胚胎大鼠脊髓神经干细胞的培养及鉴定

为了探讨胚胎大鼠脊髓神经管神经干细胞体外培养、鉴定的方法,本实验在解剖显微镜下机械性分离11.5 d的胚胎大鼠脊髓神经管,并制备细胞悬液,无血清培养基培养。应用免疫荧光染色方法对原代和传代细胞进行巢蛋白(nestin)鉴定;加入胎牛血清诱导其分化后分别行神经元特异烯醇化酶(NSE)、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和髓磷脂碱性蛋白(MBP)鉴定。结果显示:11.5 d胚胎大鼠脊髓神经管来源的神经干细胞经连续传代培养可形成较多克隆球,呈nestin免疫阳性;加入胎牛血清可诱导其分别向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化。本实验结果提示,利用E11.5的胚胎大鼠脊髓神经管可成功培养出大量稳定增殖并有多向分化潜能的神经干细胞,可用于进一步的研究。     

新生小鼠海马神经干细胞体外培养条件下的增殖与分化

背景：神经干细胞移植可用于中枢神经损伤的临床治疗。 目的：观察新生小鼠海马神经干细胞在体外培养条件下的增殖和分化。 方法：从新生昆明小鼠海马取材,采用机械分离法对原代细胞进行无血清培养,采用机械法复合酶消化法对原代细胞进行传代,以体积分数为10%胎牛血清诱导分化。免疫荧光行巢蛋白、β-微管蛋白Ⅲ和胶质纤维酸性蛋白染色,对培养的细胞进行鉴定。CCK-8法检测神经干细胞增殖能力。 结果与结论：从新生小鼠海马分离得到的细胞具有连续传代形成克隆球的能力,克隆球呈巢蛋白免疫反应阳性;加入胎牛血清可诱导分化为β-微管蛋白Ⅲ和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞。提示实验成功建立了体外培养新生小鼠海马组织分离和培养神经干细胞的方法,培养的神经干细胞在体外培养条件下保持着自我增殖和分化的潜能。     

提高成年大鼠神经干细胞单克隆形成率的方法

目的　探索提高神经干细胞单克隆形成率的方法并证实所分离培养的神经干细胞仍具有多分化潜能。　方法　对神经干细胞单克隆方法进行改良 ,即在单克隆培养液中加入 1 2原代克隆培养液。将所得到的单细胞克隆球消化、分离、增殖成大量的神经干细胞球 ,用含血清的DMEM分化培养液促其分化。 14d后 ,分别用神经元和胶质细胞的特异性标记物MAP 2标记神经元、GFAP标记星形胶质细胞和CNP标记少突胶质细胞。　结果平均每块含 1 2原代克隆培养液的 96孔培养板中有 2～ 3只孔可形成克隆球 ,而含纯新鲜培养液的培养板中仅 0 5～ 1 0只孔可形成克隆球。这些单细胞克隆球增殖后得到的大量亚细胞系克隆球分化后分别呈MAP 2、GFAP和CNP免疫荧光阳性。　结论　单细胞克隆实验中加入 1 2原代克隆培养液可提高神经干细胞的单克隆形成率 ,单克隆球增殖后得到的大量亚细胞系克隆球亦具有多分化潜能。     

人胎脑神经干细胞的体外培养

目的从人胎脑纹状体中分离培养并鉴定神经干细胞。方法采用包含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮细胞生长因子(EGF)的无血清培养和单细胞克隆技术,从36周自愿水囊引产人胎脑纹状体中分离出神经干细胞,并观察神经干细胞体外培养、传代、分化潜能。结果从36周人胎脑纹状体中成功分离出具有自我更新和多分化潜能的神经干细胞,在无血清培养时细胞呈悬浮状态生长,形成神经球,该细胞具有连续克隆能力,可传代培养,呈Nestin免疫反应阳性细胞;在含血清培养时诱导神经干细胞分化,分化后的细胞表达神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原。结论神经干细胞的存活和分裂有赖于EGF和bFGF的共同作用;36周人胎脑纹状体仍能培养出具有自我复制和分化潜能的神经干细胞。     

