微小RNA-146a影响血管平滑肌细胞增殖和凋亡的机制*☆◆

背景：微小RNA-146a通过负调控核因子κB信号通路介导免疫细胞和肿瘤细胞的增殖,但是否参与血管平滑肌细胞的增殖或凋亡未见研究报道。 目的：观察微小RNA-146a对血管平滑肌细胞增殖、凋亡的影响及其相关机制。  方法：采用脂质体2000将50 nmol/L微小RNA-146a反义寡核苷酸转染至大鼠血管平滑肌细胞,以转染错义链及PBS的细胞作为对照。  结果与结论：微小RNA-146a反义寡核苷酸转染48 h后,血管平滑肌细胞增殖减少(P < 0.01)、凋亡增多(P < 0.05),细胞的微小RNA-146a水平明显降低(P < 0.01),核因子κBp65、增殖细胞核抗原蛋白表达明显降低(P < 0.05)。说明微小RNA-146a可以促进血管平滑肌细胞的增殖,抑制凋亡,其机制与增加核因子κBp65表达有关。关键词：微小RNA-146a;血管平滑肌细胞;核因子κB;转染;增殖;凋亡 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.20.024     

BTEB2反义基因转染抑制血管平滑肌细胞增殖及其机制

目的：研究基本转录元件结合蛋白2（BTEB2）反义RNA对血管平滑肌细胞（VSMC）增殖的影响及其机制。 方法: 用BTEB2反义腺病毒载体Ad.ASBTEB2转染VSMC，通过RT-PCR检测BTEB2反义RNA在VSMC中的表达；经免疫印迹法检测BTEB2蛋白质表达；通过MTT比色法和流式细胞仪分别检测VSMC增殖及细胞周期；用免疫细胞化学方法分析增殖细胞核抗原（PCNA）、血管紧张素Ⅱ1型受体（AT1R）和血小板源性生长因子B链（PDGF-BB）在VSMC中的表达情况。 结果: VSMC被Ad.ASBTEB2转染后，可检测到BTEB2反义RNA的表达; Ad.ASBTEB2转染可显著抑制VSMC的BTEB2蛋白表达及血清诱导的VSMC增殖，使VSMC出现明显的G0/G1期阻滞；Ad.ASBTEB2转染可显著抑制AngⅡ诱导的PCNA、AT1R和PDGF-BB表达。 结论: BTEB2反义RNA可显著抑制VSMC增殖; 这种抑制作用可能是通过抑制VSMC增殖相关基因AT1R、PDGF-BB和PCNA等的表达而实现的。     

大豆异黄酮对大鼠血管平滑肌细胞增殖和表型转化的影响

目的:观察大豆异黄酮对大鼠血管平滑肌细胞增殖和表型转化的影响。方法:采用酶消化法原代培养大鼠血管平滑肌细胞,传至第3～6代,加入含不同浓度(0、0.1、0.2、0.4、0.8μmol/L)大豆异黄酮的DMEM培养基作用24 h,采用MTT法检测大鼠血管平滑肌细胞增殖率,采用RT-PCR法检测平滑肌22α(SM22α)mRNA、骨桥蛋白mRNA的表达,采用Western blot法检测SM22α、骨桥蛋白的表达。结果:0.1～0.8μmol/L的大豆异黄酮随浓度增加其抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖的作用增强(P<0.05);SM22αmRNA及SM22α蛋白表达增加,骨桥蛋白mRNA及骨桥蛋白表达降低,各组间有明显差异(P<0.05)。结论:大豆异黄酮抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖,同时使大鼠血管平滑肌细胞从合成表型向收缩表型转化。     

