小鼠病毒性心肌损伤模型制作及cTnI基因扩增与测序分析

目的:分析心肌型肌钙蛋白(cTnI) mRNA在监测病毒性心肌损伤发生与发展过程中的价值。方 法:于BALB/c小鼠腹腔接种1×108TCID50柯萨奇病毒B3(CVB3)诱发心肌损伤,分别在CVB3感染后第3、6、9、 12、15、18和21天采集外周血后处死小鼠,留取鼠心脏作病理组织学检查,以逆转录 聚合酶链反应(RT PCR)分 析心肌和外周血中cTnI基因及测序分析扩增片段。结果:CVB3感染后,鼠心肌组织及循环血中cTnI mRNA均 表达增加,且与心肌细胞肿胀、炎性细胞浸润、核固缩及碎裂、变性、坏死、钙化等组织学改变相关。cTnI mRNA 基因扩增,心肌组织全数阳性;外周血阳性率在对照组及感染后的第3、6、9、12、15、18和21天分别为0、0、0、 16.7%、40%、71.4%、83.3%和87.5%。测序分析证实从心肌组织及外周血中扩增基因片段与原序列完全一致。 结论:病毒性心肌损伤时cTnI mRNA上调表达并释放入血,循环血cTnI mRNA为监测心肌损伤发生与发展的 灵敏标志物。     

心肌肌钙蛋白Ⅰ与心肌损伤

<正> 急性心肌损伤是威胁人类生命的主要疾病之一,人们一直在探索和寻求对其诊断灵敏度高、特异性好的指标.最近几年来关于心肌结构蛋白的研究初步表明:心肌肌钙蛋白I(cTnI)是心脏特异性抗原,当心肌细胞损伤时,在血中出现的时间早,持续时间长,因而引起了研究者的广泛兴趣.     

病毒性心肌炎细胞感染模型的建立及实验研究

目的：建立病毒性心肌炎细胞感染模型。方法：以柯萨奇B1病毒感染原代培养的乳鼠心肌细胞，镜下观察心肌细胞搏动次数、细胞病变、测定DNA含量及MTT活细胞染色。结果：采用差速贴壁法获得的活心肌细胞数〉90％（台盼蓝染色），心肌细胞多核、多形性特征明显（HE染色）；感染CVB324小时后，心肌搏动频率紊乱，感染48小时至一周后心肌搏动次数明显减少（P〈0．01），随后肌丝断裂，细胞圆缩、脱落，细胞病变程度与MTT染色OD值呈明显负相关。细胞周期分析显示细胞受阻于G1期，有凋亡峰出现。结论：乳鼠心肌细胞原代培养及CVB3感染方法的建立，可作为研究病毒性心肌炎药物筛选和治疗的重要体外模型。     

柯萨奇B3m病毒致T-2毒素染毒鼠心肌损伤的病理观察

目的：观察T－2毒素染毒小鼠感染柯萨奇B3m病毒（CVB3m）后心肌损伤的特点。方法：BALB／C小鼠随机分成4组，病毒组腹腔接种病毒液；毒素＋病毒组接种病毒前T－2毒素隔日灌胃，3周后腹腔接种与病毒组同等剂量的病毒液;毒素组单纯T－2毒素隔日灌胃；对照组生理盐水灌胃，腹腔接种1640营养液。观察各组小鼠心肌光镜、普通电镜、酶学电镜改变以及心肌病毒核酸持续感染情况。结果：毒素＋病毒组心肌损伤明显重于病毒组和毒素组，病灶纤维化明显，可见结缔组织增生、瘢痕形成。线粒体空泡变明显，酶活性产物严重脱失。结论：T－2毒素梁毒小鼠感染CVB3m后，心肌病变加重，心肌出现慢性损伤。     