人胚脑神经干细胞的分离培养、克隆和分化

探讨从人胚脑分离培养的神经干细胞在增殖和分化方面的生物学特点。用无血清培养技术从 4月龄人胎中脑组织中分离培养出神经干细胞 ,用有限稀释法获得单细胞克隆球 ,消化后用含 Brd U的培养液培养 ,待形成神经干细胞球后 ,进行 Brd U和nestin免疫荧光检测。取第 4代神经干细胞球用含 10 % FBS的培养液诱导分化 ,3周后分别进行神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞特异性标记物 MAP-2、GFAP和 CNP免疫荧光检测。结果显示 ,单细胞悬液培养 2周后可形成神经干细胞球 ;神经球 Br-d U和 nestin免疫荧光检测均呈阳性 ;神经干细胞分化后呈 MAP-2、GFAP和 CNP阳性的三种类型细胞 ,但分化的神经元数量较少、胞体较小、突起较少。提示从人胚中脑组织中分离得到的神经干细胞具有增殖和自我更新能力 ,并具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的多分化潜能 ;与啮齿类动物相比 ,人神经干细胞增殖速度较慢 ,分化的神经元较少且稍欠成熟     

重组γ-神经胶质成熟因子诱导体外神经干细胞分化为星形胶质细胞

目的探索γ-神经胶质成熟因子(GMFG)能否促进大鼠神经干细胞增殖并分化成神经胶质细胞。方法无菌分离大鼠胚胎脑组织进行原代培养和传代培养,将第3代含有神经球的培养基制成细胞悬液,经Nestin免疫荧光染色检测呈阳性后,分4组培养,1组、2组每天分别加入5μg/L、10μg/L重组GMFG,3组加入10%胎牛血清(FBS),对照组为培养基。结果对照组细胞培养4 d后见少数细胞增殖并长出细长的分支;FBS组细胞培养3 d后大量增殖并分化,形态学上为原浆型星形胶质细胞,呈扁平片状贴在培养皿表面;GMFG组细胞培养2 d后大量增殖并分化,形态学上为纤维型星形胶质细胞,5μg/L组细胞分化不如10μg/L组细胞分化明显。结论GMFG能诱导神经干细胞在体外增殖并分化为星形胶质细胞。     

大鼠胚胎神经干细胞体外分化时间的特异性

背景：目前对于神经干细胞体外培养过程中神经干细胞自身分化特性的变化研究的较少。 目的：观察大鼠胚胎神经干细胞体外分化的时间特异性。 方法：利用无血清悬浮培养的方法分离培养大鼠胚胎皮质神经干细胞,取不同培养时间的神经干细胞进行诱导分化,检测其分化特性的改变。 结果与结论：体外培养的神经干细胞早期分化以神经元为主,随着培养时间的增加,分化成神经元的比例下降,神经胶质细胞的比例增加,而神经干细胞分化成少突胶质细胞的潜能与培养时间无明显相关。提示体外培养的神经干细胞其分化成神经元的潜能随着培养时间的增加而降低,而分化成神经胶质细胞的潜能随培养时间的增加而增加,神经干细胞分化为少突胶质细胞的潜能无时间相关性。     

新生大鼠海马神经干细胞的分离培养及分化研究

研究新生大鼠海马区脑组织中神经干细胞体外培养方法,为治疗神经系统疾病寻找合适的细胞来源。取新生SD大鼠的海马区脑组织,采用accutase结合机械分离法获取神经干细胞,在含有B－27、碱性成纤维生长因子和表皮生长因子的DMEM／F12无血清培养液中培养;Accutase酶消化后传代培养,取第3代细胞行抗巢蛋白免疫荧光染色鉴定并以含10％胎牛血清培养液诱导分化,神经元特异烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白免疫荧光染色检测NSCs向神经元及胶质细胞分化的能力。分离的新生大鼠海马区脑组织中细胞,在无血清培养液中形成大量的神经球,部分神经球出现融合及贴壁分化现象,细胞呈典型NSCs 形态。经巢蛋白染色鉴定,大部分为阳性细胞。神经细胞球经含有胎牛血清培养液培养后,可分化为神经元特异烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白表达阳性的细胞。从新生大鼠海马组织分离培养的NSCs具有自我更新和增殖能力,在含胎牛血清培养液中具有向神经元和神经胶质细胞分化的潜能。     

