹状体尾状核头部注入生理盐水4.5μL。②骨髓间充质干细胞组24只:相同部位注入培养纯化的骨髓间充质干细胞4.5μL。③转Nurr1基因骨髓间充质干细胞组21只:用脂质体转染法转染PcDNA3.1(+)-Nurr1入大鼠骨髓间充质干细胞并稳定表达,然后移植入模型大鼠脑内,部位和剂量与其他两组相同。观察各组大鼠旋转行为学变化,并用免疫组化、反转录-聚合酶链反应等方法检测移植细胞的Nurr1,DAT和酪氨酸羟化酶表达;利用高效液相色谱检测大鼠脑内多巴胺、二羟苯乙酸和高香草酸含量。结果:59只大鼠进入结果分析。①旋转行为学变化:与对照组相比,移植前1周无明显差异(P>0.05),移植后2～8周,另2组大鼠旋转行为明显改善(P<0.05);转Nurr1基因骨髓间充质干细胞组在移植后2～4周较骨髓间充质干细胞组轻(P<0.05),但至8周时两组无差异(P>0.05)。②Nurr1及DAT和酪氨酸羟化酶阳性表达:免疫组化结果显示转Nurr1基因骨髓间充质干细胞组移植区能够稳定表达Nurr1且少量细胞表达DAT,但未发现酪氨酸羟化酶阳性细胞,其他两组移植区未发现阳性细胞。③Nurr1及DAT和酪氨酸羟化酶mRNA表达:移植后2～8周,聚合酶链反应产物经电泳、3组大鼠术侧纹状体染色后均可见1030bp片段(DAT),241bp片段(Nurr1),438bp片段(β-actin),但未发现酪氨酸羟化酶条带(647bp)。④脑内纹状体多巴胺、二羟苯乙酸、高香草酸术侧与健侧比值:移植后2,8周,两治疗组均较对照组增高(P<0.05),但8周时两治疗组比较无差异(P>0.05)。结论:转Nurr1基因大鼠骨髓间充质干细胞在帕金森病大鼠模型纹状体内可以存活(8周以上),在该环境中Nurr1基因的过表达可以促进大鼠骨髓间充质干细胞的DAT基因表达,能显著改善帕金森病大鼠的旋转行为,并在一定时期内维持纹状体内相对较高的多巴胺、二羟苯乙酸、高香草酸水平。     

骨髓间质干细胞异位移植在椎间盘内的迁移及外源基因的表达

目的:观察骨髓间质干细胞异位移植在椎间盘内的存活、迁移情况及外源基因的表达。方法:实验于2001-10/2003-07在西安交通大学环境与疾病相关基因教育部重点实验室完成。选取新西兰大白兔32只,每只兔子的椎间盘均被随机分为4个区组,即正常对照组(L2～3)、生理盐水组(L3～4)、绿色荧光蛋白细胞移植组(L4～5)及BMP-绿色荧光蛋白细胞移植组(L5～6)。分别进行髓核注射,正常对照组不注射;生理盐水组注射20μL生理盐水;绿色荧光蛋白细胞移植组注射20μL林格氏液包含1×105的含绿色荧光蛋白的骨髓间质干细胞;BMP-绿色荧光蛋白细胞移植组注射20μL林格氏液包含1×105的含BMP-绿色荧光蛋白的骨髓间质干细胞。术后1,3,6个月取材,荧光显微镜观察髓核组织内绿色荧光强度;DNA-PCR分析新霉素抗性基因的DNA拷贝数。结果:32只白兔全部进入结果分析,无脱失。①术后不同时间点各组髓核组织内绿色荧光强度比较:绿色荧光蛋白细胞移植组及BMP-绿色荧光蛋白细胞移植组髓核组织内可观察到荧光的存在,随时间的增加,荧光变得比较分散。两组荧光的分布和强度并没有明显的差别。②各组髓核组织内新霉素抗性基因表达水平比较:绿色荧光蛋白细胞移植组及BMP-绿色荧光蛋白细胞移植组术后1,3,6个月组间及组内比较,差异均无显著性意义(P>0.05)。结论:移植的骨髓间质干细胞能够在髓核内存活、迁移,外源基因可以在髓核内表达,提示基于骨髓间质干细胞移植的治疗策略是防治椎间盘退变的潜在有效方法。     

碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子对恒河猴骨髓源性神经干细胞的体外诱导增殖作用

目的:探索骨髓基质细胞(bonemarrowstromalcells,BMSCs)体外诱导分化为神经干细胞(nervestemcells,NSCs)的增殖条件,比较碱性成纤维细胞生长因子(basefibroblastgrowthfactor,bFGF)、表皮生长因子(epidermalgrowthfactor,EGF)对神经干细胞生长曲线的影响,为BMSCs在神经科学领域内的应用提供参考。方法:以恒河猴骨髓中分离出的BMSCs为实验对象,实验组利用NSC培养基和bFGF,EGF生长因子,进行体外培养、诱导、增殖。对照组用神经干细胞培养基进行培养增殖。Nestin及CD133作为免疫细胞化学鉴定NSCs的细胞标志。结果:原代培养第6天时多数细胞表现为Nestin及CD133抗原阳性,此后实验组及对照组细胞数量开始明显扩增,但实验组增殖更为明显,bFGF+EGF组从第8天时的(96.30±8.78)×104增加到第18天时的(1407.90±26.62)×104,并且增殖开始的时间较对照组提前2d。NSCs在10d后有少量细胞向神经元和神经胶质细胞分化。结论:bFGF与EGF联合应用能够促使NSCs增殖时间提前及增殖效能显著提高。另外,bFGF和EGF还具有诱导NSC向神经细胞分化的作用。     

白细胞介素1α与胶质细胞源神经营养因子不同组合对骨髓源性神经干细胞体外诱导分化的影响

目的:比较白细胞介素1α与胶质细胞源神经营养因子不同组合条件下骨髓基质细胞分化情况,探讨骨髓基质细胞诱导分化为神经干细胞及多巴胺能神经元的分化条件。方法:2005-03/09在解放军第一军医大学珠江医院全军神经医学研究所进行。①实验分组:实验分为空白对照组;胶质细胞源神经营养因子 白细胞介素1α组,后者又分为10μg/L 100ng/L,10μg/L 200ng/L,20μg/L 100ng/L,20μg/L 200ng/L,1000μg/L 100ng/L组。②细胞模型制作:用全骨髓法培养骨髓基质细胞。③骨髓基质细胞以5×108L-1接种,悬浮于本实验室配制的神经干细胞培养基中。空白对照组:血清终浓度为体积分数为0.1的胎牛血清。细胞接种48h后,胶质细胞源神经营养因子 白细胞介素1α各组分别加入相应质量浓度的胶质细胞源神经营养因子 白细胞介素1α。④应用Olympus光学显微镜观察细胞抗-神经巢蛋白和D2受体阳性染色阳性细胞数目计数。结果:①加入胶质细胞源神经营养因子、白细胞介素1α增殖培养48h可见细胞分裂相。②诱导6d,部分细胞有神经巢蛋白成分表达。③3周测出DA受体D2检测阳性,胶质细胞源神经营养因子 白细胞介素1α10μg/L 100ng/L组细胞诱导分化率显著高于10μg/L 200ng/L,20μg/L 100ng/L,20μg/L 200ng/L,1000μg/L 100ng/L组及空白对照组犤依次为:(11.70±0.55)%,(3.62±0.78)%,(4.14±0.41)%,(3.3±0.63)%,(4.92±0.34)%,(1.61±0.68)%,P<0.05或0.01犦。结论:骨髓基质细胞在体外培养条件下,经过胶质细胞源神经营养因子、白细胞介素1α诱导分化作用,配合使用高浓度(体积分数为0.1)血清可获得巢蛋白阳性的神经前体细胞及表达D2受体阳性的多巴胺能神经元;10μg/L 100ng/L为最佳诱导分化质量浓度。     

