C2C12成肌细胞体外诱导分化为肌管的实验

 摘 要： 【目的】 观察低浓度马血清体外诱导成肌细胞C 2C 12向成熟肌细胞分化、形成肌管的作用，探索定向诱导肌分化的途径及其分子机制。【方法】 将C 2C 12成肌细胞用含不同浓度马血清的高糖DMEM培养基培养，收集细胞，在相差显微镜下观察形态变化，并通过免疫细胞化学（Imminocytochemistry，ICC）及RT-PCR方法分别检测肌性相关基因表达的改变。【结果】 ①20 mL/L和50 mL/L的马血清均能促使C 2C 12细胞形成肌小管，20 mL/L浓度马血清诱导效率最好（第7天时肌小管形成率分别为31．4％ ± 2．1％和19．0％ ± 1．6％，P<0．001）。②20 mL/L马血清诱导3～4 d开始有肌管形成，之后肌管越来越多，到8～9 d达高峰（第9天40．2％ ± 1．3％），往后细胞逐渐衰老死亡。③20 mL/L马血清诱导C 2C 12细胞向成熟肌细胞分化过程中，肌相关蛋白分子表达发生变化：结蛋白（desmin）、成肌分化抗原（MyoD）、生肌素（myogenin）和肌球蛋白（myosin）等表达逐渐增强（未刺激时分别约为49．6％ ± 1．1％、23．4％ ± 1．1％、4．8％ ± 1．6％和2．6％ ± 1．5％；第6天时分别提高为80．4％ ± 1．8％、85．4％ ± 1．1％、22．2％ ± 1．1％和26．0％ ± 1．6％；P<0．001）；desmin、MyoD和myogenin相应的mRNA分子也可以通过RT-PCR检测到。【结论】 ①低浓度的马血清能够有效刺激C 2C 12成肌细胞向成熟细胞分化，以20 mL/L浓度效果最好；②C 2C 12细胞是研究肌细胞发育分化的理想模板；③肌分化发育过程比较复杂，许多因素都可能起影响，研究设计要尽量标准化。     

胚胎大鼠脊髓运动神经元与C2C12肌管体外共培养体系的建立

目的 获得胚胎大鼠脊髓运动神经元与C2C12肌管共培养的条件,在体外建立稳定的神经-肌肉共培养体系,并形成功能性的神经肌肉接头。方法 C2C12 成肌细胞株体外扩增培养至60%～70%融合时,用分化培养液诱导分化; 取孕15～16 d 的SD 大鼠,提取胚胎大鼠脊髓前角运动神经元细胞,种植到分化5 d的C2C12肌管细胞中,在神经元基础无血清培养液Neurobasal+2% B27中共培养。倒置显微镜下观察各个阶段神经元形态及突起长度的变化、肌管形态变化及收缩特性、神经肌肉接头的形成,应用免疫荧光染色技术检测突触后膜乙酰胆碱受体(acetylcholine receptor,AChR)特异性结合物α-银环蛇毒素(α-bungarotoxin,α-BTX),并采用屏幕录像技术记录共培养体系中肌肉收缩现象。结果 在共培养体系中,原代脊髓运动神经元与C2C12肌管细胞均能存活并进一步分化成熟。3 d时,可见运动神经元伸出的轴突延伸至肌管膜表面或包绕肌管; 1周时,肌管按同一方向排列,出现广泛的节律性收缩,同时免疫荧光染色结果显示α-BTX特异性结合突触后膜AChR; 共培养10 d 后,运动神经元开始凋亡,肌管细胞逐渐出现萎缩现象。结论 在体外培养条件下,无需特殊培养基和各种营养因子,运动神经元和骨骼肌细胞即可共同生存、生长并进一步发育,建立突触连接,触发一系列神经肌肉接头信号转导,引发肌管节律性收缩。     

MicroRNA-125b介导棕榈酸诱导的C2C12肌管细胞胰岛素抵抗

目的:探讨microRNA-125b(miR125-b)在棕榈酸诱导C2C12肌管细胞胰岛素抵抗中的作用与机制.方法:C2C12成肌细胞常规方法分化为C2C12肌管细胞;棕榈酸诱导C2C12肌管细胞胰岛素抵抗;定量RT-PCR检测mRNA表达;免疫印迹检测蛋白表达.结果:①棕榈酸诱导C2C12肌管细胞胰岛素抵抗,伴有m...     