神经干细胞在老年性痴呆模型鼠基底前脑内的成活和迁移

为探讨神经干细胞移植入老年性痴呆模型鼠基底前脑的成活和迁移情况,本研究利用无血清培养技术,加表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维生长因子(FGF-2)刺激生长,在体外进行神经干细胞的克隆培养,用5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)标记,采用免疫组化和免疫荧光法研究神经干细胞的增殖特性和多向分化潜能,用免疫组化和免疫荧光双标技术观察神经干细胞移植后在老年性痴呆模型鼠基底前脑的成活和迁移。结果显示:克隆细胞球呈nestin和BrdU阳性反应。免疫荧光双标检测,贴壁的细胞为BrdU+GFAP阳性反应或者BrdU+NF阳性反应。移植后3周、4周,移植的针道附近以及整个基底前脑散在有许多BrdU+NF和BrdU+GFAP免疫荧光双标细胞。本研究结果提示,基底前脑神经干细胞能够分化为神经元和星形胶质细胞;基底前脑神经干细胞移植后能够在老年性痴呆模型鼠基底前脑内存活和迁移,可以与脑组织整合,并且能够分化成为神经元和星形胶质细胞。     

人胚胎纹状体来源神经干细胞的体外培养

背景：目前神经干细胞多由动物获得,不适合人类临床移植治疗。 目的：探索体外环境下人胚胎纹状体来源神经干细胞的培养方法,同时观察其生物学特性。 方法：取经水囊引产的孕8-16周人胚胎纹状体,体外用无血清DMEM培养基进行培养,待细胞形成神经球后进行传代,并应用含体积分数10%胎牛血清的DMEM/ F12培养液进行诱导分化。 结果与结论：体外培养的人胚胎纹状体来源神经干细胞生长迅速,表达神经干细胞标志物nestin。克隆形成实验显示细胞克隆形成率为6.0%-7.0%;BrdU掺入实验显示细胞增殖率为37.9%。免疫荧光染色显示经诱导分化的细胞表达神经元标志物Ⅲ型β微管蛋白、星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白及神经干细胞标志物nestin,但不表达少突胶质细胞标志物髓鞘碱性蛋白。可见人胚胎纹状体来源神经干细胞在体外无血清条件下可保持其生物学特点,具有自我更新能力,经胎牛血清诱导后可向神经元及星形胶质细胞分化。     

神经干细胞在创伤性脑损伤灶周边的成活和迁移

背景:成年人中枢神经系统再生困难,颅脑损伤后,损伤灶周边区域神经细胞的存活数量直接影响患者的预后。如何有效地使移植入创伤性脑损伤灶周边的神经干细胞存活分化,是目前神经修复再生研究的重点。目的:探讨神经干细胞移植入大鼠创伤性脑损伤灶周边的成活、迁移和分化情况。方法:利用无血清培养技术,加入表皮生长因子、碱性成纤维生长因子诱导刺激大鼠胚胎源性前脑神经干细胞生长增殖,并在体外进行克隆培养,移植前行BrdU标记,采用免疫组化和免疫荧光法检测其增殖特性和多向分化潜能,并观察其移植到Fenney’s落体脑损伤模型鼠脑皮质内的成活和迁移情况。结果与结论:免疫组化及免疫荧光检测结果显示克隆细胞球呈nestin和BrdU阳性,分化后呈NSE,GFAP,MAP-2阳性。免疫组化及荧光双标检测结果显示移植后7,14d损伤灶周边散在BrdU阳性细胞,并且GFAP阳性细胞增多。提示前脑神经干细胞在体外培养中能够增殖,并分化为神经元和神经胶质细胞,移植后能够在创伤性脑损伤灶周边存活和迁移,形态上显示出与脑组织整合的特点。     

