利用反义技术抑制人乳头瘤病毒18 E6/E7的表达及其对宫颈癌HeLa细胞增殖凋亡的影响

目的 构建人乳头瘤病毒（HPV）18型E6／E7反义荧光真核表达载体,研究其对宫颈癌HeLa细胞增殖凋亡的影响。方法 以PCR法扩增HPV18型E6／E7区716bp片段并反向克隆到荧光真核表达载体pEGFP-C1,构建重组体pEGFP-HPV18E6E7as（EGFP-18AS）并转染人宫颈癌HeLa细胞。利用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）和Western印迹技术检测转染后E6、E7基因在mRNA和蛋白水平的变化;用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法检测转染后细胞的的增殖活性;用流式细胞仪检测转染后细胞的凋亡率;荧光显微镜下观察凋亡细胞的形态学改变。结果 转染EGFP-18AS重组体后,HeLa细胞中E6、E7基因的mRNA表达和蛋白合成均明显下调;细胞增殖受到抑制;流式显示细胞G1期明显阻滞;同时在荧光显微镜下经Hoechst染色凋亡细胞出现染色质凝集、边集、碎裂等形态学改变。结论 重组质粒pEGFP—HPV18E6E7as能有效地抑制人宫颈癌HeLa细胞的生长和增殖,诱导其凋亡,证明了反义RNA技术的有效性,为宫颈癌的基因治疗提供了一种新的可能的途径。     

MTA1基因对宫颈癌细胞HeLa侵袭转移的影响

目的 探索MTA1基因与宫颈癌细胞HeLa侵袭迁移能力的关系.方法 以脂质体LipofectamineTM2000介导的方法将含有MTA1全长基因的质粒pEGFP-C1/MTA1转染HeLa细胞,应用Western blotting检测转染效果,细胞黏附实验检测细胞黏附能力,细胞划痕实验检测细胞迁移能力的变化,Transwell小室侵袭实验检测细胞侵袭能力的变化.结果 MTA1质粒转染的宫颈癌HeLa细胞中,MTA1蛋白的表达、黏附能力、迁移及侵袭能力均明显高于转染空载体组及未转染组(P<0.05).结论 MTA1基因与宫颈癌细胞的侵袭迁移能力有关,MTA1基因可能成为宫颈癌治疗的一个新的靶点.     

MTAl基因对宫颈癌细胞HeLa侵袭转移的影响

目的探索MTAl基因与宫颈癌细胞HeLa侵袭迁移能力的关系。方法以脂质体LipofectamineTM2000介导的方法将含有MTAl全长基因的质粒pEGFP—C1／MTAl转染HeLa细胞,应用Westernblotting检测转染效果,细胞黏附实验检测细胞黏附能力,细胞划痕实验检测细胞迁移能力的变化,Transwell小室侵袭实验检测细胞侵袭能力的变化。结果MTAl质粒转染的宫颈癌HeLa细胞中,MTAl蛋白的表达、黏附能力、迁移及侵袭能力均明显高于转染空载体组及未转染组（P〈0．05）.结论MTAl基因与宫颈癌细胞的侵袭迁移能力有关,MTAl基因可能成为宫颈癌治疗的一个新的靶点。     

人乳头瘤病毒16型E2蛋白真核载体的构建与表达

目的构建人乳头瘤病毒16型（HPV16）E2蛋白真核载体,为研究其基因疫苗免疫活性奠定实验基础。方法 PCR扩增HPV16 E2基因片段,将其连接到真核表达载体pcDNA3.1（＋）,双酶切及测序鉴定。将质粒pcDNA3.1（＋）与pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2分别转染HeLa细胞,RT-PCR鉴定E2基因在HeLa细胞中的表达。结果 HPV16 E2基因片段插入到pcDNA3.1（＋）相同酶切位点,即构建了真核表达载体pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2;转染pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2的细胞,检测到HPV16 E2 mRNA。结论构建的真核表达载体pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2能在HeLa细胞内有效表达。     