c-jun反义核酸对自体移植静脉内膜增生和ET-1水平的影响

目的 :观察反义c - jun核酸对自体移植静脉内膜增生及血管活性因子内皮素 - 1(ET - 1)的影响。方法 :选择 6 0只SD大鼠 ,等分为实验组和对照组 ,均行自体颈外静脉、腹主动脉移植手术 ,实验组移植静脉周围和血管吻合口周围应用反义c- jun核酸凝胶涂布 ;对照组仅行凝胶涂布。于手术时取静脉血 1ml,放射免疫分析检测血浆ET - 1的水平。术后 2周取出移植血管 ,分别行病理学、免疫组织化学检测移植血管内膜厚度 ,内膜平滑肌细胞数及增殖细胞核抗原和脱氧核糖核酸反映血管平滑肌细胞增殖情况的指标的表达情况。同时在另一侧颈外静脉取静脉血 1ml,仍采用放射免疫分析检测血浆ET - 1水平。结果 :移植静脉术后动脉化 ,管壁增存 ,血浆ET - 1水平升高 ,但转染c - jun反义核酸组移植血管内膜厚度及VSMC增殖均较对照组减少 ,PCNA和DNA阳性表达情况亦较对照组明显减少 ,血浆ET - 1水平升高幅度低于对照组。结论 :反义c - jun核酸可抑制VSMC分裂而减少VSMC的增殖 ,降低促进血管收缩和细胞增殖的ET - 1的表达 ,从而有效地抑制移植静脉内膜的过度增生。     

转染PDGF-B反义核酸和tPA基因预防狗冠脉搭桥术吻合口再狭窄

目的： 探讨联合应用组织型纤溶酶原激活物（tPA）基因质粒和血小板源性生长因子（PDGF-B）反义核酸预防冠状动脉搭桥术后吻合口再狭窄。方法： 建立狗冠状动脉搭桥术吻合口再狭窄模型，构建tPA基因质粒并设计合成（PDGF-B）反义寡核苷酸，在冠状动脉搭桥术同时以超声波辅助转染心肌细胞和吻合口血管平滑肌细胞，采用常规病理、免疫组织化学、原位杂交以及形态测量方法观察对吻合口局部血栓形成、血管内膜细胞增殖细胞核抗原（PCNA）和PDGF-B mRNA表达以及内膜增生的影响。结果： 成功转染tPA基因和（PDGF-B）反义核酸；2种基因联合应用显著抑制血管内膜细胞表达PCNA和PDGF-B mRNA，抑制率分别为65.01%和81.75%；显著减少局部血管内膜厚度、内膜面积和吻合口血栓形成，使吻合口狭窄率显著减少62.63%。结论： 联合转染tPA表达质粒和PDGF-B的反义寡核苷酸在一定程度上抑制猪实验性冠状动脉搭桥术后吻合口再狭窄。     

睾酮抑制氧化型低密度脂蛋白诱导的血管平滑肌细胞表型转化和增殖

目的研究睾酮对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)表型转化和增殖的抑制作用,并探讨其可能机制。方法培养大鼠VSMC,利用血清饥饿法进行同步化处理。将细胞分为对照组:不进行任何处理;ox-LDL组:给予50μg/m L ox-LDL处理;睾酮组:分别加入5×10-8mol/L和5×10-7mol/L睾酮预处理12 h,然后与50μg/m L ox-LDL共培养;另外设置血清组,用含100 m L/L胎牛血清的培养基培养。水溶性四甲基偶氮唑盐(WST-1)法检测各组细胞增殖的变化;流式细胞术检测各组细胞周期的变化;Western blot法检测各组细胞线粒体融合素2(Mfn2)、磷酸化的细胞外信号调节激酶1/2(p-ERK1/2)、增殖细胞核抗原(PCNA)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及骨桥蛋白(OPN)表达的变化。结果与对照组比较,ox-LDL组细胞增殖能力增强,G0/G1期细胞比例降低,S期细胞比例增加,Mfn2表达降低,p-ERK1/2表达增加,PCNA表达增加,α-SMA表达降低,OPN表达增加。与ox-LDL组比较,不同浓度睾酮组细胞增殖受抑制,G0/G1期细胞比例增加,S期细胞比例降低,Mfn2表达增加,p-ERK1/2表达降低,PCNA表达降低,α-SMA表达增加,OPN表达降低,以上作用呈现一定的浓度依赖性。结论睾酮可抑制ox-LDL诱导的大鼠VSMC发生表型转化及增殖,可能与其上调Mfn2抑制ERK1/2信号通路有关。     

