Cre／loxP系统与时空特异性基因打靶

时空特异性基因打靶是指借助于噬菌体P1的位点特异重组酶Cre和该酶的特定作用位点loxP组成的Cre/loxP系统的作用,利用控制Cre表达的启动子的时空特异性,从而在特定的发育阶段和特定的组织细胞中对特定的基因进行遗传修饰的技术。本主要介绍该技术的一般原理和方法。     

Cre/loxP系统与时空特异性基因打靶

时空特异性基因打靶是指借助于噬菌体 P1的位点特异性重组酶 Cre和该酶的特定作用位点 lox P组成的 Cre/lox P系统的作用、利用控制 Cre表达的启动子的时空特异性 ,从而在特定的发育阶段和特定的组织细胞中对特定的基因进行遗传修饰的技术。本文主要介绍该技术的一般原理和方法     

基因打靶进展

应用既往的基因打靶(gene targeting)策略不能产生核苷酸水平上的精确突变,并存在潜在的不利因素。本文介绍三种新策略,即打了就走策略、标记-交换策略和应用Cre-loxP重组系统策略。其中以应用Cre-loxP重组系统策略最有应用和发展前景。     

小鼠胚胎干细胞α-GT基因打靶的研究

目的在小鼠胚胎干细胞上进行α-1,3半乳糖基转移酶(α-GT)基因打靶。方法利用长距离PCR和套式PCR从C57小鼠基因组DNA中克隆出α-GT基因组DNA片段,构建了针对α-GT基因外显子4的置换型基因打靶载体ploxp-GT,同源长臂(5．Okb),同源短臂(3．97kb),同源序列全长共约9．0kb。将打靶载体酶切线性化并以电穿孔方法转移入小鼠MEEs细胞。结果通过G418和Gancyclovir正负选择出171株ES细胞药物抗性克隆,Southern blot鉴定获得11个α-Gal( /-)小鼠ES细胞克隆,重组频率为6．4％。结论上述方法能够完成α-GT基因敲除,为进一步完成α-GT基因敲除小鼠奠定了基础。     

转基因小鼠研究进展

转基因动物是指用实验的方法将外源基因导入早期胚胎细胞,使之整合于细胞基因组中而建立的动物品系.最早建立成功的转基因动物是转基因小鼠(transgenic mice).由于转基因小鼠的建立比其它大型转基因哺乳动物的建立要省时、省力,因此转基因小鼠作为生命科学研究的一个新体系已经得到越来越广泛的应用.     

基因打靶技术及其发展和应用

通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定位点的基因打靶技术，已经成为哺乳动物遗传学领域的重要工具。本文拟针对胚胎干细胞和体细胞的基因打靶的原理、技术路线及基因打靶技术的发展和应用作一综述。     

基因打靶的策略及其发展

基因打靶是近十年来发展起来的分子生物学技术 ,此项技术的应用和发展为人们在动物体水平研究基因的功能及其调控提供了可靠的手段。尤其是组织特异性基因打靶技术的出现 ,使人们能够在特定的组织细胞类型中以及特异的细胞发育阶段研究某一特定的基因功能。本文综述了基因打靶载体构建的策略及发展 ,并且分别描述了不同打靶载体策略的优缺点。     

条件性基因打靶及其研究进展

条件性基因打靶是在常规的基因打靶 (基于同源重组原理的基因打靶 )的基础上 ,结合重组酶介导的位点特异性重组技术而发展起来的一种基因打靶新方法。与常规的基因打靶方法相比 ,它对生物基因组的修饰具有时空可控性 ,显示出广阔的应用前景。本文主要就条件性基因打靶的原理、方法、特点及应用前景作一综述     

转基因小鼠的插入突变与基因克隆——方法,成就与展望

转基因技术成为研究基因的四维时空中的表达特性和功能的一种重要手段，在新基因的功能鉴定及人类疾病模型的建立中得到了重要的应用。由于转基因插入内源基因组往往引起内源基因的插入突变，这种突变占转基因小鼠“产品”的５￣１０％，比自发突变率要高得多；更为重要的是，利用已知ＤＮＡ序列的转基因作为探讨可以对具有一定突变表型的、发生插入突变的内源基因进行染色体定位和分离，从而开辟了一条利用外源基因的基因诱陷作用而     

基因打靶技术及其发展和应用

通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定位点的基因打靶技术,已经成为哺乳动物遗传学领域的重要工具。本文拟针对胚胎干细胞和体细胞的基因打靶的原理、技术路线及基因打靶技术的发展和应用作一综述。     

基因打靶的策略及其发展

基因打靶是近十年来发展起来的分子生物学技术,此项技术的应用和发展为人们在动物体水平研究基因的功能及其调控提供了可靠的手段。尤其是组织特异性基因打靶技术的出现,使人们能够在特定的组织细胞类型中以及特异的细胞发育阶段研究某一特定的基因功能。本文综述了基因打靶载体构建的策略及发展,并且分别描述了不同打靶载体策略的优缺点。     

小鼠ADAM10条件性基因打靶载体的构建与鉴定

目的构建小鼠ADAM10条件性基因打靶载体,为建立ADAM10条件性敲除小鼠模型奠定基础。方法以正常小鼠（129/Svj）基因组DNA为模板,采用长片段PCR方法,扩增小鼠ADAM10基因第2外显子及其侧翼序列。通过引入LoxP位点和TK基因等步骤,获得ADAM10条件性基因打靶载体。结果经限制性内切酶酶切鉴定和测序证实,构建的小鼠ADAM10基因条件性打靶载体符合设计要求。结沦成功构建了小鼠ADAM10条件性基因打靶载体,为建立ADAM10条件性基因敲除小鼠打下了基础。     

