Oct4基因在猪孤雌激活和体外受精早期胚胎中的表达特征

摘 要：[目的]研究植入前胚胎发育重要基因Oct4在猪孤雌和体外受精胚胎中的表达特征。[方法]收集成熟卵母细胞、孤雌和体外受精2细胞、4细胞、8细胞和囊胚，做荧光定量PCR，以成熟卵母细胞做对照分析相对表达量。[结果]孤雌组和体外受精组在8细胞期Oct4表达量均最高（p<0.05），在孤雌和体外受精组囊胚相对于其他时期Oct4表达量最低（p<0.05）。在同一时期孤雌和体外受精Oct4表达并没有差异。[结论]多能性基因Oct4在卵裂发育时期表达量动态变化，孤雌胚胎在一定程度上可作为体外胚胎基因表达的模型，且不同的胚胎培养条件可能导致基因表达的不同。     

RapidWarm Blast玻璃化解冻液对囊胚复苏的效果观察

目的 观察在囊胚复苏周期中,RapidWarm Blast玻璃化解冻液对囊胚的复苏效果。方法 回顾性分析2018年12月至2019年12月在安徽医科大学第一附属医院首次行囊胚复苏移植的655例患者临床资料,根据囊胚解冻液不同分A组357例及B组298例。A组采用传统Vitrification Media解冻液进行囊胚复苏,B组采用新型RapidWarm Blast解冻液复苏。比较两组囊胚复苏后整体存活率,解冻2 h后囊胚重扩张率、孵化率,囊胚种植率及临床妊娠率;同时比较两种解冻液对囊胚不同发育阶段(第5天囊胚、第6天囊胚)的重扩张率、孵化率及临床妊娠率的影响。结果 两组囊胚复苏后的存活率、重扩张率、孵化率、临床妊娠率比较,差异均无统计学意义(P>0.05);B组囊胚种植率(55.45%)高于A组(48.76%),差异有统计学意义(P<0.05)。两组中发育第5天的囊胚复苏2 h后重扩张率及孵化率均高于发育第6天的囊胚,差异均有统计学意义(P<0.05);两组间发育第5天的囊胚复苏2 h后重扩张率及孵化率比较,差异无统计学意义(P>0.05),B组发育第6天的囊胚复苏2 h后扩张率及孵化率均高于A组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 新型RapidWarm Blast解冻液用于囊胚玻璃化复苏,可获得与传统的Vitrification Media相似的临床结局,但新型解冻液对发育第6天囊胚的复苏效果更好,胚胎种植率更高。     

isthmin 1对斑马鱼胚胎汇聚延伸运动的影响

目的在原肠期,斑马鱼胚胎细胞进行着外包(epiboly)、内卷(involution)以及汇聚延伸(convergence and extension)运动,对于胚胎的形态发生起关键作用。本文旨在研究isthmin 1(ism1)在斑马鱼胚胎发育中的表达图谱,并进一步探讨其在原肠期胚胎汇聚延伸运动中的功能。方法通过原位杂交技术,检测ism1在斑马鱼早期胚胎发育中的表达图谱;利用过表达和特异敲降等实验技术,活体拍照及原位杂交检测ism1对胚胎汇聚延伸运动的影响。结果整胚原位杂交实验结果显示ism1是合子表达的基因,在30%外包时期开始表达于胚胎背部,原肠期表达在整个胚胎边缘区,尤其在胚盾部位表达更为明显。活体拍摄及原位杂交结果表明,与野生型斑马鱼胚胎相比,过表达或敲低ism1均会使胚胎的汇聚延伸运动受到影响。结论 ism1是调控斑马鱼胚胎原肠期汇聚延伸运动的重要基因。     

不同品系小鼠胚胎玻璃化冷冻保存的比较研究

目的　研究甘油作为冷冻保护剂、不同基因型小鼠对胚胎玻璃化冷冻的影响。方法　采用 6 5mol L的甘油作为冷冻保护剂 ,采用二步法对CBA、NOD、C57BL 6J、ICR及CD1小鼠 3 5d的胚胎进行玻璃化冷冻 ,并比较了不同品系小鼠胚胎的复苏率及移植受孕率。结果和结论　CBA、NOD、C57BL 6J,ICR及CD1的复苏率分别为 5 7 6 %、4 8%、31 3%、86 5 %及 88% ,移植受孕率为 2 1%、2 3 5 %、11%、38%和 35 5 % ,封闭群小鼠的胚胎复苏率、移植受孕率均显著高于近交系小鼠。这提示胚胎的复苏率及移植受孕率可能与小鼠的不同基因型有关。五个品系中 ,桑椹胚及早期囊胚的体外复苏率均显著高于扩张囊胚。这说明不同基因型及胚胎的不同发育阶段对胚胎玻璃化冷冻效果有影响     