ShRNA表达载体干涉Cyclin D1分子抑制骨肉瘤细胞系SOSP-9607的增殖

目的:探讨Cyclin D1 shRNA(short hairpin RNA)对骨肉瘤细胞系SOSP-9607增殖和凋亡的影响.方法:利用Cyclin D1 shRNA表达载体,稳定转染骨肉瘤细胞系SOSP-9607,分别采用RT-PCR和Western blot分别从mRNA水平和蛋白水平上检测Cyclin D1的变化;流式细胞术检测骨肉瘤细胞Cyclin D1周期和凋亡率的变化;CCK-8检测干涉Cyclin D1对骨肉瘤细胞增殖的影响.结果:稳定转染Cyclin D1 shRNA载体后骨肉瘤细胞的Cyclin D1 mRNA和蛋白的表达均被明显抑制.与对照组相比,骨肉瘤细胞增殖被显著抑制(P<0.05).同时,细胞发生G0/1期阻滞,G1/S期比例增加(P<0.01).结论:Cyclin D1 shRNA载体可下调目的基因的表达,有效的抑制骨肉瘤细胞SOSP-9607的增殖,发生G1/S期阻滞.     

联合转染p21基因和反义c-fos核酸对兔自体移植静脉内膜增生的影响

目的：探讨联合转染p21基因和反义c-fos核酸对兔自体移植静脉内膜增生的影响，探索一种理想的血管再狭窄的疗法。方法：选择20只新西兰家兔，实验组、对照组各10只，均行自体颈外静脉、颈总动脉移植手术，实验组行腺病毒介导的p21 cDNA溶液浸泡和反义c-fos寡聚核苷酸凝胶涂布；对照组仅行空载腺病毒溶液浸泡和凝胶涂布。术后2周取出移植血管，分别行病理学、免疫组织化学检测移植血管内膜厚度（IT）、内膜平滑肌细胞（VSMC）数及PCNA阳性表达情况。结果：实验组移植血管IT、管腔狭窄度及VSMC数均较对照组减少，增殖细胞核抗原（PCNA）阳性表达情况亦较对照组明显减少。结论：联合转染p21基因和反义c-fos核酸可有效地抑制移植静脉内膜的增生。     

超声波辅助转染PDGF-B mRNA的反义寡肽核酸抑制兔动脉再狭窄

目的：探讨反义寡肽核酸在体内对血管平滑肌细胞增殖和再狭窄的影响。方法：建立兔髂动脉再狭窄模型，用合成的反义寡PNA作为药物以超声波辅助转导局部血管壁细胞，分别用原位分子杂交和LSAB免疫组织化学法检测PDGF-B mRNA和PCNA表达；用形态测量法检测血管内膜厚度和面积。结果： PNA显著抑制损伤后1周内膜VSMCs表达PCNA和PDGF-B mRNA，与对照组相比抑制率分别为84.19%和63.95%；显著减少血管内膜厚度和面积。 结论：反义寡PNA可阻止兔VSMCs增殖及内膜增生。     

大黄素对人血管平滑肌细胞增殖的影响

目的 观察大黄素对人血管平滑肌细胞周期时相和cyclin D1表达的影响,探讨大黄素抑制平滑肌细胞增殖的作用机制。方法 取对数增长期的平滑肌细胞同步于G0期,药物组:加入含37.5mg·L-1大黄素10％胎牛血清的培养液,对照组:仅加入10％胎牛血清的培养液;作用12、24、36、48 h后分别用流式细胞仪和Westemblot法进行细胞周期时相和cyclin D1表达的测定。结果 与对照组比较,药物组在各相同时间点C0/G1期细胞百分比升高,S期细胞百分比下降,且随着时间的延长差值增大,cyclin D1表达高峰延迟,表达量下调,细胞周期受阻于G0/G1期。结论 大黄素在抑制平滑肌细胞增殖的过程中通过下调,cyclin D1表达,从而阻滞细胞周期进程。     

