多伞阿魏简单重复序列区间-聚合酶链反应体系的建立和优化

目的:建立并优化多伞阿魏简单重复序列区间(ISSR)-聚合酶链反应(PCR)体系。方法:通过单因素试验确定影响多伞阿魏ISSR-PCR扩增结果的Mg2+、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶、DNA模板最佳水平范围。对Mg2+、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA进行5因素4水平的正交试验,优选最佳ISSR-PCR体系条件。ISSR-PCR扩增结果用SPSS 18.0统计软件分析。结果:不同水平的因素对PCR均有明显影响,其中Mg2+、dNTPs、引物影响最大。多伞阿魏ISSR-PCR最佳反应体系为:在50μl的反应体系中含有10×Taq Buffer 5μl、Mg2+2.0 mmol/L、dNTPs 0.4 mmol/L、引物0.4μmol/L、Taq DNA聚合酶1.75 u/50μl、DNA模板0.25 ng/μl。在此基础上,从100条引物中筛选出15条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物。结论:建立的多伞阿魏ISSR-PCR体系具有较高的稳定性和重现性,可为进一步利用ISSR技术进行多伞阿魏遗传多样性分析、不同种源鉴定及亲缘关系分析提供基础。     

正交优化乙醛脱氢酶2基因多态性PCR体系

目的建立通用的ALDH2基因PCR反应体系,筛选出各反应因素的最佳水平。方法采用正交设计L16（4^5）在4个水平5个因素（Taq酶、引物、Mg2＋,dNTP和模板DNA）对ALDH2基因PCR反应体系进行实验,两次结果分别用统计软件MINITAB进行分析,利用梯度PCR晦定引物最佳退火温度。结果ALDH2基因PCR反应的最佳反应条件为：为25止体系中包含：Mg（25mM）2．5μL、dNTPs（2．5mM）2．0μL、引物上游和引物下游各（2．5pNI）3．00L、模板DNA3．0μL、10×PCRbuffer2．5μL、Taq酶1．5U,退火温度为60℃。结论这一通用PCR反应条件的建立为实现ALDH2基因多态性检测建立了基础。     

玄参ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为了建立稳定的玄参ISSR-PCR反应体系,本试验采用5因素(dNTPs、Taq DNA聚合酶、MgCl2、引物及模板)5水平正交设计筛选PCR体系,并利用单因子梯度进一步优化反应体系各因素浓度和扩增程序(退火温度、延伸时间和循环次数)。结果表明:在20μl反应体系中含10×buffer,0.3 mmol/L dNTPs,0.5~1.0 UTaq DNA聚合酶,2.0 mmol/L MgCl2,0.2μmol/L引物,150 ng模板,扩增效果最好。PCR扩增程序:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,50~61℃退火(退火温度随引物不同而变化)45 s,72℃延伸1 min,35个循环;72℃延伸7 min。从而建立了适合玄参的ISSR-PCR反应体系,为采用ISSR-PCR分子标记技术研究参种质资源遗传多样性提供了技术依据。     

九眼独活基因组DNA提取、ISSR反应体系优化及引物筛选

目的探讨九眼独活基因组DNA提取方法、ISSR反应体系优化及引物筛选,为研究九眼独活居群遗传多样性及原药材DNA鉴定奠定基础。方法采用改良的CTAB法与常规CTAB法对九眼独活的基因组进行提取,通过紫外、电泳、PCR-ISSR检测方法进行比较。结果实验表明,改良的CTAB法得到的DNA浓度和纯度较高,并可很好地应用于ISSR分子标记分析;以Mg2+、dNTP、引物和聚合酶建立L9(34)正交设计,并同时考察退火温度和模板浓度,建立适宜的25μLISSR-PCR体系为:模板30ng,Mg2+3.5mmol.L-1,dNTP0.6mmol.L-1,引物0.4μmol.L-1,Taq酶1U。结论以此体系为基础进行引物筛选,在40条ISSR引物中筛选出13条扩增条带清晰、多态性较高、重复性好的引物。     

当归简单重复序列区间-聚合酶链反应体系的建立及优化与品种(系)间遗传关系研究

目的:建立并优化当归简单重复序列区间(ISSR)-聚合酶链反应(PCR)体系并对6个当归品种(系)的遗传关系进行研究。方法:以ISSR-PCR扩增结果为指标,Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶活性、dNTPs浓度、引物浓度、DNA模板用量为5因素,通过正交、单因素试验优化ISSR-PCR体系。应用优化体系对6个不同品种(系)的当归样本进行遗传关系分析。结果:当归ISSR-PCR最佳反应体系为在20μl反应体系中含Mg2+(10×PCR Buffer)1.5 mmol/L、TaqDNA聚合酶0.6 U、dNTPs 0.375 mmol/L、引物0.3μmol/L、DNA模板42 ng。6个当归品种(系)的多态性位点百分率为13.04%,Nei’s基因多样性指数为0.058 0,Shannon多样性指数为0.082 7。结论:建立的当归ISSR-PCR体系可用于当归分子遗传学研究,6个当归品种(系)间遗传差异较小。     