慢性电刺激对成肌分化的C2C12细胞肌型转换的影响

目的研究钙调神经磷酸酶(calcineurin,CaN)在低频复合生理频率慢性电刺激(chronic electrical stimula-tion with lower physiological frequency,CESLPF)对骨骼肌细胞肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MHC)亚型表达的影响。方法以体外2%马血清诱导小鼠成肌母细胞C2C12成肌分化为模型。实验分3组:对照组、CsA组和KN93组。对照组为正常分化的细胞;CsA组和KN93组在细胞诱导分化3 d后,分别用CaN抑制剂环孢菌素A(CsA,8μmol)、Ca2+/钙调蛋白依赖的蛋白激酶(CaMK)抑制剂KN93(6μmol)单一或联合CESLPF(10+40 Hz,1.5 h/d,共2 d)处理。通过RT-PCR、Western blot检测观察成肌分化过程中肌球蛋白重链亚型的表达水平及其转换情况,采用比色法检测CaN的活性。结果在成功构建的体外成肌分化模型上发现,CsA和KN93能够抑制C2C12细胞MHCⅠ的mRNA及蛋白的表达。与分化对照组MHCⅠmRNA相对表达量(0.79±0.04)相比,CsA组(0.62±0.03)和KN93组(0.69±0.05)能够抑制C2C12细胞MHC I型纤维的表达(与对照组比P<0.05);对照组、CsA和KN93处理组MHC I蛋白相对水平分别是(0.91±0.05)、(0.36±0.01)和(0.66±0.02)。对照组MHCⅡb相对表达量为(0.53±0.01),CsA(0.63±0.02)和KN93(0.75±0.03)促进MHCⅡb型纤维的表达(与对照组比较,P<0.05);CESLPF能够逆转上述改变(与对照组比较,P>0.05)。CsA能够抑制CaN的活性表达;CESLPF能够显著提高CaN活性(P<0.05),但仍显著低于正常水平(P<0.05)。结论 CaN和CaMK是骨骼肌细胞MHCⅡ型向MHCⅠ型转变的重要调控酶,CESLPF可能是经CaN通路和非CaN通路联合作用促进肌型转换,该结果为临床应用CESLPF治疗OSAS提供了实验依据。     

不同参数电刺激神经对C纤维的效应

本实验室曾在辣椒素选择性阻断大鼠坐骨神经C纤维传导后,观察到:电针(100 Hz,0.3或0.1 ms,3 mA)“足三里”和“昆仑”或“三阴交”穴,仍可抑制伤害性热刺激大鼠尾部引起的甩尾反应(范少光等,生理科学1986;6:332)及伤害性电刺激大鼠后爪在脊髓背角引起的广动力范围神经元长潜伏期放电(包虹等,针刺研究1991;16:120)。上述结果表明,电针的镇痛作用与C纤维关系不大。为分析本室电针是否已达兴奋C纤维的强度,进行了以下实验。 实验用雄性300～350 g Wistar大鼠,水合氯醛麻醉,三碘季铵酚制动,人工呼吸,维持肛温在37～38℃。选择0.1ms和0.3 ms波宽,分别以3、2及1     

不同强度电刺激诱发丘脑激活的功能磁共振成像

目的:采用功能磁共振成像技术(functional magnetic resonance imaging,fMRI)研究受试者在不同强度电刺激作用下丘脑各亚区的激活规律,探讨该区参与痛觉调控的机制.方法:对10名健康右利手志愿者分别施加1倍痛阈、2倍痛阈、3倍痛阈3个不同强度的电刺激任务,同期采用GE 1.5T超导型磁共振扫描系统进行全脑fMRI扫描.应用功能性神经图像分析(analysis of functional neuroimages,AFNI)软件包对原始数据进行后处理以获得丘脑活动的脑功能图像.结果:双侧丘脑外侧部的激活信号与刺激强度基本呈线性正相关,提示该区可能与痛觉的感觉辨别方面有关;双侧丘脑内侧部的激活信号(BOLD信号)与刺激强度类似于指数关系,提示该区可能参与痛觉的注意与情绪活动.同时,在相同强度电刺激作用下,对侧丘脑外侧部的激活信号均强于同侧丘脑外侧部,表现出对侧优势现象,而双侧丘脑内侧部则缺乏此表现.结论:丘脑应为痛觉调控网络中的重要组成部分,该区表现出分离性激活现象,各亚区均有各自独特的刺激反应特性,这有助于了解丘脑在处理痛觉信息时所发挥的作用.     