阿司匹林对骨髓间充质干细胞生长的影响及可能的作用途径

目的：观察阿司匹林对骨髓间充质干细胞生长和参与细胞信号传导的β-连环素表达的影响。方法：实验于2003—08／2005-01在阜外心血管病医院再生医学中心完成。选用体质量80g左右SD大鼠24只。体外分离培养SD大鼠的骨髓间充质干细胞，应用^3H-胸腺嘧啶核苷掺入法观察不同浓度(1，5，10mmol／L)的阿司匹林作用24h后对骨髓间充质干细胞DNA合成的影响。以免疫印迹法观察上述浓度的阿司匹林作用24h后骨髓间充质干细胞表达总β-连环素的情况和β-连环素的磷酸化水平。结果：①不同浓度(1，5，10mmol／L)的阿司匹林作用于骨髓间充质干细胞24h后，其^3H-胸腺嘧啶核苷掺入值明显降低。1，5和10mmol／L的阿司匹林作用后的细胞^3H-胸腺嘧啶核苷掺入的每分钟脉冲数明显低于对照组[(11061．83&;#177;1004．37)，(6609．33&;#177;1432．60)，(133．33&;#177;51．56)，(13080．83&;#177;1869．96)min^-1，P&;lt;0．05～0．01]。说明阿司匹林抑制了骨髓间充质干细胞的DNA合成。②^3H-胸腺嘧啶核苷掺入能力与阿司匹林浓度(1—10mmol／L)呈显著负相关(r=-0．95，P&;lt;0．05)。在10mmol／L浓度下，骨髓间充质干细胞的^3H-胸腺嘧啶核苷掺入几乎全部被抑制。③免疫印迹法结果表示，阿司匹林浓度与骨髓间充质干细胞33位丝氨酸磷酸化的β-连环素表达呈正相关(r=0．89，P&;lt;0．05)。说明阿司匹林的作用使β-连环素的磷酸化水平增高，即促进其降解。④3个浓度的阿司匹林作用24h后骨髓间充质干细胞总β-连环素的表达水平与对照组比较，无明显差异(P&;gt;0．05)。因此结合③可知阿司匹林使胞浆内未磷酸化的β-连环素降低。结论：阿司匹林对骨髓间充质干细胞的生长有明显抑制作用，这种作用可能是通过提高骨髓间充质干细胞中β-连环素磷酸化，促进其降解，进而抑制β-连环素参与的Wnt／β-连环素信号通路所致，其抑制作用的发生与阿司匹林的药物浓度相关。     

利用菲立磁细胞内标记恒河猴骨髓基质细胞的初步实验

目的:探索利用菲立磁和转染试剂体外磁性标记恒河猴骨髓基质细胞的可行性,为临床上应用磁共振成像追踪标记细胞奠定基础。方法:实验于2004-04/2005-05在南方医科大学珠江医院全军神经医学研究所完成。纳入健康恒河猴3只,无菌条件下取骨髓,梯度密度离心法分离获取恒河猴骨髓基质细胞,使用“菲立磁-多聚赖氨酸复合物”标记骨髓基质细胞,采用普鲁士兰染色、电镜和锥虫蓝排除实验等方法鉴定菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记恒河猴骨髓基质细胞的效率和细胞的活力,并对菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记骨髓基质细胞的增殖和分化能力进行评估。结果:①菲立磁可以高效率地标记骨髓基质细胞,标记效率在99%左右。②普鲁士蓝染色显示菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记骨髓基质细胞胞质内出现细小的蓝色铁颗粒。③电镜结果显示菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记的骨髓基质细胞胞质内含有许多包裹铁颗粒的囊泡。④与正常未标记的细胞相比较,菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记对骨髓基质细胞的活力、增殖和分化等能力没有明显的影响。结论:菲立磁可以用来体外标记恒河猴骨髓基质细胞。     