红花随机扩增多态性DNA反应体系的建立与优化

目的：考察不同因素对红花随机扩增多态性DNA反应体系的影响，建立并优化反应体系。方法：提取红花基因组DNA，分别设计Taq酶浓度（三水平：0．02、0．04、0．06U／μL）、dNTP浓度（三水平：0．10、0．20、0．30mmol／L）和引物（primer）浓度（三水平；0．16、0．32、0．48pmol／L）的三因素实验，进行PCR扩增。根据PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图确定最优的Taq酶浓度、dNTP浓度和引物浓度。进一步没计Mg^2＋浓度（三水平：1．0、1．5、2．0mmol／L）和模板浓度（四水平：1．00、1．25、1．50、1．75mg／L）的两因素实验，进行PCR扩增，确定最佳Mg^2＋浓度和模板浓度。结果：三因素实验中，第17条组合泳道和两因素实验中第6条组合泳道扩增主带稳定、均匀、清晰，条带数日多。结论：确定红花随机扩增多态性DNA反应25μL反应体系中最佳组合为：Taq酶0．04 U／μL、dNTP0．30mmol／L、引物0．32pmol／L、Mg^2＋ 1．5mmol／L、模板浓度1．00mg／L。     

红花cDNA相关序列扩增多态性的扩增体系优化

目的：建立一种适合以红花cDNA为模板进行相关序列扩增多态性（SRAP）扩增的体系,筛选最佳的SRAP-PCR反应条件。方法：提取红花RNA并反转录成cDNA,以此为模板,使用正交设计表设计PCR反应中的3个重要因素Taq酶、三磷酸脱氧核苷（dNTPs）、引物的反应浓度。随后设计Mg^2＋的反应浓度以及模板含量,分别进行单因素试验。结果：本研究建立的红花cDNA-SRAP扩增条件为：25μL反应体系中含模板cDNA 20 ng,1×PCR缓冲液2.5 mmol/L,Mg^2＋2.0 mmol/L,Taq DNA聚合酶0.04 U/μL,dNTPs 0.2 mmol/L,引物0.2μmol/L。优化后扩增结果稳定性好,条带清晰,多态性好。结论：该体系为红花功能基因的研究奠定了基础。     

仙茅随机扩增多态性DNA反应体系的优化

目的:对仙茅随机扩增多态性DNA(RAPD)反应体系进行优化筛选。方法:以仙茅基因组DNA为模板,通过单因子试验就RAPD反应体系中主要参数(Mg2+、dNTP、引物、模板、TaqDNA聚合酶)对扩增结果的影响进行研究,并找出各自的最适条件。结果:建立了适合仙茅RAPD分析的反应体系,即25μL反应体系中各组分的最适浓度分别为:1×PCRbuffer、2.0mmol·L-1Mg2+、200μmol·L-1dNTP、40ng引物、20ng模板、1IUTaqDNA聚合酶。结论:利用此优化反应体系对仙茅进行RAPD-PCR扩增,可得到清晰的图谱,证实了该体系稳定、可靠。     

福建道地药材枇杷叶ISSR反应体系的建立与优化

目的 建立适于福建产枇杷叶的ISSR分析的PCR反应体系,筛选适宜引物,并确定最佳退火温度。方法 改良的CTAB法提取嫩叶中DNA,通过单因子实验分别找出合适的ISSR-PCR反应条件,利用梯度PCR确定引物最佳退火温度。结果 适于枇杷叶ISSR最佳的反应体系为：总反应体积为25 μL,其中模板DNA 60 ng,Taq DNA聚合酶0.9 U,引物浓度0.4 μmol·L^-1,dNTP浓度200 μmol·L^-1,10×Buffer(含Mg²⁺) 2.5 μL,加入灭菌去离子水至25 μL。扩增程序为：预变性94 ℃ 7 min,变性94 ℃ l min,复性最佳退火温度1 min,延伸72 ℃ 1 min,35个循环,72 ℃延伸10 min。在100条引物中筛选出14条扩增条带清晰且条带数目较多的引物,最佳退火温度为48~58 ℃(因引物不同而异)。 结论 建立了枇杷叶ISSR最佳反应体系,筛选出14条引物并确定了最佳退火温度,为应用ISSR技术鉴定枇杷叶的种质资源和遗传多样性研究奠定了基础。     

中麻黄ISSR—PCR反应体系的建立和优化

目的：建立适用于中麻黄的简单重复序列区间．聚合酶链反应（ISSR—PCR）最佳反应体系。方法：以凝胶成像系统下特异谱带特征为评价指标,以Mg2＋、dNTPs、TaqDNA聚合酶、引物和DNA模板为考察因素,采用L16（4^5）正交试验优选条件;通过单因素试验对反应体系中各种影响因素进行筛选。结果：中麻黄ISSR-PCR最佳反应体系（20p1）为30ngDNA模板、0．25mmol／LdNTPs、2．0mmol／LMg2＋（10xPCRBuffer）、0．4μmol／LISSR引物、1．5UTaqDNA聚合酶;并筛选出了12条ISSR-PCR引物的最佳退火温度。结论：所建中麻黄ISSR—PCR反应体系经过10份中麻黄材料检验证明该体系稳定可靠,可用于中麻黄遗传分析。