DJ⁃1通过促进EMT进程增强辐照诱导下食管鳞癌细胞的侵袭性

目的：探究敲低DJ?1/PARK7表达及联合辐照对食管鳞癌细胞迁移和侵袭能力的影响及分子机制。方法：利用短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）稳定转染食管鳞癌细胞kyse150和kyse450,敲低DJ?1表达。Western blot检测细胞转染效率。Transwell迁移实验检测梯度辐照（0、4、6、8 Gy）下食管鳞癌细胞的迁移能力。将转染空病毒的对照组（shRNA?Control）与 DJ?1敲低组（shRNA?DJ?1）细胞进行 6 Gy X线辐照,细胞划痕实验及Transwell迁移侵袭实验检测各组食管鳞癌细胞迁移和侵袭能力。Western blot检测上皮细胞?间充质转化（epithelial?mesenchymal transition,EMT）途径相关蛋白上皮型钙黏蛋白（E?cadherin）、神经型钙黏蛋白（N?cadherin）、基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2,MMP2）的表达变化。结果：敲低DJ?1后,食管鳞癌细胞kyse150和kyse450内DJ?1蛋白表达水平明显降低。Transwell迁移实验显示,6 Gy剂量辐照诱导食管鳞癌细胞kyse150和kyse450的迁移能力最强。细胞划痕实验及Transwell迁移侵袭实验显示,在6 Gy辐照条件下敲低DJ?1后kyse150和kyse450细胞迁移和侵袭能力减弱。Western blot显示,敲低DJ?1联合辐照后E?cadherin表达上升,N?cadherin表达下降,MMP2表达下降。结论：敲低DJ?1表达可以降低辐照诱导的食管鳞癌细胞kyse150和kyse450的迁移和侵袭能力,其机制可能与通过上调E?cadherin、下调N?cadherin和MMP2蛋白表达从而抑制细胞EMT进程有关。     

人乳头瘤病毒16型E5对人宫颈癌SiHa细胞恶性潜能的影响及其机制探讨

目的 通过构建和筛选持续表达HPV16E5的细胞SiHa/16E5,探讨HPV16E5对宫颈癌SiHa细胞的作用及机理.方法 利用pEGFP-C1构建HPV16型E5的正义全长真核表达载体并稳定转染SiHa细胞;利用RT-PCR和Western印迹技术检测转染前后E5和P21基因的mRNA和GFP+E5和P21蛋白的变化;利用MTT法检测SiHa细胞稳定转染后的增殖活性;利用软琼脂克隆形成和裸鼠成瘤实验分别在体内外验证了SiHa/16E5细胞的致瘤情况.结果 稳定转染携带.HPV16全长E5基因的质粒后,SiHa细胞中E5基因的mRNA和相应蛋白表达明显升高,而P21的表达则明显下调;MTT结果 显示稳定转染后细胞的增殖活性与转染空载体细胞和未转染细胞比较明显增高(P<0.05);软琼脂克隆形成结果 示:SiHa/16ES细胞组的可隆形成数为33.4±1.6,与空质粒对照组细胞(15.1±3.1)及未转染组细胞(16.3±2.5)比较差异有统计学意义(P<0.05);裸鼠成瘤实验结果 显示,4个实验组在共20 d的观察中,SiHa/16E5组裸鼠成瘤明显快于其他3个对照组(P<0.05).结论 HPV16 E5可降低宫颈癌SiHa细胞中P21的表达,加强宫颈癌SiHa细胞增殖和成瘤效应.     