短链脂肪酸对C2C12小鼠骨骼肌细胞AMPK的作用研究

目的:探讨短链脂肪酸对C2C12小鼠骨骼肌细胞AMPK的作用。方法:分别用不同浓度的乙酸钠、丙酸钠和丁酸钠孵育C2C12细胞24 h,MTS试验检测细胞活力,Western blot检测AMPK磷酸化水平。结果:与对照组相比,1 mmol/L和4 mmol/L乙酸钠,4 mmol/L丙酸钠以及4 mmol/L、8 mmol/L和16 mmol/L丁酸钠升高AMPK磷酸化水平,但不影响其总蛋白水平。结论:短链脂肪酸激活C2C12小鼠骨骼肌细胞AMPK。     

NR4A1对毒胡萝卜素诱导C2C12肌管细胞糖代谢功能障碍的影响

目的 探讨NR4A1对毒胡萝卜素(TG)诱导小鼠C2C12肌管细胞糖代谢功能障碍的影响及机制。方法 体外诱导C2C12细胞分化为成熟肌管细胞,将加入20 nmol/L胰岛素刺激10 min的细胞标记为胰岛素组,未做特殊处理的细胞标记为对照组,采用Western blotting法检测磷酯酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路、NR4A1蛋白水平。采用CCK8法检测TG浓度梯度处理的C2C12肌管细胞活力,建立糖代谢损伤细胞模型。将C2C12肌管细胞分为对照组、无水乙醇(EtOH)组、TG组,分别处理后加入胰岛素刺激,采用葡萄糖试剂盒检测葡萄糖消耗水平,采用Western blotting法检测NR4A1、p-PI3K、p-AKT蛋白表达。采用慢病毒感染并筛选,获得对照与稳定过表达NR4A1的C2C12肌管细胞,并进行TG处理,分为Ad-NC组、Ad-NC+EtOH组、Ad-NC+TG组和Ad-NR4A1+TG组。分化成熟后加入胰岛素刺激,检测葡萄糖消耗水平,检测NR4A1、p-PI3K、p-AKT的表达。结果 与对照组相比,胰岛素组C2C12肌管细胞PI3K/AKT通...     

氧化应激对C2C12肌原细胞中KLF4表达的影响

目的:观察心肌细胞氧化应激反应对KLF4表达的影响.方法:采用过氧化氢处理的小鼠C2C12肌原细胞模拟相应的氧化应激细胞模型;采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测C2C12肌原细胞中KLF4 mRNA的表达情况;采用蛋白免疫印迹技术(Western blot)检测KLF4蛋白的表达情况.结果:不同浓度H2O2处理C2C12肌原细胞12 h后,KLF4 mRNA和蛋白的表达水平均明显增多,呈剂量依赖性;1 mM H2O2处理肌原细胞不同时间后KLF4 mRNA和蛋白的表达水平均明显增加,具有时间依赖性.结论:细胞氧化应激反应能显著诱导C2C12肌原细胞中KLF4的高表达.     

