应用细胞片层技术构建组织工程骨

背景：传统的骨组织工程学在收获和转移细胞方面仍存在诸多不足,细胞片层技术是收获种子细胞和对种子细胞进行转移的一项新技术。 目的：应用细胞片层技术与传统骨组织工程相结合的方法构建组织工程骨。 方法：密度梯度离心法分离培养犬骨髓间充质干细胞,诱导其向成骨细胞分化。将诱导后的骨髓间充质干细胞接种至温度反应性培养皿中,先37 ℃饱和湿度培养,然后降温至20 ℃制备细胞片层;将犬脱钙骨基质/富血小板血浆/骨髓间充质干细胞细胞片层/骨髓间充质干细胞复合体植入犬左侧背阔肌下,术后4,8,12周,观察成骨情况。 结果与结论：当温度降至20 ℃时,骨髓间充质干细胞从温度反应性培养皿上完全脱落,形成细胞片层,将其覆盖于犬脱钙骨基质/富血小板血浆/骨髓间充质干细胞后植入犬背阔肌下,其成骨效果明显好于不加细胞片层对照侧。说明应用细胞片层技术与传统的骨组织工程方法相结合可构建出较理想的组织工程骨。     

犬骨髓间充质干细胞分离培养及鉴定

目的建立犬髂骨骨髓间充质干细胞分离、培养的方法,并对间充质干细胞进行鉴定。方法采用密度梯度分离和贴壁培养相结合的方法分离培养犬的骨髓间充质干细胞(MSCs),并诱导间充质干细胞向成骨细胞、成脂肪细胞方向分化。相差显微镜观察其形态学变化,组化染色测定其分化结果。结果原代培养4～5d,镜下见细胞呈梭形或多角形,有较多的突起,胞核明显呈卵圆形,可见1-3个核仁,胞质丰富。成骨方向诱导形成的矿化结节茜素红染色阳性,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色阳性;成脂方向诱导形成的脂肪细胞苏丹Ⅳ染色阳性。结论采用密度梯度分离和贴壁培养相结合的方法能够成功分离和培养犬的骨髓间充质干细胞。     

兔骨髓间充质干细胞的生物学特征及原代培养

背景：兔来源的骨髓间充质干细胞是具有较强的体外增殖和多系统分化潜能的成体干细胞,在组织工程及生物治疗领域蕴藏着巨大的潜能。 目的：体外培养扩增、鉴定兔骨髓间充质干细胞,观察骨髓间充质干细胞的生物学特征。 方法：无菌条件下抽取兔骨髓,分别运用全骨髓贴壁法和Percoll密度梯度离心法体外分离骨髓间充质干细胞,利用差速贴壁原理对细胞进行纯化扩增。在显微镜下观察细胞形态特征及生长规律,流式细胞技术检测细胞表面抗原标记物的表达。 结果与结论：兔骨髓间充质干细胞贴壁时间短,增殖快,经过细胞传代后能够获得进一步纯化的细胞,杂质细胞减少。原代细胞形态即呈现三角形、长梭形、纺锤形的贴壁细胞特征。第 5代骨髓间充质干细胞呈典型的极性漩涡状生长,形态单一均匀,不具有表达造血前体细胞表面标志抗原CD34和白细胞表面标志抗原CD45的表面标记物功能,但是具有能够表达出整合素家族的成员 CD29 及黏附分子CD44的特点。说明经全骨髓贴壁法和Percoll密度梯度离心法体体外分离培养的细胞在形态学、细胞表面标志物表达和多向分化能力方面具有干细胞生物学特性,经流式细胞分析鉴定为兔骨髓间充质干细胞。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