幽门螺杆菌感染对胃癌细胞株恶性转化的影响及机制研究

目的 探讨幽门螺杆菌感染对胃癌细胞株恶性转化的影响并探讨其可能的机制。 方法 将胃癌AGS细胞分为细胞毒素相关基因A (CagA)质粒组(转染pCDNA3.1-CagA质粒)和阴性对照组(转染pCDNA3.1空白质粒)以及CagA质粒组(转染pCDNA3.1-CagA质粒和pEGFP-C1空白质粒)、CagA+程序化细胞死亡因子4(PDCD4)质粒组(转染pCDNA3.1-CagA质粒和pEGFP-C1-PDCD4质粒)和阴性对照组(转染pCDNA3.1空白质粒和pEGFP-C1空白质粒)。采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)进行PDCD4、Twist1、上皮细胞钙粘蛋白E (E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin) mRNA水平,采用蛋白质印迹(Western blot)法测定各组细胞PDCD4、Twist1、E-cadherin、Vimentin蛋白水平,采用transwell小室测定细胞侵袭能力。 结果 CagA质粒组Twist1 mRNA、Vimentin mRNA表达量高于阴性对照组(P<0.05),PDCD4 mRNA、E-cadherin mRNA表达量低于阴性对照组(P<0.05);CagA+PDCD4质粒组Twist1 mRNA、Vimentin mRNA表达量低于CagA质粒组(P<0.05),PDCD4 mRNA、E-cadherin mRNA表达量高于CagA质粒组(P<0.05)。CagA质粒组Twist1蛋白、Vimentin蛋白表达量高于阴性对照组(P<0.05),PDCD4蛋白、E-cadherin蛋白表达量低于阴性对照组(P<0.05);CagA+PDCD4质粒组Twist1蛋白、Vimentin蛋白表达量低于CagA质粒组(P<0.05),PDCD4蛋白、E-cadherin蛋白表达量高于CagA质粒组(P<0.05)。CagA质粒组侵袭细胞数高于阴性对照组(P<0.05),CagA+PDCD4质粒组侵袭细胞数低于CagA质粒组(P<0.05)。 结论 幽门螺杆菌感染可增加胃癌细胞的侵袭能力,其机制可能为幽门螺杆菌独立因子CagA通过抑制PDCD4表达促进胃癌细胞的上皮-间质转化。      

下调TSP1表达抑制宫颈腺癌HeLa细胞生长及促血管生成能力的研究

目的 研究调控血小板反应蛋白1 (TSP1)的表达对宫颈癌HeLa细胞增殖、迁移、凋亡、侵袭及促进内皮细胞成血管能力的影响。方法 构建表达TSP1基因的真核表达载体pcDNA3.1-TSP1及siRNA-TSP1,转染宫颈癌HeLa细胞,实验共分为TSP1基因过表达组(pcDNA3.1-TSP1转染组)、TSP1基因低表达组(siRNA-TSP1转染组)和未转染组(阴性对照组)。Real-time PCR、Western blot检测各组细胞TSP1的表达,CCK-8、划痕实验、流式细胞术、Transwell检测各组细胞生长情况,体外血管形成实验检测各组细胞促血管生成能力。结果 与阴性对照组比较,pcDNA3.1-TSP1组细胞TSP1 mRNA及蛋白表达上调,siRNA-TSP1组细胞TSP1 mRNA及蛋白表达下调,差异均有统计学意义(P<0.05);pcDNA3.1-TSP1组HeLa细胞的增殖、迁移、侵袭及体外促内皮细胞血管形成能力明显增强,差异均有统计学意义(P<0.05),但凋亡比例比较差异无统计学意义(P>0.05),而siRNA-TSP1组HeLa细胞...     

GFP-HPV16 E5融合蛋白在HeLa细胞内的表达与定位

目的 研究GFP-HPV16 E5融合蛋白在HeLa细胞内的表达与定位.方法 PCR扩增HPV16E5基因片段,将其连接到真核表达截体pEGFP-C1,双酶切及测序鉴定,构建表达截体pEGFP-C1/HPV16 E5;将质粒pEGFP-C1/HPV16 E5和pEGFP-C1分别转染HeLa细胞,在倒置荧光显微镜下现察GFP-HPV16 E5融合蛋白在HeLa细胞内的表达与定位.结果 GFP 荧光均匀分布在细胞浆和细胞核;GFP-HPV16 E5融合蛋白组荧光分布在细胞浆.结论 GFP-HPV16 E5融合蛋白能在HeLa细胞内表达且定位于细胞浆.     

