不同方法制备的4型肺炎球菌多糖-白喉类毒素结合物的免疫原性比较

 目的  比较以1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸盐（1-cyano-4-dimethylamino pyridine tetrafluoroborate,CDAP）和溴化氰（cyanogen bromide,CNBr）为活化剂制备的4型肺炎球菌多糖（type 4 pneumococcal polysaccharide,PS4）-白喉类毒素（diphtheria toxoid,DT）结合物（PS4-DT）原液的免疫原性。方法  分别以CDAP或CNBr为活化剂,各制备1批PS4-DT原液,并对原液的相关质量指标进行检测。分别用2种PS4-DT原液,间隔2周皮下注射NIH小鼠3次,末次免疫1周后采集血清,用ELISA检测血清抗体水平,比较不同方法制备的2种PS4-DT原液的免疫原性。结果  2种PS4-DT原液的主要质量指标均符合相关规定的要求,结合PS4的含量分别为257.1和203.1 μg/ml。2种PS4-DT原液均可与PS4抗血清发生特异性反应。抑制ELISA检测显示,2种PS4-DT原液对PS4抗血清的抑制率均达到100%。2种PS4-DT原液免疫小鼠产生的抗PS4抗体水平相近,抗体几何平均滴度分别为970.06和844.49。 结论  不同种方法制备的2种PS4-DT原液在小鼠中的免疫原性相似,且均可诱导小鼠产生较高水平的抗体。     

19A型肺炎链球菌多糖结合物中游离多糖含量测定方法的建立

目的 建立19A型肺炎链球菌多糖(Streptococcus pneumoniae type 19A polysaccharide,19APS)结合物中游离PS含量的测定方法.方法 在一定条件下分别用1、3和5 g/L脱氧胆酸钠(sodium deoxycholate,DOC)溶液(pH7.3)沉淀不同浓度的破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT),确定不同浓度DOC沉淀载体蛋白TT的浓度范围.以1 g/L DOC分离结合19 APS(19APS-TT)和游离19APS,测定上清液中的游离PS含量,并验证该DOC沉淀法的准确度和精密度.结果 分别以1和3 g/L DOC沉淀19APS-TT时,TT浓度最好分别控制在＜150和＜200μg/ml.该DOC沉淀法的准确度和精密度均良好,加标PS回收率为94.0％～107.2％,相对标准偏差均＜4％.结论 成功建立了19APS-TT中游离PS含量的测定方法.     

CDAP活化多糖制备肺炎球菌多糖-蛋白结合物原液的稳定性评价

目的  评价以1-氰基-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸盐（1-cyano-4-dimethylamino pyridinium tetrafluoroborate,CDAP）活化多糖制备1型、9V型、19A型肺炎球菌多糖-破伤风类毒素（tetanus toxoid,TT）结合物原液的稳定性。方法 以CDAP作为活化剂,制备3个型别的多糖TT结合物原液各3批,于2~8 ℃条件下保存12个月,定期取样检测,评价其稳定性。结果  不同型别的多糖-TT结合物原液在2~8 ℃条件下保存12个月,其主要检测项目均符合质量要求,游离TT含量低于30.0%,游离蛋白含量低于5%,分配系数≤0.35的多糖回收率均>60%。结论  1型、9V型、19A型肺炎球菌荚膜多糖-TT结合物原液在本研究条件下具有良好的稳定性。     

竞争ELISA法测定19A型肺炎链球菌发酵物中的多糖含量

 目的  建立检测19A型肺炎链球菌荚膜多糖的竞争ELISA方法,检测细菌发酵过程中多糖的表达量。方法   以19A型肺炎链球菌多糖为包被物,待测多糖为竞争物,建立间接竞争ELISA方法,并验证该方法的准确性和精密度。用建立的方法检测不同培养条件下发酵物中的多糖表达量。 结果   最佳多糖包被质量浓度为10 mg/L,多糖抗血清稀释度为1：4×104。当检测范围为39.06~5 000.00 μg/L时,决定系数为0.995。批内和批间相对标准差分别为5.08%~9.58%和5.28%~12.93%。培养物样品加标回收率为95.84%~110.07%。两种不同培养条件下培养物中的多糖表达量分别为312.17 mg/L和1 056.42 mg/L。 结论  新建的方法能用于19A型肺炎链球菌发酵物中多糖表达量的检测,对于优化培养条件及掌握培养物收获时间具有指导意义。     