Ficoll密度梯度离心法分离培养纯化猪的骨髓间充质干细胞

背景:研究报道显示猪骨髓间充质干细胞体外分离方法、效率、培养条件各不相同,并且尚无统一的鉴定标准。目的:建立一种高效、经济的猪骨髓间充质干细胞分离培养及鉴定方法。方法:采集健康猪股骨骨髓,Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞,进行原代和传代培养,流式细胞仪检测细胞膜表面抗原表达情况,并观察细胞成骨、成脂及成软骨分化的能力。结果与结论:分离培养的单个核细胞活力旺盛,体外生长良好,细胞呈梭形、纺锤形和小多角形,具有稳定的增殖分裂能力;细胞膜表面抗原CD29、CD44、CD90呈阳性表达,而CD14、CD34、CD45、CD166、HLA-DR呈阴性表达;在特定诱导条件下,该细胞可分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞。说明采用Ficoll密度梯度离心法成功分离培养出纯化的猪骨髓间充质干细胞,其生长状态良好,具有多项分化潜能,可作为组织工程的种子细胞。     

犬骨髓间充质干细胞定向分化为内皮细胞的研究

应用密度梯度离心法分离狗骨髓间充质干细胞,建立诱导分化内皮细胞的方法及条件。密度梯度离心法分离狗骨髓间充质干细胞后,在体外经血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、内皮细胞生长因子(Endothelial growth factor,EGF)等诱导后,分化形成内皮样细胞。结果表明:光镜下细胞单层融合生长,呈铺路石样形态,单个核位于中央。电镜下可见到Weibel-Palade小体,在细胞胞浆vWF染色阳性。骨髓间质干细胞,在体外可诱导分化成内皮细胞。     

体外培养人骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化及表皮细胞角蛋白的表达

背景：动物实验已经证实骨髓间充质干细胞体外诱导可分化为表皮细胞。 目的：观察体外培养条件下人骨髓间充质干细胞向表皮细胞的分化及表皮细胞角蛋白表达。   方法：采用Ficoll-Paque密度梯度离心法提取人胚胎骨髓间充质干细胞,以免疫细胞化学及流式细胞仪测定细胞表面CD33、CD34标记物进行鉴定。取第3代骨髓间充质干细胞以30%条件培养基诱导其向表皮细胞分化,免疫细胞化学染色观察诱导后细胞形态与细胞角蛋白水平变化。 结果与结论：采用密度梯度离心法从人胚胎骨髓中分离培养得到细胞成分均一的骨髓间充质干细胞。骨髓间充质干细胞经体外诱导后,出现细胞角蛋白19表达阳性细胞,说明骨髓间充质干细胞在体外诱导后可能发生向表皮细胞分化。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养与CM-DiI荧光标记

背景：目前,对骨髓间充质干细胞的分离、纯化和扩增还没有统一的、标准化的方法。CM-DiI作为荧光标记物稳定、可靠、标记率高、标记简便。 目的：建立SD大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养及标记的方法。 方法：取2只体质量50-100 g雄性SD大鼠,无菌条件下采集双侧股骨、胫骨骨髓,用全骨髓贴壁分离法和密度梯度离心法培养出原代骨髓间充质干细胞,通过及时、反复传代对细胞进行扩增纯化,在体外用荧光活性染料CM-DiI标记第3代骨髓间充质干细胞后作为供体细胞来源。 结果与结论：用全骨髓贴壁分离法和密度梯度离心法两种方法均能成功体外分离培养骨髓间充质干细胞,经流式细胞仪分析,培养出的细胞CD34阳性率为17.5%,CD44阳性率为97.9%、CD90阳性率为91%,与骨髓间充质干细胞表面抗原一致。但培养出的细胞数量全骨髓贴壁分离法明显多于密度梯度离心法,两种方法培养骨髓间充质干细胞的细胞活力和增殖能力无明显差异。CM-DiI能够成功荧光标记骨髓间充质干细胞,CM-DiI作为荧光标记物稳定、可靠、标记率高、标记简便。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