颅脑手术患者废弃脑组织中神经干细胞的培养与鉴定

目的:研究颅脑手术患者废弃脑组织中神经干细胞的培养与鉴定,为立体定向自体神经干细胞移植治疗脑出血、脑梗塞及颅脑损伤后遗症提供临床前基础。方法:通过改进原代培养方法,从颅脑手术患者废弃脑组织中培养和鉴定神经干细胞(NSCs)。收集颅脑手术患者不同脑区废弃脑组织各约500 mg以上,按改良方法进行原代培养并传代,通过免疫荧光检测NSCs标志物巢蛋白(Nestin)的表达,传代培养5代时开始进行诱导分化。结果:培养约3～10 d后,多数患者废弃脑组织中均可见干细胞球生长,经Nestin免疫荧光检测均呈阳性表达。选取第6代诱导分化后的贴壁细胞分别经β-Tubulin(神经元标志物)、Sox10(少突胶质细胞标志物)与GFAP(星形胶质细胞标志物)免疫荧光检测,可见少量神经元、少突胶质细胞及星形胶质细胞阳性表达。取第3代与第6代细胞行免疫印迹鉴定,第3代细胞仅见Nestin与少量β-Tubulin表达,第6代细胞可见不同程度的Nestin、β-Tubulin、Sox10及GFAP等表达。结论:本研究成功从颅脑手术患者不同脑区废弃脑组织中分离培养获得成人NSCs,并可向神经元及神经胶质细胞分化,使立体定向自体神经干细胞移植促进神经功能修复从实验室到临床应用成为可能。     

PGRN在室管膜下区神经干细胞及其细胞分化中的表达

目的探讨颗粒蛋白前体(PGRN)在室管膜下区(SVZ)神经干细胞及分化细胞中的表达和意义。方法体外原代培养新生大鼠SVZ神经干细胞,免疫荧光细胞化学法检测PGRN在神经干细胞及其分化的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞中的表达。结果成功培养新生大鼠SVZ神经干细胞,神经干细胞可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。神经干细胞及其分化的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞均表达PGRN。结论 SVZ神经干细胞及分化细胞均表达,提示PGRN可能参与神经干细胞的分化过程。     

成年小鼠室管膜下区神经干细胞分离及培养方法改良

目的:改良成鼠神经干细胞(NSCs)分离培养方法,优化培养条件,为系统研究成体干细胞增殖与分化特性以及利用成体干细胞进行细胞治疗奠定基础。方法:视交叉前1.5 mm处离段脑组织,分离前脑室管膜下区(SVZ),通过机械性消化与化学性消化相结合的操作方法制备细胞悬液,应用改良无血清培养基悬浮培养NSCs。nestin免疫荧光染色鉴定NSCs,1%胎牛血清诱导分化后免疫荧光染色鉴定NSCs多向分化潜能。系列稀释实验和5-溴脱氧尿核苷(BrdU)掺入实验比较改良培养与常规培养NSCs自我更新能力和增殖潜能。结果:改良培养条件,NSCs 7～9 d可形成nestin阳性神经球。应用1%FBS诱导后,NSCs分化为形态各异的细胞,包括神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞,分化比例分别是(18.6±3.5)%、(73.2±5.2)%和(3.6±0.4)%。系列稀释实验结果显示当细胞接种数量为500、1000和2000个,改良培养NSCs形成次代神经球数量较常规培养对照组明显增多(P<0.05),并且8 h BrdU掺入率也显著增高达(42.4±6.2)%(P<0.05),表明改良培养条件下NSCs自我更新能力和增殖活力良好。结论:本研究建立了一种简便、操作性强、重复性高的成鼠NSCs分离培养方法。     

大鼠神经干细胞的分离培养、鉴定和诱导分化

近年研究发现,哺乳动物无论在胚胎发育期还是在成年,其中枢神经系统内都存在具有自我增殖和多向分化潜能的神经干细胞,这一发现为神经损伤修复的研究提供了一条新思路。分离培养神经干细胞,并在体外稳定的增殖与分化,为研究神经干细胞的增殖、分化特性、干细胞移植以及建立细胞系等,提供了细胞来源和保证。本研究利用胎鼠和乳鼠的大脑皮层和海马,用含EGFP和bFGF的NSC培养基培养、分离了具有自我增殖和多向分化潜能的神经干细胞,并观察其生长、增殖和分化特点,以期为神经干细胞的基础研究奠定基础。     