低硒小鼠柯萨奇B组病毒重叠感染与心肌损伤关系的研究

目的 探讨Se缺乏、CVB4、CVB3m重叠感染与心肌损伤的关系。方法 采用低Se及相对低蛋白合成饲料、饮用含Se元素水与不含硒的水的方法,饲养小鼠及其所产的幼鼠,于出生7d,幼鼠先后感染CVB4,CVB3m,2型病毒感染间隔为7d,感染CVB3m病毒后7、14、21d分别处死小鼠,取心脏做光镜、电镜检测。结果 Se缺乏组小鼠,心肌可见轻度损伤,心肌细胞色素氧化酶活力下降。病毒感染7d后,低Se 病毒组小鼠与补Se 病毒组小鼠比较,低硒病毒组血清CVB3m抗体效价1:256,补硒病毒组中和抗体效价为1:512,低硒组感染病毒的毒力增加,心肌中病毒分离滴度低硒组明显高于补硒组,心肌细胞色素氧化进一步下降,心肌损伤检出率达63.6%,心肌变性坏死的数量多,损伤面积大。结论 Se缺乏是克山病心肌损害因素之一,而柯萨奇B组2型病毒重叠感染在克山病心肌损伤过程中的作用也不能忽视。硒具有某种程度的抗病毒作用或抑病毒作用。     

柯萨奇B3m病毒致小鼠急性心肌损伤的双向凝胶电泳分析

目的建立双向凝胶电泳体系分析柯萨奇B3m病毒(CVB3m)致小鼠急性心肌损伤过程中的蛋白质组差异,探讨CVB3m致心肌损伤的机制。方法分别提取感染CVB3m第0,4,8及21天的BALB/C鼠心肌组织总蛋白,采取固相pH梯度双向凝胶电泳技术分离总蛋白,用Image Master软件进行图像分析。结果心肌组织总蛋白平均抽提浓度为13.9 g/L;获得正常小鼠和急性CVB3m感染鼠不同感染时期(第4,8和21天)心肌组织双向电泳凝胶图谱,图像分析4块胶平均蛋白点数为(792±32)个,匹配率为61.25%±6.25%。随机选定不同感染时期的8个差异表达的蛋白质点,得到了表观相对分子质量和表观等电点等一系列数据。结论获得了CVB3m致小鼠急性心肌损伤的双向凝胶电泳图谱,建立了该模型的蛋白质双向凝胶电泳数据库,有利于该病毒引起小鼠心肌损伤机制的进一步研究。     

柯萨奇B组病毒感染在Ⅰ型糖尿病中的艇

环境因素特别是柯萨奇Ｂ组病毒（ＣＢＶ）感染在Ⅰ型糖尿病发生中起重要作用。Ⅰ型糖尿病发病年龄和季节变化相似于ＣＢＶ感染；Ⅰ型糖尿病患者血清ＣＢＶＩｇＭ及ＲＮＡ阳性率高于对照组，且妊娠期ＣＢＶ感染增加其子女发病危险性。已从Ⅰ型糖尿病病人的胰腺中分离至ＣＢ３Ｖ和ＣＢ４Ｖ，人源的ＣＢ４ＶＥ２株接种易感小鼠可引起糖尿病。ＣＢＶ感染体外培养的人胰腺β细胞可出现其功能改变和胰岛素分泌降低。胰岛β细胞破坏可能是由     

心肌肌钙蛋白Ⅰ对体外循环心内直视手术心肌损伤的判定价值

目的探讨心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTn Ⅰ)对体外循环心内直视手术心肌损伤的判定价值.方法40例心脏瓣膜置换手术病人随机分为两组,冷晶体停跳液组(A组),温血停跳液组(B组),每组20例,分别于圈手术期多时点采取中心静脉血,测定血清cTn Ⅰ、心肌肌酸激酶(CK)及其心肌肌酸激酶同工酶(CK-MB).结果术前两组的cTn Ⅰ、CK及CK-MB水平均在正常范围,开放主动脉后1 h至术后24 h达峰值,其后缓慢下降.术后24 h、48 h B组cTnⅠ水平明显低于A组(P＜0.05),CK-MB在开放主动脉后1 h B组低于A组.cTn Ⅰ峰值浓度与主动脉阻断时间呈直线正相关.结论cTn Ⅰ判定心内直视手术围手术期心肌损伤的敏感性及特异性明显优于OK、CK-MB,对围手术期心肌缺血损伤的诊断、预后及心肌保护效果的评价具有重要的临床价值.     