维生素A酸对小鼠囊胚Fas蛋白表达的影响

目的:探讨全反式维生素A酸(ATRA)对体外培养小鼠囊胚Fas蛋白表达的作用,并了解其对着床前期胚胎发育的作用。方法:获取妊娠3.5 d小鼠囊胚,分别培养在含0、1μmol.L-1和10μmol.L-1的ATRA的M199培养基中24 h,用免疫组织化学SP法,分别检测不同剂量组ATRA对小鼠囊胚Fas蛋白表达的状况。结果:ATRA可增强小鼠囊胚Fas蛋白表达,表达强度呈现剂量依赖型。结论:ATRA对小鼠胚胎的发育具有细胞毒性作用,Fas在小鼠胚胎发育的调节中发挥了重要的作用。     

小鼠早期胚胎质量与细胞凋亡的相关性

目的分析小鼠早期胚胎质量与细胞凋亡的关系,了解细胞凋亡调控基因在早期胚胎发育中所起的重要作用,旨在为提高胚胎质量寻找一条新途径。方法采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)原位荧光检测和Bcl-2免疫荧光检测等凋亡检测技术,以及增殖细胞核抗原(PCNA)免疫荧光检测细胞增殖程度的技术,分别对小鼠早期形态正常的胚胎、早期发育阻滞的胚胎和有碎片的胚胎进行细胞凋亡程度和增殖程度的检测,比较其凋亡和增殖程度的差异。结果小鼠早期发育阻滞的胚胎细胞和胚胎中的碎片TUNEL阳性,Caspase活性增强,Bcl-2、PCNA表达水平降低。结论细胞凋亡与胚胎发育阻滞及胚胎中的碎片形成密切相关。     

长爪沙鼠体外受精与早期胚胎体外培养体系的初步建立

目的 探讨自配的获能液和受精液用于长爪沙鼠体外受精的可行性,为长爪沙鼠的胚胎保种提供参考。方法 用自配的获能液和受精液对长爪沙鼠进行体外受精,并用改良后的KSOM培养液对长爪沙鼠的2细胞胚胎进行体外培养试验。结果 长爪沙鼠体外受精率在60%以上,沙鼠2细胞胚胎能够在体外进一步发育。结论 初步建立了长爪沙鼠体外受精和胚胎发育体系,但需要进一步优化。     

Trophinin在人卵母细胞及着床前胚胎细胞上的表达与意义

目的 研究trophinin在人卵母细胞、着床前胚胎细胞上的表达与意义.方法 采用间接免疫荧光技术、应用激光扫描共聚焦显微镜对9个卵母细胞、16个分裂胚胎及12个囊胚进行了荧光检测.结果 trophinin蛋白在人卵母细胞、分裂胚胎以及囊胚上均有表达,且表达逐渐显著增强(P＜0.05).结论 人囊胚可能通过trophinin与表达有相同粘附分子的着床窗期子宫内膜发生同种粘附,从而在人胚胎着床过程中起重要作用.     

全反式维生素A酸对小鼠囊胚转化生长因子β_1蛋白表达的影响

目的:探讨全反式维生素A酸(ATRA)对体外培养小鼠囊胚转化生长因子β1 (TGF β1 )蛋白表达的作用,并了解其对着床前期胚胎发育的影响作用。方法:获取妊娠3.5 d小鼠囊胚,分别培养在含0,0.1,1,10μmol·L-1的ATRA的M199培养基中24 h,用免疫组织化学SP法,分别检测不同剂量组 ATRA对小鼠囊胚 TGF β1蛋白表达的状况。结果:ATRA可增强小鼠囊胚TGF β1 蛋白表达,表达强度呈现剂量依赖型。结论:ATRA对小鼠胚胎的发育具有细胞毒性作用,TGF β1 在小鼠胚胎发育的调节中发挥了重要的作用。     