钙黏蛋白家族基因CDH3通过PI3K/AKT通路影响宫颈癌肿瘤细胞的生长

目的 探究钙黏蛋白(cadherin, CDH)家族基因CDH3在宫颈癌发展中的作用。方法 从TCGA数据库获取宫颈癌患者数据,通过R软件分析在宫颈癌组织中钙黏蛋白家族基因的表达情况,筛选出表达上调的基因并与宫颈癌预后相关基因取交集,确定目的基因;收集10例宫颈癌患者手术切除的癌组织和癌旁组织,用qPCR检测样本内目的基因表达水平;通过CCK8和Transwell实验检测目的基因表达水平对宫颈癌细胞系(HeLa和C33A)的增殖、迁移和侵袭能力的影响;通过Western blot实验和KEGG通路分析研究目的基因对PI3K/Akt信号通路的影响。结果 CDH3在宫颈癌患者组织中高表达,其表达水平与宫颈癌患者的预后生存相关。qPCR结果显示CDH3在宫颈癌癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织。敲低CDH3可抑制HeLa和C33A细胞的增殖、迁移和侵袭。CDH3的敲低和过表达可分别造成宫颈癌细胞中p-PI3K、p-Akt蛋白水平降低和增加。结论 CDH3与宫颈癌的发展有关,可能通过激活PI3K/Akt信号通路促进宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭。     

顺铂通过增加HeLa人宫颈癌细胞中Nrf2入核促进细胞自噬和凋亡

目的：探讨顺铂对HeLa人宫颈癌细胞中Nrf2蛋白表达及核转位的影响,并观察细胞自噬和凋亡的变化。方法：使用不同浓度的顺铂(0、2.5、5、10μmol/L)干预HeLa人宫颈癌细胞,MTT法检测细胞活性,Transwell实验观察细胞迁移能力,mCherry-GFP-LC3B融合蛋白腺病毒转染HeLa细胞观察自噬水平的变化,流式细胞术检测细胞凋亡水平,免疫蛋白印迹检测Nrf2在细胞质和细胞核内的表达情况,免疫荧光法观察Nrf2的核转位情况。结果：与对照组相比,2.5、5、10μmol/L的顺铂均可抑制HeLa细胞的活性及细胞迁移能力(P<0.05),且随着药物浓度增高抑制作用增强(P<0.05)。与对照组相比,2.5、5、10μmol/L的顺铂均可促进HeLa细胞中LC3B的表达、细胞凋亡及Nrf2的核转位(P<0.05),降低细胞质中Nrf2的蛋白表达水平(P<0.05),并升高细胞核中Nrf2的蛋白表达水平(P<0.05)。结论：顺铂通过增加HeLa人宫颈癌细胞中Nrf2入核促进细胞自噬和细胞凋亡,并抑制细胞的活性和迁移能力。     

CDCP1基因重组慢病毒表达载体的构建及其对宫颈癌细胞增殖与迁移的影响

目的: 构建含CUB结构域包含蛋白1（CUB domain containing protein 1,CDCP1）基因的重组慢病毒表达载体,研究CDCP1蛋白对宫颈癌细胞增殖与迁移的影响。方法: 以人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）cDNA为模板,采用PCR法扩增出CDCP1基因,将其克隆至pHAGE CMV MCS IzsGreen载体中,构建重组慢病毒表达载体pHAGE-CDCP1。将重组质粒pHAGE-CDCP1以及对照质粒pHAGE分别与包装质粒psPAX2以及包膜质粒pMD2.G共转染入人胚肾上皮细胞（293 T细胞）,48 h后收集病毒悬液,并采用梯度稀释法测定病毒滴度。将重组慢病毒CDCP1感染人宫颈癌HeLa细胞,通过免疫印迹法检测CDCP1蛋白的表达,采用CCK-8实验检测过表达 CDCP1对 HeLa 细胞增殖的影响;采用划痕实验和Transwell细胞迁移实验观察过表达CDCP1对HeLa细胞迁移能力的影响。结果： 质粒双酶切鉴定以及核酸测序比对结果证实重组质粒pHAGE-CDCP1构建成功。重组pHAGE-CDCP1慢病毒感染宫颈癌HeLa细胞后细胞状态良好,CDCP1蛋白表达水平明显增加。高表达CDCP1可以显著提高HeLa 细胞的增殖和迁移能力。结论： 过表达CDCP1能够促进宫颈癌 HeLa 细胞的增殖和迁移。     