利用菲立磁细胞内标记恒河猴骨髓基质细胞的初步实验

目的：探索利用菲立磁和转染试剂体外磁性标记恒河猴骨髓基质细胞的可行性，为临床上应用磁共振成像追踪标记细胞奠定基础。方法：实验于2004—04／2005—05在南方医科大学珠江医院全军神经医学研究所完成。纳入健康恒河猴3只，无菌条件下取骨髓，梯度密度离心法分离获取恒河猴骨髓基质细胞，使用“菲立磁-多聚赖氨酸复合物”标记骨髓基质细胞，采用普鲁士兰染色、电镜和锥虫蓝排除实验等方法鉴定菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记恒河猴骨髓基质细胞的效率和细胞的活力，并对菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记骨髓基质细胞的增殖和分化能力进行评估。结果：①菲立磁可以高效率地标记骨髓基质细胞，标记效率在99％左右。②普鲁士蓝染色显示菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记骨髓基质细胞胞质内出现细小的蓝色铁颗粒。③电镜结果显示菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记的骨髓基质细胞胞质内含有许多包裹铁颗粒的囊泡。④与正常未标记的细胞相比较，菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记对骨髓基质细胞的活力、增殖和分化等能力没有明显的影响。结论：菲立磁可以用来体外标记恒河猴骨髓基质细胞。     

免疫磁珠法分离成人骨髓来源神经干细胞的生物学特征

背景:骨髓间充质干细胞在一定条件下可分化成为多种结缔组织细胞,也可分化成神经系统的神经元和神经胶质细胞.目的:观察采用免疫磁珠法分离成人骨髓来源神经干细胞的生物学特征.设计、时间及地点:以患者自身骨髓组织为观察对象的实验,于2003-03/2007-06在菏泽市立医院检验科完成.材料:骨髓组织来自菏泽市立医院神经内科住院的中风、老年性痴呆、帕金森病、脑缺血等神经系统疾病患者.方法:利用免疫磁珠表面的特异性抗体与骨髓组织中神经干细胞抗原相结合,在磁场作用下使结合磁珠与其他细胞分离,从而获得神经干细胞,再将所分离的纯化神经干细胞接种到含体积分数为0.20胎牛血清的Eagles MEM培养液,再在培养基中加入碱性成纤维因子和表皮生长因子进行原代培养.主要观察指标:采用免疫组织化学染色与免疫荧光染色鉴定细胞,并采用流式细胞术测定细胞DNA含量.结果:在相差显微镜下观察培养的神经干细胞,细胞形态丰满,胞核及核仁清晰可见,神经突起粗大,网络稠密.免疫组织化学和免疫荧光染色显示,细胞神经元特异性烯醇化酶、神经蛋白、胶质纤维酸性蛋白酶、微管相关蛋白为阳性.传代后的细胞用流式细胞术测定DNA含量为正常二倍体,无诱发突变.结论:利用免疫磁珠表面的特异性抗体与骨髓组织中神经干细胞抗原相结合方法从成人骨髓分离出神经干细胞,在神经化学和形态上已具备神经细胞的特征.     

Recent advances of transplantation from bone marrow derived stem cells

The current progress of blood and marrow transplantation (except CBSCT) could be summarized as the followings; (1) HLA 1-haplo mismatched family donors have been recognized as suitable donor candidates under certain preconditioning regimens. On the other hand, the analysis of the relationship between HLA allele level match/mismatch and the outcomes of the unrelated bone marrow transplantation offered more sophisticated algorithm for donor selection. New devices and drugs to harvest stem cells are under clinical studies. The efficacy of intra bone marrow transplantation has been proved. (2) Fludarabine and i.v. busulfan has one of standards of preconditioning. New generation of drugs such as imatinib may be also beneficial to transplant outcome. (3) ATG, foscavil and other new drugs as well ex vivo manipulated DLI would contribute better outcomes. (4) Registration and follow up for patients and donors would be a global standard in near future.     