小鼠体外受精、胚胎培养及胚胎快速冷冻的研究

目的　为扩大胚胎来源并获取特定胚龄胚胎 ,建立小鼠冷冻胚胎库。方法　运用超数排卵、体外受精与胚胎培养及胚胎冷冻技术系统研究了小鼠受精卵的体内发育与运行规律。卵母细胞的体外成熟与受精、单细胞胚胎培养及胚胎快速冷冻。结果　 (1)注射hCG后 12～ 2 0h受精卵发育至原核期 ,4 2～ 4 8h为 2 细胞期 ,4 8～ 6 0h为 4 细胞期 ,6 0～ 6 8h为 8 细胞期 ,以上各期受精卵均处于输卵管中 ;75～ 78h为桑椹胚 ,78～ 80h为致密桑椹胚 ,90～ 92h为早期囊胚 ,92～ 96h为囊胚 ,以上各期均处于子宫角中。 (2 )培养液中添加促性腺激素 (FSH与hCG) ,能显著提高卵母细胞的体外受精率 ,添加FCS和激素组的体外受精率又显著高于单独添加激素组 ,FCS还能显著提高胚胎发育。 (3)在培养液中添加EDTA ,能有效克服小鼠胚胎的 2 细胞阻断 ,其 2 细胞胚的发育率达 10 0 % ,8 细胞胚发育率达 5 5 %以上 ;牛、羊上皮细胞培养液上清也能有效克服 2 细胞阻断。添加乳酸钠和丙酮酸钠可使 2细胞与 8细胞期胚的发育率显著提高。 (4)以D PBS +甘油 +蔗糖为冷冻液 ,以D PBS +蔗糖为稀释液 ,对小鼠胚胎进行快速冷冻 ,桑椹胚的存活率为 6 9 3% ,早期囊胚的存活率为 6 0 4 %。结论　研究为将生物技术应用于小鼠 ,扩大卵子和胚胎来源     

无创胚胎染色体筛查在染色体非整倍体检测中的应用效果

目的探讨无创胚胎染色体筛查技术(NICS)在染色体非整倍体检测中的应用效果。方法收集2017年5月至2019年5月在安徽省妇幼保健院生殖中心拟行体外受精-胚胎移植的364例患者的囊胚培养液,并行NICS筛查。对单囊胚移植且临床确认妊娠的46例患者,根据其妊娠结局不同行不同染色体检查方法:对12例流产的患者行流产组织染色体检查,并以该检查结果为金标准,计算NICS的灵敏度和特异度;对继续妊娠的34例患者行外周血无创产前遗传学筛查(NIPS),比较NICS结果与NIPS筛查结果的差异。结果 12例流产的患者样本中,流产组织染色体检查与NICS检查为染色体非整倍体者均为3例,NICS筛查的灵敏度为100%;在流产组织染色体检查为整倍体的9例样本中,对应的NICS检出2例为非整倍体,其特异度为77.78%,两种筛查方法的一致性分析Kappa值为0.64。继续妊娠的34例患者样本中,NIPS筛查均未检出13、18、21号染色体为非整倍体胚胎,NICS对这3条染色体的筛查结果与NIPS一致。结论 NICS筛查染色体非整倍体有较好的灵敏度,但假阳性率偏高,需进一步技术优化以提高特异性。     

冻融人早孕蜕膜单层细胞对小鼠胚胎发育的影响

目的　探讨冻融的人早孕蜕膜单层细胞对小鼠胚胎发育的影响。方法　蜕膜单层细胞解冻后接种获得冻融蜕膜单层细胞;观察昆明白小鼠单细胞受精卵与传代的、冻融的人早孕蜕膜单层细胞共培养 (A、B组)及仅用培养液培养(C组)的胚胎发育情况。分析A、B组与C组各期鼠胚的发育情况及 8 细胞期A类胚胎形成情况。结果　A、B、C组的2 细胞期形成率差异无显著性,A组在 4 细胞形成率上高于B、C组。A、B组 8 细胞期、桑椹期、早期囊胚形成率和囊胚孵出率高于C组(P<0 05)。而A、B组之间差异无显著性。A、B组在 8 细胞阶段A、B类胚胎形成率与C组相比,差异有显著性(P<0 05)。同样A、B组之间差异无显著性。共培养 20d的培养液经检查,细菌及真菌均阴性。结论　冻融的人蜕膜单层细胞与传代细胞一样在小鼠胚胎的发育中起到了促进作用,该结果说明了人胚胎与其冻融的自体子宫增殖晚期-分泌早期的内膜单层细胞共培养的可行性。     

Somatostatin receptor 1–5; expression profiles during rat development

Abstract

Background. Somatostatin acts through five receptor subtypes (SSTRs 1–5). We aimed to investigate SSTRs mRNA expression and protein distribution in whole rat embryos, with special emphasis on the pancreas.