宫颈癌HeLa细胞外泌体对细胞迁移和侵袭的影响及其Wnt/β-catenin信号通路机制

目的：探讨宫颈癌HeLa细胞外泌体对细胞迁移、侵袭及Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路的影响,阐明其外泌体在宫颈癌发生发展过程中的可能作用机制。方法：取对数生长期宫颈癌HeLa细胞,采用超速离心法分离宫颈癌HeLa细胞外泌体,透射电镜下观察外泌体形态表现,Western blotting法检测外泌体标志蛋白CD63和CD81的表达,鉴定分离出来的外泌体。将HeLa细胞分为外泌体组（Exo组）和对照组,2组细胞分别用含和不含HeLa细胞外泌体的培养基培养。共聚焦显微镜下观察HeLa细胞摄取外泌体情况,其中外泌体采用PKH26荧光标记,HeLa细胞用DAPI荧光进行核染色,Transwell小室实验检测细胞侵袭能力,细胞划痕实验测定细胞迁移能力,Western blotting法检测细胞中Wnt1、β-catenin和T细胞因子4（TCF4）蛋白表达水平。结果：透射电镜下观察,HeLa细胞中分离的外泌体为是圆形或椭圆形、直径为40~100 nm的囊泡状小体,且富含CD63和CD81蛋白。共聚焦显微镜下观察,Exo组HeLa细胞膜表面有外泌体附着,而对照组HeLa细胞膜表面无外泌体附着。Transwell小室实验,Exo组HeLa细胞中侵袭细胞数明显高于对照组（t=17.894,P<0.01）。细胞划痕实验,Exo组HeLa细胞迁移距离明显长于对照组（t=9.689,P<0.01）。Western blotting法检测,与对照组比较,Exo组HeLa细胞中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白Wnt1、β-catenin和TCF4蛋白表达水平均明显升高（t=13.159,P<0.01;t=15.478,P<0.01;t=7.734,P<0.01）。结论：宫颈癌HeLa细胞来源的外泌体可促进宫颈癌细胞的侵袭和迁移能力,其机制可能与HeLa细胞来源外泌体可促进Wnt/β-catenin信号通路的激活及下游TCF4基因的表达有关。     

MiR-218在宫颈癌组织中的表达及对HeLa细胞凋亡及转移的影响

目的 探讨miR-218在宫颈癌组织中的表达,以及对宫颈癌HeLa细胞凋亡及迁移的影响。方法 采用qRT-PCR检测23 例正常子宫颈组织和114 例宫颈癌组织中miR-218 mRNA的表达,分析与临床病理特征的关系;HeLa细胞分为3组:对照组（细胞不转染）、转染空脂质体阴性对照组(NC组)和 转染miR-218类似物 (miR-218M组)。MTT检测细胞增殖;流式检测细胞凋亡;划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移; qRT-PCR和Western blot分别检测Bcl-2、Bax、NF-κB和E-cadherin mRNA和蛋白表达。结果 miR-218 mRNA在宫颈癌组织中表达下调,在宫颈癌不同病理类型、分期分级、有无淋巴结转移及间质浸润深度间表达差异有统计学意义（P Bax mRNA和蛋白表达水平上调, E-cadherin mRNA和蛋白表达上调,NF-κB mRNA和蛋白表达下调。结论 MiR-218低表达可能与宫颈癌的病理分级分期等生物学行为有关,上调miR-218表达可抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,抑制细胞侵袭转移。     