全骨髓贴壁并差速传代分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞:与密度梯度离心法的比较

背景:目前国内外分离纯化骨髓间充质干细胞有两种主要方法:密度梯度离心法及全骨髓贴壁法,前者步骤较复杂,后者简单易操作,但纯化效果不理想。目的:在全骨髓贴壁分离骨髓间充质干细胞基础上,并用差速传代消化法,建立大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养纯化方法。方法:全骨髓贴壁培养法分离并差速消化传代大鼠骨髓间充质干细胞,利用间充质干细胞在消化传代过程中较其他骨髓细胞消化悬浮速度快,以及贴壁快的特点,代替密度梯度离心操作来分离纯化间充质干细胞,对其形态学特征进行观察,并与密度梯度离心法比较两种分离培养法的细胞生长增殖情况;观察碱性磷酸酶及油红染色情况,验证骨髓间充质干细胞的分化能力;检测细胞表面标记物,验证免疫特性及检测其纯度。结果与结论:全骨髓贴壁培养法分离并差速传代大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞鉴定、成骨成脂肪培养结果显示其细胞免疫特性、纯度、分化能力与密度梯度离心法无显著差异,但细胞活力,增殖能力有明显提高。     

Isolation,culture and osteogenic induction of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells

背景：骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能,且可大量体外扩增培养,是重要的组织工程种子细胞。但尚无统一的体外培养及定向诱导方法。 目的：探讨体外定向诱导兔骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞的可行性。 方法：应用密度梯度离心法从兔四肢骨中分离纯化间充质干细胞,应用密度为1.073 g/mL的Percoll分离液,3 000 r/min×30 min离心,区别于相关报道的Ficoll分离液,2 000-2 500 r/min×(20-30) min离心以及全骨髓培养法体外扩增至第3代,分别在普通培养基(对照组)和成骨诱导培养基(实验组)中培养。 结果与结论：成功获得大量高纯度骨髓间充质干细胞。经成骨诱导后,实验组骨钙素含量明显高于对照组(P < 0.05)。实验组碱性磷酸酶和钙结节染色阳性,对照组均阴性。结果表明使用密度梯度离心法可成功建立兔骨髓间充质干细胞的分离培养体系,骨髓间充质干细胞可定向诱导为成骨细胞。     

人骨髓间充质干细胞和汗腺细胞的体外分离与培养*

背景：体外研究人骨髓间充质干细胞和汗腺细胞的分离培养与鉴定,可为探讨骨髓间充质干细胞再生汗腺的可行性打下基础。 目的：探寻在体外分离培养骨髓间充质干细胞和汗腺细胞的有效方法。 方法：采用直接贴壁法从成人骨髓中体外分离培养骨髓间充质干细胞,并进行扩增和鉴定。采用胶原酶消化法从人全层无烧伤皮肤中分离汗腺细胞,并进行扩增和鉴定。 结果与结论：倒置显微镜下见分离培养的骨髓间充质干细胞呈梭形,折光性强,免疫细胞化学染色显示细胞表达CD29、CD105,高表达CD44,不表达造血干细胞表面标志CD34和CD45。汗腺细胞呈扁平多角形,表达汗腺细胞表面标志细胞角蛋白7,8,18,19和癌胚抗原。说明直接贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞和胶原酶消化法分离培养汗腺细胞是可行的。     

两种不同分离方法对羊骨髓间充质干细胞生物活性的影响

背景：近几年关于鼠、兔等小型动物骨髓间充质干细胞的研究较多,如何获得大型动物羊的骨髓间充质干细胞的报道还较少。 目的：观察全骨髓培养法和密度梯度离心法对羊的骨髓间充质干细胞生物活性的影响。 方法：取健康2月龄的阿勒泰大尾羊,麻醉后于髂后上棘穿刺抽取骨髓,分别采用全骨髓培养法和密度梯度离心法提取羊骨髓间充质干细胞,倒置荧光显微镜观察原代骨髓间充质干细胞的细胞形态及贴壁情况,记录两组细胞首次传代时间,流式细胞仪检测CD44抗原表达,MTT法测定细胞的生长曲线,Von Kossa’s染色检测成骨诱导的分化潜能。 结果与结论：两种分离方法均能得到较均一的梭形,三角形和多边形的BMSCs,胞核大胞浆丰富,CD44抗原表达阳性。全骨髓培养法较密度梯度离心法的细胞数量较多,传代时间略早。骨髓间充质干细胞诱导培养至第14~21天,两组的Von Kossa染色均阳性。其中首次传代全骨髓贴壁法的传代细胞较密度梯度离心法的细胞贴壁较快,活力较好。提示全骨髓培养法是一种简单有效的提取方法。     