Material and methods. Rat embryos were collected on embryonal days 10, 11, 12, 14, 15, 17, 19, 21, and at birth. Presence of SSTRs was investigated with RT-PCR techniques and immunohistochemistry.

Results. There was no SSTR5 mRNA expression in the whole rat embryos. All SSTR1–5 proteins were observed at embryonal day 10, but the localization varied between the different subtypes. From day 11 to birth SSTRs protein presence increased with time in major structures such as skin and cartilage. It remained similar over time in the heart and liver. In the fetal pancreas mRNA expression of SSTR2 and 4 was detected at day 14, and there was an increase up to birth. Only SSTR1 protein co-localized to a higher extent with the islet hormones studied. SSTR2 was present in all islet endocrine cells except for β-cells. In contrast, the immunostaining for SSTR3–4 was co-localized with insulin and PP, and, finally, SSTR5 with glucagon and pancreatic polypeptide. In mRNA isolated from whole rat embryos SSTR1-2 and SSTR4 expression showed a peak at day 14, while SSTR3 mRNA was not present until day 15.

Conclusion. The present data suggest a role for SSTRs during the development of the rat embryo. Subsequent functional studies may elucidate regulatory roles of specific SSTRs for the growth and differentiation of the pancreas as well as other organs.     

Selection and vitrification of embryos with a poor morphological score: A proposal to avoid embryo wastage

Embryos with a poor morphological score at cleavage stage are usually discarded because they are considered unsuitable for transfer and cryopreservation. This study examined the in vitro blastocyst development after extended culture of these embryos and the clinical outcomes after transfer of these blastocysts in warming cycles. A total of 597 blastocysts (24.7%) were obtained from 2421 embryos with low morphological scores after extended culture. One hundred and sixty blastocysts (6.6%) with optimal morphology were vitrified. Embryo utilization rate was increased from 30.8% to 32.6%. After warming, 61 out of 92 blastocysts (66.3%) survived and were transferred in 44 cycles. The clinical pregnancy rate and the implantation rate were 40.9% (18/44) and 32.8% (20/61) respectively. Thirteen healthy babies were born, and 5 pregnancies aborted spontaneously. Our study suggested that some blastocysts derived from embryos with a poor morphological score can be successfully vitrified and give rise to live births. Selection and vitrification of viable embryos after extended culture of embryos with a poor morphological score may constitute a proposal to avoid embryo wastage.     

超声波对小鼠胚胎表达整合素及其着床能力的影响

目的：研究超声波照射对小胎胚表达整合素α1、α5、β1、β3的影响充及与其着床能力的关系。方法：取小鼠二细胞胚经超声波照射后体外培养至囊胚期,用免疫组化法检测其整合素α1、α5、β1、β3的表达及其着床能力的改变,并与未经照射的正常胚胎比较,结果：1、超声波照射组胚贴附率,滋养细胞外延生长率均显著低于正常胚胎。2、正常胚胎桑椹胚期即有α5、β1、β3整合素表达,而无α1表达：囊胚期α5、β1、β3表达增强,仍无α1表达：α1只出现在外延生长的滋养细胞。3、超声波照射组胚胎β3整合素的表达明显弱于正常组。且未见α1表达,而α5、β1的表达两组间无差异。结论：超声波照射使胚胎着床能力明显降低。可能与其影响胚胎细胞α1、3整合素的正常表达有关。     