神经巢蛋白抗原在兔骨髓源神经干细胞分化各阶段的表达

目的检测神经巢蛋白抗原在兔骨髓基质细胞 (bone marrow stromal cell,BMSCs)向神经细胞方向分化不同阶段的表达情况,为寻找骨髓基质细胞源性神经干细胞移植修复神经损伤最佳阶段提供体外实验依据. 方法以免 BMSCs为实验对象,以" CYTOKINE·神经干细胞培养基"培养,并分作对照组胶质源性神经营养因子( GDNF,1 μ g /L)+维甲酸( 0.5 mg/L)组及"碱性成纤维细胞生长因子( bFGF,10 μ g /L)组.免疫荧光细胞化学鉴定神经干细胞神经巢蛋白抗原,以流式细胞仪 (FCM)鉴定分化各阶段表达神经巢蛋白的细胞比例. 结果部分兔 BMSCs在相应培养条件下分裂增殖为含粗大胞质颗粒的大圆形细胞,这些细胞表达神经巢蛋白,并能进一步分化成神经组织样细胞. FCM检测结果经纯化的 BMSCs中神经巢蛋白 (+ )细胞占了 5.52%,随着分化的进行,在对照组分化第 8 天为 1.56%,第 16 天为 0.47%. GDNF+维甲酸组第 8 天为 1.84%,第 16天降至 0.31%.而 bFGF组,分化第 8 天神经巢蛋白 (+ )细胞比例升至 6.18%,第 16 天则降至 1.33%. 结论在以上实验条件下可诱导兔 BMSCs向神经干细胞及神经组织样细胞转化的功能.在 BMSCs向神经组织样细胞方向分化过程中,神经巢蛋白的表达呈下降趋势.而 bFGF可使表达神经巢蛋白的细胞比例增高,可用于体外富集神经干细胞.     

细胞周期蛋白Ⅰ基因在骨髓间质干细胞诱导致瘤过程中的表达

目的 研究人骨髓间质干细胞(MSCs)诱导肿瘤的机制.方法 取18只SCID裸鼠随机分为对照组和实验组,对照组注射MSCs,实验组注射F6细胞,于第4(F6-4)、6(F6-6)、7(F6-7)周取肿瘤组织(每组3只).4例肺癌患者的肺癌标本(Lc)和癌旁标本为分别取自不同部位的手术病理标本.并用荧光差异显示技术(FDD)寻找差异基因;用PCR扩增、蛋白质印迹(WB)加以验证;实时荧光定量逆转录(FQ-RT)-PCR技术检测诱导致瘤细胞在裸鼠体内致瘤后致瘤组织基因表达水平.用粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素-4(IL-4)诱导MSCs致肿瘤细胞(F6细胞).结果 FDD结果显示,细胞周期蛋白(cyclin)Ⅰ基因高表达,与PCR、WB结果一致.FQ-RT-PCR表明,cyclin Ⅰ基因在MSCs、F6及3组F6致瘤组织细胞之间的表达水平差异有统计学意义(F=12.29,P<0.01),F6组cyclin Ⅰ基因表达水平为4.49±0.40,MSCs基因表达水平为0.04±0.02,增高112倍(P<0.01).裸鼠皮下注射致瘤细胞后,第4,6,7周分离肿瘤组织内cyclin Ⅰ基因表达分别为1.82±0.80、3.30±0.43和3.68±1.67,且呈上升趋势(与MSCs对比,P分别为<0.05或<0.01).4例肺癌患者肺癌组织基因表达分别为0.15±0.02、0.58±0.23、4.82±1.12、1.21±0.60,癌旁组织基因表达分别为0.04±0.02、0.09±0.04、0.94±0.74、0.15±0.08,肺癌组织内cyclin Ⅰ基因表达明显高于癌旁组织(F=12.39,P<0.01).WB证明F6细胞cyclin Ⅰ蛋白表达为0.32±0.08,MSCs蛋白表达为0.09±0.06,增高3.6倍(t=3.86,P<0.05).结论 cyclin Ⅰ基因在MSCs诱导突变到肿瘤细胞形成过程中高表达,且在MSCs诱导肿瘤发生过程中可能发挥重要作用.     