血清心肌肌钙蛋白Ⅰ判断病毒性心肌炎炎性损伤及预后的探讨

目的探讨心肌肌钙蛋白I(cTnI)判断急性病毒性心肌炎炎性损伤程度及预后。方法采用抗人cTnI单抗,应用酶联免疫法测定52例急性病毒性心肌炎患者血清cTnI,同时作肌酸磷酸激酶及其同工酶(CK,CK-MB)检测,血清cTnI>7μg／L为阳性。第1次cTnI阳性者第2次复查仍然阳性者归入cTnI持续阳性组(18例),复查cTnI阴性者归入cTnI阴性组(20例)。结果cTnI阴性组与cTnI持续阳性组临床症状好转率、心律失常治愈率比较均有极显著性差异(P<0．01)。cTnI持续阳性组中,有2例患者发展为心肌炎后心肌病。52例急性病毒性心肌炎患者中第1次检测cTnI有38例患者cTnI阳性(73．1％),有3例CK-MB异常(5．8％)。cTnI持续阳性组柯萨奇B病毒中和抗体转阴率明显低于cTnI阴性组,两者比较P<0．05。结论cTnI可作为急性病毒性心肌炎炎性损伤及预后判断的指标。     

心肌肌钙蛋白Ⅰ基因的克隆及真核表达

目的 克隆并表达人心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnI)cDNA,为高效获得大量蛋白、制备抗体打下基础.方法 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和分子生物学技术克隆人cTnI基因,重组构建pcDNA3-cTnI真核表达载体,转染人胚肾(HEK)293细胞,并用单克隆抗体检测特异性cTnI蛋白表达.结果 克隆了cTnI的全长基因,构建了pcDNA3-cTnI真核表达载体并成功地在真核细胞中获得了蛋白表达.结论 所表达的蛋白证明具有正确的cTnI免疫原性,为规模化制备cTnI蛋白奠定了基础.     

穿孔素在慢性心肌损伤中的表达及其意义

目的：探讨穿孔素在阿萨奇病毒B组3型（CVB3m)至T－2毒素染毒小鼠心肌损伤中的表达及其意义,方法：实验组BALB／C小鼠1．0mg/kg体重T－2毒素隔日灌胃,3周后腹腔接种0．1ml内含1000TCID50的CVB3m病毒液,对照组生理盐水灌胃,腹腔接种0．1ml 1640营养液,观察心肌病理改变,同时用RTPCR技术对心肌组织中CVB3m RNA和穿孔素mRNA表达进行检测,结果：CVB3m感染T－2毒素染毒小鼠心肌出现慢性损伤,可见纤维结缔组织增生和坏死灶癜痕修复。心肌组织中持续表达CVB34m RNA和穿孔素mRNA。结论CVB3m RNA和穿孔素mRNA的持续表达可能是CVB3m致T－2毒素染毒小鼠心肌慢性损伤的机制之一。     

柯萨奇B3m病毒致低硒低维生素E鼠心肌损伤的实验研究

目的 探讨柯萨奇（CV）B3m感染低Se低VE鼠心肌损伤的发病特点。方法 1周龄乳鼠分别给予低Se低VE和补Se常VE饲料喂养,4周后腹腔接种病毒,对照组接种等量PRMI1640培养液,7d后处死,光镜下观察心肌的病理改变。结果 CVB3m感染的Se和VE均缺乏鼠的心肌病变检出率为93．3％,病变为多发性大面积灶状坏死,融合成片,炎性细胞较少浸润,与急性克山病的病理改变类似;而补Se常VE组仅见散发间质炎性灶,面积较小,伴有大量的炎细胞,检出率为16．7％。结论 低硒低维生素E状态下,柯萨奇病毒B3m可显著加重小鼠的心肌损伤。     

柯萨奇B2病毒致低硒乳鼠心肌损伤的实验研究

目的：探讨柯萨奇B2病毒（CVB2）在低硒足蛋白条件下对乳鼠心肌损伤的作用。方法：应用低硒合成饲料（硒含量0．016mg/kg）喂养昆明鼠5周后交配，取其子代7日龄乳鼠经腹腔注入CVB210^7TCID500.1ml,9d后处死，取其心脏。常规石蜡包埋、切片、HE染色光镜检查；部分心肌做电镜观察。结果：低硒、补硒合成饲料感染病毒组鼠光镜下心肌病检出率分别为44．1％和15．7％，低硒和补硒对照组均未检出病变。结论：足蛋白条件下硒缺乏仍可增强CVB2病毒对昆明乳 鼠的致病作用。     