猪小肠黏膜下层与兔骨髓间充质干细胞的体外复合培养

背景：小肠黏膜下层细胞外基质材料免疫原性低,具有良好生物相容性,是构建单一结构工程化组织的较好支架材料。 目的：观察体外兔骨髓间充质干细胞与猪小肠黏膜下层复合培养的生物相容性。 方法：采用密度梯度离心法结合贴壁法分离纯化培养兔骨髓间充质干细胞,在其接种前用红色免疫荧光标记,然后将第2代已标记的兔骨髓间充质干细胞接种在猪小肠黏膜下层上。 结果与结论：①组织学观察：骨髓间充质干细胞与小肠黏膜下层上复合培养1周时细胞呈单层生长,荧光显微镜下观察标记的骨髓间充质干细胞显示均匀红色荧光,复合培养2周细胞呈多层生长,并显示更密集的红色荧光。②扫描电镜观察：复合培养2 d,骨髓间充质干细胞黏附于材料表面并伸展;复合培养1周,小肠黏膜下层被骨髓间充质干细胞分泌的胶原覆盖;2周后细胞在材料上已大量增殖形成融合,细胞连接紧密,细胞分泌大量基质,并分层。表明小肠黏膜下层与骨髓间充质干细胞具有良好的相容性。     

犬骨髓间充质干细胞分离纯化和成骨诱导分化:Ficoll液密度梯度离心法体外分离的可行性

背景:目前骨髓间充质干细胞较经典的分离方法是Percoll密度梯度离心法,以去除血细胞成分,但该法操作较为复杂,分离犬骨髓时需要配制密度,且离心次数较多,对细胞损伤大。目的:拟建立可靠、高纯度的犬骨髓间充质干细胞体外分离纯化方法,并观察其在体外扩增、成骨诱导分化的能力。方法:于犬髂后上棘抽取骨髓液10mL,肝素抗凝,Hanks液稀释后,加入1.077g/mL Ficoll液3mL,2000r/min离心20min,吸取有核细胞形成白色云雾状的分层界面,用含胎牛血清的DMEM离心2遍,按12×104/cm2密度接种,于37℃、体积分数为5%的CO2培养箱内培养。细胞传代后,加入含地塞米松、β-磷酸甘油钠、L-2-磷酸抗坏血酸的DMEM成骨条件培养液进行诱导。免疫细胞化学染色和免疫荧光染色检测成骨细胞特征性分泌蛋白骨钙素、骨桥蛋白的表达,以及Ⅰ型胶原的表达,并进行碱性磷酸酶染色与茜素红染色。结果与结论:1.077g/mLFicoll液密度梯度离心法分离所得的有核细胞层相对于Percoll液分层明显,可获得纯度较高的骨髓间充质干细胞,接种细胞生长良好,平均倍增时间为24h。犬骨髓间充质干细胞体外成骨诱导培养后,骨钙素、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原均呈阳性表达,碱性磷酸酶染色后细胞胞浆呈蓝绿色,茜素红染色后细胞外基质中出现散在的红色结节,可在体外定向分化为成骨细胞。     