224例冻融胚胎移植周期分析

目的：探讨胚胎冷冻时机对复苏后胚胎发育的可能影响，并分析移植胚胎数量和质量与冻融胚胎移植妊娠结果的关系。方法：（1）将224个冻融胚胎移植周期，根据冷冻时间分为第2天（D2组）97例，第3天（D3组）127例两组，回顾比较解冻后两组的胚胎存活率、胚胎完好率和临床妊娠率等.（2）比较了移植不同胚胎个数（3、2、1个）和优质胚胎个数（3、2、1、0个）的临床妊娠率。结果：（1）D2组胚胎完好率为54．28％，显著高于D3组的40．65％（P〈0．05），D2组的胚胎存活率、妊娠率、种植率、多胎率和流产率分别为82．57％、26．80％、13．01％、34．62％、11．54％，与D3组（82．17％、37．01％、17．66％、36．17％、17．02％）的差异均无显著性（P〉0．05）。（2）移植3、2、1个胚胎分别可获得34．62％、26．47％、12．5％的临床妊娠率，各组之间比较差异无显著性（P〉0．05）；移植3个或2个优质胚胎的临床妊娠率没有差异，但其临床妊娠率显著高于只移植1个或没有优质胚胎组。结论：胚胎冷冻时机对早期分裂胚胎的发育潜能没有影响。冻融胚胎移植周期的妊娠率与移植的优质胚胎数目有关。     

囊胚期冷冻胚胎移植的临床应用探讨

目的探讨囊胚期冷冻胚胎移植的临床应用价值.方法对2002年10月～2003年12月在湘雅医院生殖医学中心接受囊胚培养并行囊胚期冷冻胚胎移植的病例进行分析,了解囊胚期与卵裂期冷冻胚胎解冻后的胚胎成活率、植入率及妊娠率.结果冷冻囊胚解冻后胚胎数、胚胎成活率、植入率和妊娠率与卵裂期冷冻胚胎无显著差别(P＞0.05),囊胚解冻后经15 h过夜培养,42枚中有22枚成活,其中8枚Ⅰ,Ⅱ级继续发育或囊胚腔扩张,3例获得妊娠,妊娠率为37.5%.结论囊胚期冷冻胚胎移植同样能达到卵裂期冷冻胚胎移植的临床效果,同时增加解冻与移植间隔时间可更好地选择冻融囊胚移植,对提高妊娠率可能有一定意义.     

不同时期胚胎线粒体拷贝数与胚胎自身形态学分型的关系研究

目的:探讨人类不同形态学分型的卵裂期胚胎和囊胚与自身线粒体拷贝数的关系。方法:选择在生殖中心因女性双侧输卵管梗阻行体外受精-胚胎移植（IVF-ET）助孕顺利娩出健康胎儿后,自愿丢弃冷冻的卵裂期胚胎和囊胚用于科学研究。将冷冻的胚胎解冻复苏后,依据胚胎发育的时期,将所有胚胎分为卵裂期胚胎冷冻组（D3冷冻胚胎组,n=63）和囊胚冷冻组（D5冷冻胚胎,n=82）,再根据冷冻胚胎的形态学评分标准,将冷冻卵裂期胚胎分为优质胚胎组（n=38）和较差胚胎组（n=25）,将冷冻囊胚分为优质囊胚组（n=52）和较差囊胚组（n=30）。采用实时PCR检测胚胎线粒体拷贝数,比较不同阶段胚胎和相同阶段不同质量的胚胎与自身线粒体拷贝数的差异。结果:D3冷冻胚胎组线粒体拷贝数明显低于D5冷冻胚胎组（t=9.34,P<0.02）,D3冷冻胚组中优质胚胎mtDNA拷贝数高于质量较差胚胎组（t=6.62,P<0.01）,D5冷冻胚组中优质胚胎mt DNA拷贝数明显高于质量较差胚胎组（t=8.03,P<0.04）。结论:不同时期胚胎mt DNA拷贝数对胚胎的发育潜能有重要影响,mtDNA拷贝数越高,胚胎质量越好。     

碳水化合物对牛体外受精胚胎体外发育的影响

目的　在SOF +PVA(合成输卵管液 +聚乙烯醇 )这一化学成分明确培养系统条件下 ,观察了葡萄糖、丙酮酸和乳酸三种碳水化合物对牛体外受精胚胎体外发育的影响 ,以便为今后进一步探讨影响牛早期胚胎体外发育的因素提供实验依据。方法　牛卵母细胞体外成熟和体外受精后 ,在化学成分明确培养系统内进行体外发育培养。结果　实验 1将牛体外受精卵培养于不含有葡萄糖的SOF +PVA培养系统中 ,培养 12 0h后分别移入含有 0、1 5 0、3 30、5 0 0mmol L的SOF +PVA培养系统中 ,对照组胚胎一直在含有 1 5 0mmol L葡萄糖的SOF +PVA中培养 ,结果囊胚的发育率分别为 9 2 % a、12 1%、19 2 % b、18 9%和 11 7% (a 相似文献