射频消融后心脏肌钙蛋白Ⅰ测定与心肌损伤的关系

采用固相层析免疫分析技术对31例因阵发性室上性心动过速、房性心动过速及室性心动过速接受射频消融（RFCA）治疗者测定其术后血清心脏肌钙蛋白I（cTnI）。结果显示，RFCA术后cTnI弱阳性率51．61％、阳性率16．13％；cTnI阳性组累积放电能量（19411．94±2251．74W／s）明显高于cTnI阴性组（8601．11±1791．88W／s）（P＜0．01）；心室放电组cTnI阳性率（88．2％）明显高于心房放电组（42．8％）（P＜0．05）。提示RFCA对心肌有轻微损伤，影响其损伤程度的因素有累积放电能量和放电部位。     

病毒性心肌炎小鼠心肌与骨骼肌细胞线粒体损伤及其相关性

目的探讨病毒性心肌炎（VMC）小鼠心肌与骨骼肌细胞线粒体损伤（线粒体膜磷脂脱失和线粒体DNA3867缺失）程度及二者的相关性。方法50只BALB/c小鼠随机分为2组,实验组（40只）腹腔注射内含柯萨奇B3病毒（Coxsackievirus B3,CVB3,TCID50=108）的Eagle液制备VMC小鼠模型,另10只为对照组。分别于病毒感染后3、11和24 d行心肌和骨骼肌细胞线粒体膜磷脂脱失程度和mtDNA3867缺失率的测定,并用Spearman法对其进行相关分析。结果实验组小鼠在病毒感染后3 d,可见心肌和骨骼肌细胞mtDNA3867缺失率显著高于对照组（P<0.05）,而线粒体膜磷脂脱失程度与对照组相比无显著性差异;病毒感染后11 d,心肌和骨骼肌细胞mtDNA3867缺失性损伤达高峰（P<0.05）,线粒体膜磷脂脱失程度亦显著高于对照组（P<0.05）;病毒感染后24 d,心肌和骨骼肌细胞线粒体膜磷脂脱失和mtDNA3867缺失程度与感染后11 d组比较无显著性差异,但与对照组和病毒感染后3 d组比较,仍有显著性差异（P<0.05）。线粒体的上述损伤性改变在心肌和骨骼肌细胞呈一致性同步变化,且具有良好相关性（P<0.05）。结论CVB3可显著损伤心肌和骨骼肌线粒体DNA和膜磷脂,两者损伤具有相关性,提示骨骼肌有望成为反映心肌细胞线粒体损伤的外周细胞“窗口”。     

肌钙蛋白Ⅰ与柯萨奇病毒特异抗体对病毒性心肌炎的临床价值

分别用固相免疫层析法和ELISA方法动态测定病毒性心肌炎组（VM,n=102）、病毒感染组（VI,n=41）和对照组（n=46）的血清肌钙蛋白Ⅰ（cTnⅠ）和柯萨奇病毒特异性抗体（CBV－IgM、IgG）。结果①VM组cTnI阳性率70.58%,其中急性期阳性率达到87.93%,明显高于普通心肌酶CK、CK－MB和LDH的15.69%（P＜0.01）,而VI组与对照组无1例出现cTnI或心肌酶阳性。②VM组CBV－IgM阳性率（67.65%0明显高于VI组（17.07%）,P＜0.05。③在VM组中,IgM阳性者的cTmI阳性率（73.91%）明显高于IgG阳性者的cTnI阳性率（43.75%）,P＜0.01;cTnI阳性者中IgM阳性率（83.33%）,也明显高于IgG阳性率（41.67%）,P＜0.01;而VM组中cTnI阴性者IgM阳性率（30.00%）明显低于IgG阳性率（60.00%）,P＜0.05。说明cTnI对VM的心肌损伤具有良好的敏感性、特异性和准确性,明显优于普通心肌酶,对VM急性期心肌损伤的敏感性更高。测定CBV－IgM、IgG有助于VM常见病因和病期的诊断。cTnI和CBV-Ig联合测定可使VM的诊断变得简单和成熟。     