人参皂苷Rg1上调miR-298抑制胰腺癌肿瘤生长

目的 探讨人参皂苷Rg1对胰腺癌的影响及调控机制。方法 采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）检测0、2.5、5、10、20μmol/L人参皂苷Rg1对人胰腺癌细胞PANC-1细胞活力的影响,流式细胞术检测人参皂苷Rg1对PANC-1细胞凋亡的影响,Western blot检测人参皂苷Rg1对PANC-1细胞BCL-2相关X蛋白（BAX）和B淋巴细胞瘤-2蛋白（BCL2）表达的影响,Transwell实验检测人参皂苷Rg1对PANC-1细胞侵袭能力的影响,划痕实验检测人参皂苷Rg1对PANC-1细胞迁移能力的影响,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测人参皂苷Rg1对PANC-1细胞miR-298水平的影响;将胰腺癌细胞分为三组：对照组、人参皂苷Rg1组和人参皂苷Rg1+miR-298 inhibitor组,MTT检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡;Transwell检测细胞侵袭能力,划痕实验检测细胞迁移能力,Western blot检测BAX和BCL2蛋白的表达;构建胰腺癌荷瘤小鼠,进行人参皂苷Rg1处理,观察瘤体组织大小和重量变化,Western...     

雄激素受体对IgG蛋白表达及前列腺癌细胞增殖和迁移的影响

目的 研究前列腺癌细胞中雄激素受体(AR)对免疫球蛋白lgG表达的影响,及对前列腺癌细胞增殖、迁移的作用.方法 (1)Western blot检测雄激素依赖性前列腺癌细胞株LNCap与去势抵抗性前列腺癌细胞株PC-3中AR、IgG蛋白的表达;(2)AR基因(pCDNA3.1+)转染PC-3构建AR过表达的PC-3-AR细胞,沉默LNCap中AR基因表达构建LNCap-siAR细胞;Westernblot检测AR及IgG表达量;Q-PCR检测细胞株中IgG mRNA表达量;四氮甲基唑氮、细胞划痕方法检测细胞的增殖及迁移能力.结果 LNCap细胞与PC-3细胞相比较,AR高表达,IgG低表达(P＜0.05).PC-3-AR细胞lgG降低表达(P＜0.01),细胞增殖及迁移能力减弱;LNCap-siAR细胞IgG增高表达(P＜0.01),细胞增殖及迁移能力增强.结论 AR调控IgG蛋白表达呈负相关并与前列腺癌细胞增殖、迁移能力相关.     

人类乳头瘤病毒18 E7原癌蛋白对宫颈癌细胞系中组蛋白去乙酰化酶1表达的下调作用

目的研究宫颈癌中人类乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染与组蛋白去乙酰化酶1(histone deacetylase1,HDAC1)表达之间的关系。方法运用RT-PCR和Western blot方法检测3株宫颈癌细胞中HDAC1表达水平。经脂质体2000介导将含有HPV18 E7基因的重组表达质粒瞬时转染人宫颈癌C-33A细胞,运用RT-PCR和Westernblot方法检测转染后C-33A细胞中HDAC1的RNA和蛋白水平改变。结果HDAC1在C-33A细胞中表达最高,CaSki细胞中次之,HeLa细胞中最少。C-33A细胞在转染HPV18 E7基因后HDAC1表达降低。结论HDAC1表达高低可能与HPV是否感染及感染亚型有关,HPV18 E7可能直接或间接下调细胞中HDAC1表达。     

HPV16E6和E7对乳腺癌细胞侵袭能力的影响及其机制

目的探讨HPV16E6、E7和E6/E7同时稳定高表达对乳腺癌细胞MCF-7侵袭能力的影响及其机制。方法利用脂质体介导将HPV16E6、E7和全长E6/E7转染MCF-7细胞,利用Western blot检测转染后E6和E7的表达。采用Transwell实验检测MCF-7细胞侵袭能力的变化,RT-PCR法检测基质金属蛋白酶-2(MMP-2)mRNA的表达情况。结果在MCF-7-E6细胞克隆中,克隆1表达水平最高;MCF-7-E7细胞克隆中,克隆4表达水平最高;MCF-7-E6/E7细胞克隆中,克隆4表达水平最高。与MCF-7亲本和MCF-7-vect细胞比较,MCF-7-E6和MCF-7-E6/E7细胞穿过小室底膜的细胞数均显著增加(P<0.01)。在MCF-7-E6、MCF-7-E7和MCF-7-E6/E7细胞中MMP-2mRNA表达均显著增加。结论 HPV16E6和E7促进MCF-7细胞体外侵袭能力的机制之一可能是通过诱导MMP-2的表达。