绿荧光蛋白标记人骨髓源性神经干细胞的体外实验研究

目的:探讨重组腺相关病毒包装绿荧光蛋白(rAAV-GFP)标记人骨髓源性神经干细胞(BM.NSCs)的可行性,为进一步行标记细胞移植实验研究奠定基础。方法:以成人自愿者的骨髓为研究对象,梯度密度离心法分离获取骨髓基质细胞并用“Cytokine·神经干细胞培养基”诱导分化为神经干细胞,分化的细胞以免疫细胞化学鉴定。对接种生长的BM.NSCs(1×105～6/mL)以无血清培养基冲洗并重悬细胞,依最佳病毒感染指数(MOI)为105的标准计算、加入包装了GFP的rAAV病毒颗粒,连续培养12h(37℃,50mL/LCO2)以感染细胞;补加100g/L胎牛血清后,于神经干细胞培养基中继续细胞培养24h(37℃,50mL/LCO2)以上,荧光显微镜(OlympusIX70,Japan)追踪观察rAAV-GFP标记的BM.NSCs。结果:BM.NSCs于标记后1周内见不到GFP阳性表达;在标记10d后才出现有GFP阳性表达情况(平均每个200倍镜下视野可见到5～10个GFP阳性细胞),所标记的细胞在荧光显微镜下呈亮绿色;随着培养时间延长,BM.NSCs表达GFP也逐渐增强、阳性细胞数量逐渐增多,并可于1个月时最明显(标有GFP阳性的细胞可达BM.NSCs总数的60%),追踪观察到到2.5个月时亦未见衰减。结论:rAAV-GFP在人骨髓源性神经干细胞中的表达较迟,但呈渐强趋势;rAAV-GFP标记人骨髓源性神经干细胞具有可行性。     

胚脑来源与骨髓来源神经干细胞的比较:应用原子力显微镜的观察

目的:应用原子力显微镜(atomicforcemicroscopy,AFM)观测胚鼠前脑来源的神经干细胞及成鼠骨髓诱导来源的神经干细胞表面的形貌结构,并比较两者的异同。方法:实验于2003-09/2004-09在南方医科大学珠江医院全军神经医学研究所完成。分别取怀孕10.5～14.5d胚鼠行前脑来源神经干细胞和成鼠骨髓来源神经干细胞培养,神经干细胞培养基、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF,20μg/L)维甲酸(300μg/L)持续诱导培养10d,以平板克隆法测定两种来源干细胞的克隆形成率,光学显微镜和原子力显微镜分别进行观测。结果:光学显微镜下两种来源的神经干细胞均表现为大圆形细胞,直径6～12μm,细胞形貌相似;但神经来源神经干细胞显示更强的增殖能力,其细胞克隆形成率显著大于骨髓来源神经干细胞(χ2=4.444,P<0.05);原子力显微镜下可观测到神经来源干细胞表面有较多颗粒样隆起,其表面粗糙,平均粗糙度为(18.5±2.0)nm,均方根粗糙度为(20.7±2.5)nm,而骨髓来源神经干细胞表面相对光滑,其表面平均粗糙度为(10.2±1.2)nm,均方根粗糙度为(12.9±1.3)nm,两者经t检验统计分析差异有非常显著性意义(P<0.01)。结论:神经来源神经干细胞较骨髓来源神经干细胞表面有更多颗粒样隆起,表面更粗糙,可能与其有更强的增殖能力有关。