两种基因检测方法在病毒性心肌炎诊断中的应用

目的:阐明基因检测手段在病毒性心肌炎(VMC)病原诊断中的作用。方法:采用RT-PCR、地高辛标记CBV3 -cDNA探针对PCR扩增产物进行斑点杂交,检测血标本中的柯萨奇病毒B组病毒(CBV)。结果:RT-PCR阳性检出率:心肌炎组为48.33%.对照组4.41%(P<0.01)。斑点杂交阳性率:心肌炎组为51.67%,对照组4.41% (P<0.01)。检测CBV的两种方法阳性率无显著差异(P>0.05)。结论:两种方法特异性均高,敏感性无显著差异。     

柯萨奇病毒B4''致低硒鼠心肌损伤的实验研究

目的 探讨柯萨奇病毒B4‘致低硒鼠心肌损伤的特点。方法 用补硒和低硒饲料分别喂养昆明鼠4周后交配，给其子代雄性鼠（出生后4周）腹腔接种柯萨奇病毒B4‘0.1ml,对照组接种等量RPMI1640培养液。观察各组鼠的心肌光镜结果，全血中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）活性和肝脏组织中脂质过氧化物酶（LPO）含量。结果 低硒和补硒饲料病毒组的心肌病变检出率分别为78.1%和16.7%，低硒和补硒饲料对照组的心肌未见病变。低硒组全血中GSH-PX活性明显降低，LPO含量明显增高。结论 低硒可以使柯萨奇病毒B4‘致昆明鼠心肌损伤加重。     

柯萨奇B组病毒感染在Ⅰ型糖尿病中的作用

环境因素特别是柯萨奇Ｂ组病毒（ＣＢＶ）感染在Ⅰ型糖尿病发生中起重要作用。Ⅰ型糖尿病发病年龄和季节变化相似于ＣＢＶ感染；Ⅰ型糖尿病患者血清ＣＢＶＩｇＭ及ＲＮＡ阳性率高于对照组，且妊娠期ＣＢＶ感染增加其子女发病危险性。已从Ⅰ型糖尿病病人的胰腺中分离到ＣＢ３Ｖ和ＣＢ４Ｖ，人源的ＣＢ４ＶＥ２株接种易感小鼠可引起糖尿病。ＣＢＶ感染体外培养的人胰腺β细胞可出现其功能改变和胰岛素分泌降低。胰岛β细胞破坏可能是由病毒直接损坏或间接诱发的自身免疫机制及超抗原机制所引起也与β细胞凋亡相关     

柯萨奇病毒B3m重复感染致病毒性心肌炎的心脏形态学改变

目的探讨柯萨奇病毒B3m(CVB3m)重复感染致病毒性心肌炎的心脏形态学改变。方法用梯度倍增法连续4次经腹腔注射CVB3m病毒液感染昆明小鼠,分别于末次感染后10、30、60d处死动物,HE和VG染色观察心肌病变和纤维增生情况;免疫组化法检测心肌中Ⅰ、Ⅲ型胶原。结果(1)HE染色显示末次感染后10d心肌损伤严重,30d时仍可见小灶坏死,60d时未检出心肌的炎性损伤。(2)VG染色表明末次感染后10d心肌即出现较弱的胶原染色,30d时胶原明显可见,60d时心肌组织的胶原显著增加,心肌组织血管周围胶原面积(PCVA)和心肌胶原容积分数(CVF)均显著增加。(3)心肌胶原的免疫组化进一步显示心肌胶原的增加以Ⅰ型为主,Ⅲ型胶原在末次感染后10、30d未见表达,60d时表达量亦较少,而Ⅰ型胶原的表达与胶原染色结果基本一致。结论CVB3m重复感染可导致心肌纤维化和心室重构,使室壁僵硬而影响心脏的收缩和舒张功能,是心力衰竭发生的重要原因之一。