全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及其生物学特性

背景：培养出生长状态良好、数量足够多的大鼠骨髓间充质干细胞是其作为种子细胞在组织工程等领域广泛应用的重要前提。 目的：寻求快捷有效的大鼠骨髓间充质干细胞体外培养条件,观察培养的间充质干细胞生物学特性。 方法：全骨髓法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,贴壁筛选法进行纯化,倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长特征,免疫荧光分析细胞骨架,MTT法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测其表面标记。 结果与结论：分离培养的细胞呈长梭形或多边形;细胞生长曲线呈S形;微丝免疫荧光染色结果显示,培养的骨髓间充质干细胞具有良好的细胞骨架系统。第3代骨髓间充质干细胞CD29、CD44、CD71、CD90均呈阳性表达,而CD13、CD34、CD45、CD133呈阴性。提示,经全骨髓贴壁法体外分离培养的细胞在形态学和细胞表面标志物表达方面具有干细胞生物学特性,经鉴定为骨髓间充质干细胞,其第3代活性最佳,可用于后续实验。     

骨髓间充质干细胞增殖及分化过程中Notch信号的表达变化

 目的　研究Notch信号系统对骨髓间充质干细胞的增殖与分化的调控作用。方法　用密度梯度离心法分离培养犬骨髓间充质干细胞,观察其增殖及传代情况,并进行成骨、成软骨及成心肌细胞诱导,Western blot检测细胞增殖及分化过程中Notch信号蛋白的表达。结果　骨髓间充质干细胞呈梭形、旋涡样生长,增殖及传代能力强,可在体外形成钙结节,分化为软骨细胞,免疫组化示心肌细胞标志物的表达。Western blot示在增殖过程中可见Notch信号蛋白的表达,为1.0±0.13,当分化为骨细胞及心肌细胞时,其表达上调,分别为1.2±0.14及 1.7±0.17,与增殖的干细胞相比,有明显差异(*P <0.05)。结论　Notch信号系统对骨髓间充质干细胞的增殖及分化起重要的调控作用。     

骨髓间充质干细胞体外增殖及分化过程中Notch信号的表达变化

目的研究Notch信号系统对骨髓间充质干细胞的增殖与分化的调控作用。方法用密度梯度离心法分离培养犬骨髓间充质干细胞,观察其增殖及传代情况,并进行成骨、成软骨及成心肌细胞诱导,Western blot检测细胞增殖及分化过程中Notch信号蛋白的表达。结果骨髓间充质干细胞呈梭形、旋涡样生长,增殖及传代能力强,可在体外形成钙结节,分化为软骨细胞,免疫组化示心肌细胞标志物的表达。Western blot显示在增殖过程中可见Notch信号蛋白的表达,为1.00±0.13,当分化为骨细胞及心肌细胞时,其表达上调,分别为1.20±0.14及1.70±0.17,与增殖的干细胞相比有明显差异(P<0.05)。结论 Notch信号系统对骨髓间充质干细胞的增殖及分化起重要的调控作用。     

人脐血间充质干细胞向类肝细胞分化 人肝细胞共培养诱导法的可行性?

背景:研究表明共培养条件下,骨髓间充质干细胞可向心肌细胞、肝样细胞等方向分化。目的:探讨人脐血间充质干细胞与人肝细胞在体外共培养条件下,诱导人脐血间充质干细胞分化为类肝细胞的可行性。方法:无菌条件下采集新生儿脐带血,采用密度梯度离心法与贴壁法分离纯化脐血间充质干细胞,待细胞融合至80%时胰蛋白酶消化传代。应用具有微孔滤膜的插入式细胞培养皿和培养板构建人脐血间充质干细胞-肝细胞共培养模型,脐血间充质干细胞按1×107L-1密度接种于下层6孔板内,LO2人肝细胞按1×105L-1密度接种到上层插入式培养皿中。以上、下两层均接种人脐血间充质干细胞作为对照组。采用流式细胞仪检测贴壁细胞的表面标志,倒置相差显微镜观察共培养后细胞形态变化,RT-PCR法检测肝细胞表面抗原mRNA的表达。结果与结论:贴壁细胞呈长梭形,强表达CD44和CD29,不表达造血细胞表型CD34和CD45。共培养组5d时长梭形细胞数量减少,随共培养时间的延长,不规则圆形或多角形的细胞逐渐增多,与肝细胞形态相似;对照组培养4周时,人脐血间充质干细胞仍呈形态均一的长梭形。共培养组5d时甲胎蛋白mRNA呈阳性表达,其余均为阴性;14d时细胞角蛋白19mRNA、白蛋白mRNA开始表达,随着时间延长有增强趋势,甲胎蛋白mRNA表达则较前减弱;对照组各抗原的表达均呈阴性。提示与LO2人肝细胞共培养后,人脐血间充质干细胞可诱导分化为类肝细胞。     