新生大鼠神经干细胞的分离培养与观察

目的 建立神经干细胞的分离，培养及分化鉴定技术；观察神经干细胞生长，增殖及分化的特点，方法 分离新生SD大鼠脑室下区的组织，经消化及机械吹打后，采用原代贴壁及传代悬浮的方法，培养获得细胞克隆。应用免疫细胞化学方法及透射电镜检测技术，鉴定神经干细胞和分化的神经细胞，结果 从新生SD大鼠脑室下区分离的组织，经原代和传代培养均可形成细胞克隆，并具增殖的能力，原代和传代细胞抗原-nestin呈阳性，分化后的细胞可表达神经元，星形角质细胞和少突角质细胞的特异性抗原。结论 用此方法分离的细胞具有自我更新和分化潜能，有很强的增殖能力，是属于中枢神经系统的干细胞。     

大鼠胚胎脑组织神经干细胞的培养和鉴定

目的探讨从不同胎龄的大鼠脑组织中分离,培养神经干细胞(NSC)并对其鉴定,了解生物特性。方法通过采用机械分离和消化分离相结合的方法分离不同胎龄大鼠脑NSC。在无血清DMEM/F12(含20ng/m lbFGF,20ng/m lEGF及B27辅助培养液)中培养、传代和鉴定。诱导分化后采用SABC法对分化的细胞进行神经元特异烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)检测作细胞鉴定。结果从不同胎龄的胎鼠脑组织中成功培养出神经干细胞,胎龄为12.5天的胎鼠提取的神经干细胞集落最多,在上述条件下培养及传代的细胞不断分裂增殖,形成悬浮生长的呈巢素蛋白(nestin)阳性的神经球;用血清诱导分化为大量表达NSE阳性的神经元和GFAP阳性的星形胶质细胞。结论胎龄为12.5天胎鼠大脑皮质培养出的神经干细胞数量最多,可分化为神经元、神经胶质细胞及少突胶质细胞。     

神经干细胞移植治疗视网膜缺血再灌注损伤的研究进展

视网膜缺血再灌注损伤尚无理想的治疗手段。神经干细胞是具有自我更新、多向分化潜能的细胞群,能分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。随着干细胞研究技术的不断发展,通过体外培养神经干细胞,移植整合入视网膜各层并定向诱导分化为目的细胞,有望重建视网膜功能。     

兴奋性氨基酸抑制胎鼠神经干细胞的增殖

目的：研究兴奋性氨基酸对体外培养胎鼠神经干细胞（NSCs）增殖的影响。 方法:体外分离、培养与鉴定SD胚胎大鼠脑室下带(SVZ)神经干细胞，利用MTT比色法测定兴奋性氨基酸N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）和谷氨酸（Glu）对细胞增殖的作用。 结果:成功分离出具有胚胎源性的神经干细胞，NMDA和Glu均能导致神经干细胞的增殖活性下降。 结论:培养的SVZ区域细胞具有自我更新和多分化潜能，是中枢神经系统干细胞，兴奋性氨基酸能有效地抑制神经干细胞的增殖。     

新生鼠基底前脑神经干细胞的分离和培养

目的　探讨基底前脑神经干细胞的增殖及多向分化潜能。方法　利用无血清培养技术 ,加表皮生长因子 (EGF)和碱性成纤维生长因子 (FGF 2 )刺激生长 ,在体外进行神经干细胞的克隆培养和血清诱导分化 ;采用免疫组化研究神经干细胞的增殖特性及多向分化潜能 ,并用 5 溴 2 脱氧尿苷 (BrdU)标记证实其增殖能力。结果　从新生鼠基底前脑成功分离出神经干细胞 ,该细胞具有连续增殖能力 ,可以传代培养 ,表达神经上皮干细胞蛋白抗原 ,可以分化成神经元和胶质细胞 ;BrdU标记结果阳性。结论　新生鼠基底前脑存在具有自我更新能力和多分化潜能的神经干细胞