定点突变小鼠凝血因子Ⅸ胚胎干细胞基因打靶载体的构建

目的　构建定点突变的小鼠凝血因子Ⅸ胚胎干(ES)细胞基因打靶载体。方法　在小鼠Ⅸ因子基因第8 外显子中分别引入三个定点突变,构建置换型打靶载体转染胚胎干细胞,经药物筛选后挑取抗性细胞。结果　成功引入点突变并构建置换型打靶载体,转染ES细胞后经药物筛选得到抗性细胞克隆。结论　体外定点突变系统可以对基因进行精细的修饰,为建立更精确地模拟人类疾病的动物模型打下基础。     

基因打靶技术在构建人源体细胞基因敲除或敲入细胞系中的应用

基因打靶技术能够帮助人们认识某些动物个体或细胞表型异常的遗传基础，利用该技术构建的模式生物（例如基因敲除小鼠）已经广泛地应用于人类基因的研究，截至1999年就已经报道了800多个模式小鼠种系。同源重组介导的基因打靶技术（基因敲除或敲入）是判定基因功能的强有力工具。与基因敲除小鼠相比，人类体细胞基因敲除或敲入细胞系构建的报道相对较少，但该项技术在细胞水平上对某些人源基因参与的生化或生理途径的分析是不可替代的。基因打靶技术最常见的应用是通过使所有等位基因连续失活建立基因敲除细胞系；     

新的β2m基因打靶载体构建方法的建立

目的:采用常规方法(同源片段的插入方向与Neo基因相同)构建载体的同时,将两条同源臂反向插入Neo基因的两侧,构建新型小鼠β₂m基因替换型打靶载体β₂m-pPNT,即增加3'同源臂的长度,探讨同源臂插入位置和长度变化对同源重组率的影响。方法:设计和合成引物,经PCR从小鼠β₂m-pSV2△HXgpt基因组克隆分别扩增出长度为0.8kb和4.2kb的β₂m基因片段,作为5'和3'同源臂,分别反向插入载体pPNT的Neo基因上游和下游,构建小鼠β₂m基因替换型打靶载体β₂m-pPNT。结果:经过PCR、限制性内切酶及DNA序列测定,证实此两条同源臂包含小鼠β₂m的起始区和表达区,表明载体构建成功。结论:PCR技术是构建基因打靶载体的简单而可靠方法。增加3'同源臂的长度对研究提高胚胎干细胞基因敲除的同源重组率提供新的途径。     

用PCR和基因组Southern杂交鉴定基因打靶实验中同源重组事件

胚胎干细胞基因打靶实验需要从大量的基因转移细胞克隆中经过药物选择和ＤＮＡ分子水平的鉴定来获得发生同源重组的阳性细胞克隆。将快速简便、灵敏度高的ＰＣＲ技术和准确可靠的基因组Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交技术相结合，用来对小鼠凝血因子Ⅸ基因打靶事件进行分子鉴定，取得了较好的效果，观察了ＰＣＲ鉴定的高灵敏度，但有假阳性的存在，用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交确认弥补这一不足，分析了ＰＣＲ鉴定中阳性对照的设立和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ鉴定中探针和内切酶的选择等问题。     

应用显微注射法建立转基因小鼠

应用显微注射法建立转基因小鼠谢卫兵陈汉源曾位森罗琛（第一军医大学组胚教研室广州５１０５１５）转基因动物是研究基因表达调控及表达产物生物学效应的最佳体系之一，同时作为一种新型的生物反应器，在医学、农、林、畜牧业等领域有着广泛的应用前景。目前采用基因转移...     

转基因小鼠在免疫耐受研究中的应用

转基因动物技术在免疫学研究中的应用日益广泛，在研究免疫耐受发生机制、诱导和打破免疫耐受的方法中，转基因小鼠已成为一种十分便利的研究手段。利用转基因小鼠验证了胚胎期接触抗原可诱导特异性淋巴细胞形成免疫耐受的理论，揭示了树突状细胞、调节性T淋巴细胞和自身反应性淋巴细胞在免疫耐受形成中的作用，提供了多种用于研究诱导耐受治疗自身免疫病和打破免疫耐受治疗感染和肿瘤等疾病的有价值的动物模型。     

应用转基因小鼠研究心力衰竭的进展

近十年来 ,随着小鼠基因库的破译 ,小鼠胚胎干细胞的研究和基因干预技术的进展 ,已有大量转基因(ＴＧ)小鼠品系问世。通过对某一靶基因的干预 (如利用α 心肌凝蛋白启动子介导的过度表达、剔除、诱变等 ) ,目前已建立了 1 40多种具有各种心脏表现型的小鼠品系。这些ＴＧ小鼠品系为在整体水平研究心脏疾病的分子机制和基因治疗提供了系统的和全新的工具。与此同时 ,近几年在小鼠心脏生理学领域也取得了显著进展。随着心功能测定仪器的微型化 ,多种无创和有创性技术 ,例如左心导管术 ,超声心动图检测 ,核磁共振成像 ,心输出量测定方法 ,心脏电…