转录调节因子Ets-1在大鼠血管平滑肌细胞增殖与凋亡中的作用

目的： 研究转录调节因子Ets-1对大鼠血管平滑肌细胞增殖与凋亡的影响及其可能的机制。 方法： 用定量细胞DNA片段的方法观察大鼠血管平滑肌细胞增殖与凋亡。用Western印迹法检测磷酸化视网膜母细胞瘤（RB-P）蛋白表达。 结果： Ets-1抑制大鼠血管平滑肌细胞凋亡。反义P21WAF1/CIP1能够阻断Ets-1的抗凋亡作用，并抑制Ets-1诱导的平滑肌细胞增殖。Ets-1能够上调RB-P蛋白表达，反义P21WAF1/CIP1可以阻断Ets-1诱导的RB-P蛋白表达。 结论： 在大鼠血管平滑肌细胞中，Ets-1通过P21WAF1/CIP1旁路发挥抑制凋亡和促进增殖作用。     

增殖细胞核抗原短发夹状RNA对人骨肉瘤细胞生长的影响

目的构建增殖细胞核抗原(PCNA)短发夹状RNA表达载体,检测其对人骨肉瘤细胞PCNA表达、细胞增殖及细胞凋亡的影响。方法体外构建PCNAshRNA表达载体pSilence2.1neo-PCNA,转染人骨肉瘤细胞系MG63,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测转染前后PCNAmRNA表达,免疫组织化学(SP)法检测转染前后PCNA蛋白的表达,四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法及克隆形成试验检测细胞增殖活性,3H胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)细胞掺入试验检测细胞DNA合成,流式细胞仪检测细胞周期分布,吖啶橙染色法检测细胞凋亡情况。结果pSilence2.1neo-PCNA载体转染能显著抑制PCNAmRNA及蛋白的表达,转染后mRNA表达抑制率为80.51%、增殖指数值为空白组的25.68%。转染组48h细胞增殖抑制率为61.78%,转染组3H-TdR掺入率明显低于空白组(P<0.01)。细胞周期分析显示,siRNA转染组G0G1期细胞含量显著增加,而S期细胞含量显著减低。转染组凋亡率为16.54%。结论pSilence2.1neo-PCNA可显著抑制MG63细胞PCNA的表达及细胞增殖活性,促进细胞凋亡。     

β1,4-半乳糖基转移酶-Ⅰ对施万细胞增殖的影响

目的 探讨周围神经施万细胞表达β1，4-半乳糖基转移酶-Ⅰ(β-1，4-GalT-Ⅰ)对其增殖的影响。方法 将构建的正、反义β-1，4-GalT-Ⅰ表达质粒，转染到施万细胞中，分析转染细胞倍增时间、^3H-TdR掺人情况以及细胞周期变化。结果 转染正义β-1，4-GalT-Ⅰ后施万细胞的增殖受到抑制，这种作用随转染浓度增大而增强；在G1／G0期的细胞数目增加，S期的数目减少。而转染反义β-1，4-GalT-Ⅰ有相反的作用。结论 β-1，4-GalT-Ⅰ对施万细胞的增殖有抑制作用，可能在周围神经施万细胞的增殖调节中发挥重要作用。     