检测精制肺炎链球菌多糖中甲基戊糖方法的验证

目的 建立检测精制肺炎链球菌多糖中甲基戊糖的方法,并进行方法学验证.方法 将经硫酸和加热处理的精制肺炎链球菌多糖与半胱氨酸盐酸盐进行反应,分别在396 nm和430 nm波长下检测合成的化合物的吸光度值,并根据差值计算甲基戊糖含量.对建立的甲基戊糖测定法进行准确度、专属性、精密度、线性和耐用性验证.结果 该法的准确度良好,甲基戊糖加样回收率为90.2％～108.9％.该法具有较好的重复性和中间精密度,相对标准偏差分别为≤4.6％和1.2％～5.2％,均符合规定的要求.在甲基戊糖质量浓度为2～22 mg/L的检测范围,该法的标准曲线呈现良好的线性,决定系数＞0.99000.该法的专属性较好,精制肺炎链球菌多糖溶液中含有10～50 g/L乙酸钠不会对检测结果产生影响.结论 建立的甲基戊糖测定法可准确定量甲基戊糖含量,可用于对精制肺炎链球菌多糖中甲基戊糖的质量控制.     

2型肺炎链球菌多糖-破伤风类毒素结合疫苗的制备及免疫原性研究

目的 制备2型肺炎链球菌多糖(Streptococcus pneumoniae type 2 polysaccharide,SPNPS2)-破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT)结合疫苗(SPNPS2-TT),并研究其免疫原性.方法 采用溴化氰活化SPNPS2,己二酰肼作连接剂,碳二亚胺为耦联剂,将活化的SPNPS2与TT耦联制成SPNPS2-TT.以SPNPS2-TT或单纯SPNPS2免疫Balb/c小鼠,用ELISA检测小鼠血清抗SPNPS2 IgG水平.结果 SPNPS2-TT的各项指标均达到质控标准.SPNPS2-TT免疫小鼠产生的特异件抗SPNPS2 IgG水平显著高于单纯SPNPS2免疫小鼠,且SPNPS2-TT诱生了免疫记忆应答.结论 采用此项技术制备SPNPS2-TT疫苗是可行的.     

菌种筛选对1型肺炎链球菌产糖量的影响

 目的  用无动物源性培养基筛选高产糖1型肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae serotype 1,PN1）。方法  配制无动物源性培养基,并用此培养基进行高产糖PN1单菌落筛选。比较筛选前后PN1在发酵培养中的产糖量。 结果   无动物源性培养基筛选前后PN1在发酵培养中的产糖量分别为420和960 mg/L,筛选后PN1的产糖量明显高于筛选前PN1。 结论   以无动物源性培养基筛选PN1可使PN1的产糖量明显提高。     

14型肺炎球菌多糖双抗体夹心ELISA检测方法的建立

目的  建立并验证测定14型肺炎球菌多糖（pneumococcal capsular polysaccharide serotype 14,PS14）浓度的双抗体夹心ELISA。方法  采用Protein G亲和层析纯化兔血清,得到兔抗PS14多克隆抗体（多抗）。以鼠抗PS14单克隆抗体（单抗）为捕获抗体,兔抗PS14多抗为检测抗体,碱性磷酸酶标记山羊抗兔IgG为二抗,PS14为参考品建立双抗体夹心ELISA法。确定鼠抗PS14单抗和兔抗PS14多抗的工作浓度,建立标准曲线,并验证该方法的准确性、精密度和特异性,考察佐剂对该方法的影响。结果  鼠抗PS14单抗的最适工作浓度为5 μg/ml,兔抗PS14多抗的最适工作浓度为1 μg/ml,标准曲线的范围为9.375 ~ 600.000 ng/ml,线性良好,相关系数为0.999。测定多糖样品的PS14回收率为110% ~ 140%,多糖蛋白结合物样品的PS14回收率为90% ~110%。平均批内和批间精密度分别是5.64%和7.14%。13价结合物混合样品的PS14回收率为85% ~100%;含有佐剂的疫苗样品的PS14回收率为85% ~110%。结论  成功建立了双抗体夹心ELISA法,该方法准确性、精密度、特异性良好,且检测结果不受佐剂的影响,具有一定耐用性。     

苯酚提取法对A群脑膜炎球菌多糖中细菌内毒素含量的影响

目的  研究苯酚提取法对A 群脑膜炎球菌多糖料液中细菌内毒素含量的影响。方法  用苯酚对A 群脑膜炎球菌多糖料液进行提取,比较粗制多糖不同溶解倍数、苯酚提取过程中采用不同搅拌转数、提取次数、提取温度等因素对多糖细菌内毒素含量的影响。  结果  粗制多糖采用4.5%醋酸钠溶液1∶100（质量体积比）溶解后进行苯酚提取的多糖细菌内毒素含量最低。同时,综合考虑多糖料液中蛋白含量、多糖回收率的检定结果,确定用苯酚进行提取的最佳条件为搅拌转数为400 转/min,提取次数为3次,温度为13～15 ℃,可有效降低多糖料液中细菌内毒素的含量。  结论  苯酚提取法可明显降低A 群脑膜炎球菌粗制多糖料液中的细菌内毒素含量。     