羟基肉桂酸对HepG2和C2C12细胞糖脂代谢的调节作用

目的 研究羟基肉桂酸对HepG2细胞脂质堆积和葡萄糖消耗及C2C12细胞葡萄糖摄取的调节作用及其机制.方法 利用油酸诱导HepG2细胞建立脂质堆积模型,通过油红O染色法观察不同浓度羟基肉桂酸对脂质堆积的作用,并检测细胞内总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)含量;同时,采用MTT法检测羟基肉桂酸对细胞活力的影响;通过葡萄糖消耗实验和葡萄糖摄取实验检测羟基肉桂酸对细胞葡萄糖利用的影响;采用实时荧光定量PCR技术分析糖脂代谢关键基因的表达.结果 羟基肉桂酸能够显著抑制油酸诱导的HepG2细胞脂质堆积,同时降低细胞中TC和TG含量;羟基肉桂酸还能够显著增强细胞对葡萄糖的消耗,促进葡萄糖的摄取,显著降低固醇调节元件结合蛋白-1a、-1c、-2和脂肪酸合酶,乙酰辅酶A羧化酶和3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶的mRNA表达水平,同时升高过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)的表达.结论羟基肉桂酸具有调节细胞糖脂代谢的作用,能够改善HepG2细胞中的脂质堆积,并且显著提高葡萄糖的利用率.其作用机制可能与激活PPAR等关键基因的表达有关.     

不同强度热休克预处理对氧化应激所致乳鼠心肌细胞损伤的影响

目的:探讨不同强度热休克预处理对氧化应激所致体外培养的乳鼠心肌细胞损伤的影响.方法:用热休克预处理原代培养的乳鼠心肌细胞,向心肌细胞中加入终浓度为0.5 mmol/L的过氧化氢(H20:),以模拟氧化应激造成心肌细胞损伤.将心肌细胞分为5组:对照组(Ctrl组)、H2O2损伤组(H2O2组)、低强度热休克预处理(42℃,15 min,恢复12 h) H2O2组(HSR15 min H2O2组)、中等强度热休克预处理(HSR45 min) H2O2组和高强度热休克预处(HSR90 min) H2O2组.四甲基偶氮唑盐(MTT)法观察处理后各组细胞的活力;流式细胞仪测定细胞凋亡率;检测各组培养液中乳酸脱氢酶(LDH)含量.细胞中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量.结果:与Ctrl组比较,H2O2组的细胞活力和SOD活性都明显降低(P<0.01),而细胞凋亡率、LDH和MDA含量明显增高(P<0.01);与H2O2组比较,HSR15 min H2O2组和HSR45min H2O2组的细胞活力和SOD活性明显增高(P<0.01),而细胞凋亡率、LDH和MDA含量明显降低(P<0.01),HSR90 min H2O2组与H2O2组无明显差异(P>0.05);与HSR45 min H2O2组比较,HSR15 min H2O2组和HSR90 min H2O2组的细胞活力和SOD活性明显降低(P<0.01).而细胞凋亡率和MDA含量明显增高(P<0.01),LDH也明显增高(P<0.05或P<0.01).结论:热休克预处理能减轻过氧化氢所致体外培养的新生大鼠心肌细胞损伤,且不同强度热休克预处理对心肌细胞的保护作用不同.     

安定导致小鼠大脑的线粒体氧应激损伤

目的 探讨安定对大脑神经元产生毒副作用的分子机制。方法以１０ ｍｇ／ｋｇ·ｂ．Ｗ安定给小鼠进行腹腔注射,连续 ３ｄ后,取相同质量的大脑进行线粒体蛋白的分离,进行有关ＭｎＳＯＤ和细胞色素氧化酶ＩＶ活性以及线粒体ＤＮＡ断裂 程度等指标的测定。结果（１）安定导致小鼠大脑的线粒体蛋白含量降低,线粒体蛋白含量从（３．３０７±０．２４０）mg／ml下降到 （２．７４６±０．４５１）mg/ml（ｔ=２．６９０,０．０１＜Ｐ＜０．０５）;（２）安定引起神经元线粒体的ＭｎＳＯＤ活性从（７５.４６±６．６３）Ｕ／ｍｇ下降到 （５５．３０±３．８３）Ｕ／ｍｇ（ｔ＝６．４４８, Ｐ＜０．０１）;（３）安定对细胞色素氧化酶具有显著的损伤作用,５５０nm处细胞色素吸收值从 （０．１１２±０．００８）下降到 ０．０６９±０．００８（t＝８．７８２, Ｐ＜０.０１）;（４）安定能导致小鼠大脑的线粒体ＤＮＡ大量断裂。在碱裂解过程 中,０°Ｃ条件下,ＤＮＡ双链的百分比从（９２．９５±２．８２）％下降到（７９．５３±２．３３）％（ｔ=８．４６６,Ｐ＜０.０１）;在 １５℃作用１ｈ,ＤＮＡ双 链的百分比从（７７．４５±３．４９）％下降到（４３．１５±６．１）％（ｔ＝１３．８１７     