豚鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及成骨诱导

背景：利用骨髓间充质干细胞的取材灵活性及快捷性,对已掌握的培养技术及成骨诱导进一步探索性研究。 目的：通过建立豚鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养法,探讨豚鼠骨髓间充质干细胞表型特征以及多项分化潜能。 方法：利用贴壁培养法分离纯化豚鼠骨髓间充质干细胞,传代扩增,流式细胞分析检测细胞表面分子CD29、CD44、CD45的表达。分别采用成骨诱导培养液和成脂诱导培养液定向诱导骨髓间充质干细胞向脂肪细胞、成骨细胞分化。 结果与结论：原代分离的骨髓间充质干细胞在接种后96 h贴壁,细胞形态为椭圆形,多角形及短梭形,8 d时细胞呈长梭形并达到90%单层融合。经传代扩增,细胞进一步纯化,细胞形态为均一的长梭形并呈漩涡状排列,而且生长速率加快。流式细胞检测 CD29、CD44阳性率分别为95.7%和65.7%。不同诱导剂定向诱导后,经油红O、茜素红S、碱性磷酸酶染色、免疫组织化学Ι型胶原酶鉴定,P3代骨髓间充质干细胞分别向脂肪细胞及成骨细胞分化。结果表明,通过贴壁筛选方法,体外分离培养的豚鼠骨髓间充质干细胞具有很强的增殖能力,并保持稳定的表型特征及多向分化潜能。     

密度梯度离心法体外培养骨髓间充质干细胞的分化能力

背景：骨髓间充质干细胞具有多向分化能力,是目前极具潜力的种子细胞及基因治疗的靶细胞。 目的：体外培养兔骨髓来源间充质干细胞,了解其生物学特性。 方法：采用密度梯度离心法培养兔骨髓间充质干细胞,对细胞的形态及生长特性进行观察,应用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD29、CD34、CD44、CD45、CD166、HLA-DR表达,并进行相关生物学特性鉴定。 结果与结论：密度梯度离心法能分离培养出纯度较高的骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表达CD29、CD44、CD166,不表达CD34、CD45、HLA-DR。在适当的条件下能够诱导分化成为成骨细胞、软骨细胞等。     

成人骨髓间充质干细胞体外培养、鉴定与成骨诱导

背景：骨髓间充质干细胞具有自我增殖和多向分化潜能,然而间充质干细胞在骨髓中含量极少,体外纯化、扩增与成骨诱导是进行骨组织工程研究的关键。 目的：拟建立一套简便可靠的成人骨髓间充质干细胞体外培养及鉴定体系,并定向诱导其向成骨细胞分化。 方法：抽取髂前上棘处骨髓,采用密度梯度离心法与贴壁筛选法相结合,对骨髓间充质干细胞分离、纯化、培养并扩增。将地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素Ｃ配制成骨诱导液,将细胞分为成骨诱导组和空白对照组进行观察。 结果与结论：成人骨髓间充质干细胞呈典型的长梭形、纺锤状。8-11 d细胞进入快速增殖期,生长曲线呈S型,CD44、CD90均呈阳性表达,而CD34、CD45呈阴性表达。碱性磷酸酶活性随培养时间而增高,并在第12天达到高峰,成骨诱导组各时间点碱性磷酸酶活性均高于空白对照组。说明实验建立的成人骨髓间充质干细胞体外培养、鉴定及诱导成骨细胞分化体系可以获得纯度较高、成骨分化能力较好的间充质干细胞。