MiR-382促进大鼠正常肝细胞BRL-3A增殖

目的 探讨miR-382对大鼠正常肝细胞BRL-3A增殖和凋亡的影响。方法 BRL-3A细胞瞬时转染miR-382的模拟物和抑制物48 h, MTT法测定细胞活性;流式细胞术检测细胞周期;Real-time PCR检测细胞增殖和凋亡相关基因的表达情况。结果在 大鼠BRL-3A细胞中,转染模拟物可以显著增加miR-382的表达,转染抑制物可以显著降低miR-382的表达(P＜0.01)。MTT检测表明,miR-382过表达后,BRL-3A细胞活性明显提高;流式细胞术检测表明,miR-382过表达组S期的细胞数明显增加,而miR-382干涉组S期的细胞数明显减少;用Real-time PCR检测细胞增殖/凋亡相关基因mRNA表达水平表明,miR-382过表达后,BRL-3A细胞增殖相关基因增殖细胞核抗原（PCNA)、Bcl-2和Ccnd1的mRNA表达水平上调,细胞凋亡相关基因Caspase-3和Bax的mRNA表达水平下调,而miR-382干涉组与上述结果相反。结论 miR-382通过促进细胞增殖相关基因表达,抑制细胞凋亡相关基因表达而促进大鼠正常肝细胞BRL-3A增殖。     

脱氧核酶抑制人脐动脉平滑肌细胞增殖

目的：观察增殖细胞核抗原（PCNA）基因特异性的10-23脱氧核酶（DNAzyme）对人脐动脉平滑肌细胞（HUASMC）增殖的影响。 方法： 设计合成针对PCNA基因起始密码AUG的DNAzyme，应用脂质体转染法将其转入体外培养的HUASMC。检测DNAzyme干预HUASMC 2 d后［3H］-TdR的掺入量；通过四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法分析HUASMC的增殖；采用流式细胞仪检测细胞周期。 结果： 1.0 μmol/L DNAzyme干预HUASMC 2 d后，［3H］-TdR的掺入量低于对照组（P<0.05）。1.0 μmol/L的DNAzyme和反义寡聚核苷酸（ASODN）组处理2、3和5 d后，MTT比色吸光度值低于对照组（均P<0.01）。DNAzyme对细胞增殖的抑制呈剂量依赖性。细胞干预2 d后，DNAzyme、ASODN和对照组的G0/G1期细胞的比率分别为73.8%、54.7%和41.1%。 结论： 针对PCNA的DNAzyme能有效抑制HUASMC的体外增殖。     

PIAS3敲低对前列腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的研究PIAS3敲低对人前列腺癌细胞系DU145细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响。方法构建PIAS3shRNA表达质粒pSilencer4.1/PIAS3,转染DU145细胞。MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪分析细胞周期和凋亡。结果测序证实PIAS3shRNA表达质粒构建成功。转染后DU145细胞PIAS3蛋白表达明显下调。MTT分析显示PIAS3敲低促进细胞增殖,并存在剂量-效应关系。流式细胞术分析显示:PIAS3敲低后S期细胞比例增加,G0/G1期细胞比例减少,凋亡细胞比例减少。结论PIAS3敲低促进体外前列腺癌细胞增殖,抑制其凋亡。     

黄芩苷抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖和新生内膜肥厚

目的 探讨黄芩苷对大鼠血管平滑肌细胞（VSMC）增殖和内皮损伤诱导的新生内膜形成的影响及其机制。方法 采用细胞培养、MTT分析、Western blot及免疫组织化学等方法研究黄芩苷的作用机制。结果 黄芩苷可呈浓度依赖性地抑制血小板源生长因子（PDGF）诱导的VSMC增殖,降低增殖细胞核抗原（PCNA）的表达,阻断PDGF受体的激活和MEK/ERK信号通路的活化。整体实验显示,黄芩苷可预防球囊损伤诱导的血管新生内膜肥厚,明显降低内膜/中膜面积（I/M）比值（P<0.01）;PCNA、细胞间黏附分子（ICAM-1）和血管黏附分子（VCAM-1）蛋白的表达也明显减少（P<0.01）。结论 黄芩苷通过抑制VSMC增殖而阻止球囊损伤诱导的大鼠血管内膜增生。     