高热预处理对PC12细胞氧化应激损伤的保护作用

目的 探讨高热预处理（HPC）对过氧化氢（H2O2）所致大鼠嗜铬细胞瘤株（PC12）细胞氧化应激损伤的影响。方法 体外培养PC12细胞,将细胞分为正常对照组、HPC组、H2O2组、HPC＋H2O2组,采用MTT法测定细胞活力,乳酸脱氢酶（LDH）检测细胞损伤,流式细胞术分析细胞凋亡。结果 与正常对照组相比,H2O2组引起PC12细胞MTT活力明显下降（P〈0．01）,LDH释放量增多（P〈0．01）,凋亡明显;而与H2O2处理组相比,HPC＋H2O2组则表现为MTT活力升高（P〈0．05）,LDH释放量减少（P〈0．05）,且没有出现明显凋亡。结论 高热预处理对H2O2所致PC12细胞氧化应激损伤产生保护作用。     

栀子苷对氧化应激所致H9C2心肌细胞损伤的保护作用机制研究

目的探讨栀子苷(GE)对H9C2心肌细胞氧化应激损伤的保护作用及机制。方法研究于2016年12月—2017年9月在武汉大学心血管病研究所进行。采用过氧化氢(H_2O_2)建立H9C2细胞氧化应激损伤模型。将细胞分为3组:PBS组、H_2O_2组以及H_2O_2+GE组,分别给予磷酸缓冲盐溶液(PBS)、H_2O_2(200μmol/L)、H_2O_2+GE(100μmol/L),刺激后继续培养24 h。检测各组内超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性,丙二醛(MDA)、活性氧簇(ROS)水平,检测Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(KEAP1)/核因子E2相关因子2(Nrf2)通路及其下游的血红素加氧酶-1(HO-1)和SOD-1的mRNA水平,CCK-8检测细胞存活率,原位末端缺口标记法(TUNEL)检测细胞凋亡。结果 H_2O_2处理后,H9C2心肌细胞内SOD和GSH-Px的活性下降,与H_2O_2组比较,H_2O_2+GE组细胞SOD和GSH-Px活性增加;H_2O_2处理可导致H9C2心肌细胞MDA水平明显升高,栀子苷可抑制这种脂质过氧化产物的产生;H_2O_2可诱导H9c2细胞ROS的产生,栀子苷处理后ROS的水平显著下降。H_2O_2刺激细胞后,KEAP1转录水平上升,Nrf2、HO-1、SOD-1转录水平下降;栀子苷处理后,KEAP1转录水平下降、Nrf2、HO-1、SOD-1转录水平回升;栀子苷明显升高细胞存活率,减轻细胞凋亡。结论栀子苷可通过激活KEAP1/Nrf2通路抑制H_2O_2引起的心肌细胞的氧化损伤。     

Smurf1拮抗BMP-2对C2C12细胞的诱导成骨作用

目的研究Smad泛素化调节因子1（Smurf1）对基因重组人骨形态发生蛋白2（rhBMP-2）诱导成骨作用的影响。方法通过将质粒pcDEF3-Smurf1临时转染C2C12细胞并应用实时PCR和Western免疫印迹法鉴定其表达Smurf1，空载体pcDNA3．1作为阴性对照；然后用比色法测定细胞碱性磷酸酶活性和实时PCR分析细胞碱性磷酸酶、骨钙素、成骨转录因子Osterix基因表达，观察Smurf1对rhBMP-2诱导C2C12细胞向成骨细胞分化的影响。同时在相差显微镜下观察细胞形态的变化。结果Smurf1在C2C12细胞可以通过临时转染获得很好的表达。尽管在细胞形态上没有明显的差别，但Smurf1转染的C2C12细胞在rhBMP-2作用48h后，细胞碱性磷酸酶活性以及细胞碱性磷酸酶、骨钙素、成骨转录因子Osterix基因表达均较对照组明显下降。结论Smurf1在BMP诱导成骨过程中发挥着负性调节作用。