23价肺炎链球菌荚膜多糖疫苗的研制

目的 研制23价肺炎链球菌荚膜多糖疫苗.方法 大罐培养1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、和33F型肺炎链球菌并进行各型荚膜多糖的纯化,制备23价肺炎链球菌荚膜多糖疫苗.结果 经检定各型精制多糖主要质量指标均符合<欧洲药典>(2005年版)要求.结论 已建立起成熟的细菌培养和多糖纯化工艺.     

CDAP活化多糖制备1型肺炎链球菌荚膜多糖-蛋白结合物原液的稳定性评价

目的 评价以1-氰基-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸盐(1-cyano-4-dimethylamino pyridinium tetrafluoroborate,CDAP)活化多糖制备的1型肺炎链球菌荚膜多糖-破伤风类毒素结合物原液的稳定性.方法 以CDAP作为活化剂,连续制备3批多糖-蛋白结合物原液,分别放置于(37±2)℃和2～8℃,定期取样检测,并评价其稳定性.结果 多糖-蛋白结合物原液在(37±2)℃条件下保存21 d,2～8℃条件下保存12个月,其主要检测指标均符合质量要求,游离多糖和游离蛋白含量分别低于30.0％和5.0％,分配系数≤0.35的多糖回收率均＞65％.结论 确定了不同条件下1型肺炎链球菌荚膜多糖-破伤风类毒素结合物原液的有效保存时间.     

23价肺炎链球菌多糖疫苗和13价肺炎链球菌结合疫苗在成年人中的应用

 肺炎链球菌是引起全球不同年龄人群,尤其是幼儿和老年人肺炎、败血症和脑膜炎等严重疾病的重要病原菌,由肺炎链球菌导致的这些疾病可以通过疫苗进行预防。在将肺炎链球菌疫苗纳入国家免疫计划的国家,儿童肺炎链球菌病的发病率以及疫苗型肺炎链球菌的携带率大大降低,且可在未免疫人群中产生间接保护作用。此文对23价肺炎链球菌多糖疫苗和13价肺炎链球菌结合疫苗在成年人中的应用进行探讨。     

肺炎球菌无动物源性成分培养工艺及纯化新工艺探索

目的:比较无动物源性成分培养基和动物源性培养基培养肺炎球菌的差异;摸索不使用有机溶剂的肺炎球菌多糖纯化新工艺。方法:用无动物源性的原料替代肺炎发酵培养基中动物源性的成分,考察菌体密度和多糖收量的变化;采用柱层析纯化工艺收获肺炎球菌多糖,测定各阶段核酸、蛋白、多糖含量。结果:与疫苗生产所采用动物源性发酵培养基相比,无动物源性发酵培养基收获的1,7F,19A型菌体密度分别提高了1倍左右;发酵液中多糖含量分别提高了48%,50%和200%;多糖收量提高了30%～90%。纯化新工艺收获的17F,18C,19F精糖,核酸和蛋白的含量均远远低于企业的注册标准,HPLC检测多糖纯度分别为99.24%,98.92%和99.02%。结论:无动物源性成分发酵培养基适合于肺炎球菌生长,不仅增加了多糖产量,也提高疫苗的安全性;纯化新工艺能够收获合格的肺炎精制多糖。     

植物蛋白胨在肺炎链球菌培养基中的应用

 目的  用植物蛋白胨替代目前肺炎链球菌（pneumococcus,Pn）培养基中的动物蛋白胨,以保证生物制品的安全性。方法   比较大豆蛋白胨与胰蛋白胨的各种成分含量。分别以大豆蛋白胨和胰蛋白胨制备培养基进行9个型Pn大罐培养,比较两种培养基培养对Pn生长和粗制多糖含量的影响。 结果   大豆蛋白胨的总氮含量、氨氮含量和消化系数与胰蛋白胨相近,但大豆蛋白胨的总碳水化合物含量（336.20 μg/g）明显高于胰蛋白胨的总碳水化合物含量（10.56 μg/g）。植物源性培养基培养获得的各型Pn浓度（t＝3.851,P<0.05）和粗制多糖含量（t=3.853,P<0.05）明显高于动物源性培养基培养。 结论   植物蛋白胨可替代动物蛋白胨来制备Pn培养基。