硫代bFGF寡核苷酸抑制HepG2和Hep2细胞的增殖

目的探讨硫代修饰对bFGF寡核苷酸抑制HepG2和Hep2细胞增殖的影响。方法设计、合成bFGF寡核苷酸,聚乙烯亚胺(jetPEI)介导其转染入HepG2和Hep2细胞,荧光显微镜观察其在细胞中的定位,流式细胞仪分析转染效率,MTT法检测细胞增殖。结果bFGF反/正义硫代寡核苷酸被jetPEI介导高效转染入细胞内,主要位于细胞核。反/正义硫代寡核苷酸均呈剂量时间依赖地抑制细胞增殖,相同剂量时正硫代寡核苷酸的抑制效率高于反义硫代寡核苷酸。相应非修饰反义寡核苷酸较其互补正义链能更有效抑制两种细胞增殖。核苷酸突变明显降低反义硫代寡核苷酸对细胞抑制,并不影响正义硫代寡核苷酸的细胞抑制率。反义硫代寡核苷酸明显降低细胞中bFGF表达。结论硫代修饰bFGF反义寡核苷酸在细胞内特异性结合核酸以反义机制抑制肿瘤细胞增殖,正义寡核苷酸则因硫代修饰于细胞内以非核酸特异性机制抑制肿瘤细胞增殖。     

改变PTEN基因表达影响支气管平滑肌细胞增殖

目的:通过基因过表达和RNA干扰(RNAi)技术改变PTEN基因的表达并观察其对人支气管平滑肌细胞(BSMC)增殖和相关信号通路的影响。方法:利用携带野生型PTEN基因的重组腺病毒(Ad-GFP-PTEN)和针对PTEN基因的腺病毒短发夹状RNA(shRNA)载体(Ad-GFP-shRNA-PTEN),转染BSMC细胞,建立PTEN基因过表达细胞模型Ad-GFP-PTEN-BSMC和PTEN基因沉默细胞模型Ad-GFP-shPTEN-BSMC,并以感染Ad-GFP和空白组作为对照。通过荧光倒置显微镜检测转染效率;Westernblot法检测PTEN蛋白的表达和AKT、ERK1/2通路的活化情况;MTS/PMS法检测细胞生长的变化;PI单染流式细胞术检测细胞周期的变化。结果:腺病毒介导的过表达载体和shRNA载体都能有效改变PTEN基因的表达。PTEN基因表达上调后,BSMC细胞生长受到抑制,G0-G1期细胞增多,S期细胞和G2/M期细胞减少,PI3K/AKT通路受到抑制,而MAPK/ERK通路未见变化;PTEN基因表达下调后,BSMC细胞生长受到促进,S期细胞增多,G0-G1期细胞和G2/M期细胞减少,PI3K/AKT通路激活,但MAPK/ERK通路却受到抑制。结论:PTEN基因可能主要通过调节PI3K/AKT通路影响人支气管平滑肌细胞的生长。     

RNA干扰MAD2基因对细胞增殖的影响

目的:探讨MAD2对HepG2细胞周期的影响。方法:构建针对MAD2基因的shRNA表达载体,MAD2基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达质粒pmad2-EGFP共转染HepG2细胞株,用Western印迹法检测shRNA的抑制效应;用MTT法测定细胞增殖率;用流式细胞仪检测细胞周期。结果:shRNA的重组质粒表达载体能明显抑制MAD2绿色荧光融合蛋白的表达。HepG2细胞转染有效干扰质粒48h后,细胞增殖抑制率达65%。有效干扰质粒引起G0/G1期和S期细胞的明显降低,G2/M期细胞增多。结论:在细胞水平,可通过RNA干扰特异性抑制MAD2基因来抑制细胞的增殖,为研究MAD2基因在细胞增殖中的作用机制奠定基础。