抑制自噬对根尖乳头干细胞成骨分化水平的影响

目的探讨抑制自噬对根尖乳头干细胞成骨分化水平的影响。方法5、10 ng/mL 肿瘤坏死因子-α（TNF-α）分别处理根尖 乳头干细胞（SCAPs）,对照组不做处理,检测自噬相关蛋白LC3-II表达水平,GFP-LC3质粒转染并检测细胞内GFP-LC3数目, 吖啶橙染色检测酸性囊泡情况。TNF-α,TNF-α+3-MA分别处理SCAPs,检测LC3-II 的表达水平,GFP-LC3 质粒转染并检测 GFP-LC3数目,CCK-8法检测细胞活力,流式细胞仪检测细胞凋亡。TNF-α、TNF-α+3-MA分别处理SCAPs,对照组不做处理, 诱导成骨向分化,qRT-PCR检测分化第3、7、14天时成骨相关基因碱性磷酸酶（ALP）、骨涎蛋白（BSP）、骨钙素（OCN）的表达。 结果TNF-α可诱导SCAPs自噬活化：TNF-α组LC3-II/β-actin水平较对照组升高且具有浓度依赖性（P<0.05）,TNF-α组GFP-LC3 数目较对照组升高且具有浓度依赖性（P<0.05）,TNF-α组酸性囊泡较对照组增多。3-MA可抑制TNF-α诱导的SCAPs自噬活 化：TNF-α+3-MA组LC3-II/β-actin水平及细胞内GFP-LC3数目较TNF-α组显著降低（P<0.05）,并下调细胞活力（P<0.05）,上调 细胞凋亡水平（P<0.05）。抑制自噬导致SCAPs成骨分化的抑制：TNF-α+3-MA组ALP、BSP表达量在分化第3、7、14 天均较 TNF-α组降低（P<0.05）,OCN的表达量在第3、7天较TNF-α组降低（P<0.05）。结论TNF-α可诱导SCAPs自噬水平的活化;自噬 可能对TNF-α作用下的SCAPs起细胞保护作用,对抗细胞凋亡;自噬的抑制将下调TNF-α作用下SCAPs的成骨向分化水平,提 示自噬在TNF-α作用下SCAPs的成骨分化过程中具有重要作用。     

ESM-1改善小鼠MSCs生物学特性的机制研究

目的 探讨内皮细胞特异性分子-1（endothelial cell-specific molecule 1,ESM-1）预处理小鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells,MSCs）后改善其生物学特性的机制。方法 通过不同浓度的ESM-1,对MSCs进行预处理,分析其分泌的细胞凋亡相关因子包括肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、肿瘤坏死因子-β（TNF-β）和干细胞生长相关因子∶缺氧诱导因子（HIF）、转化生长因子（TGF-β1）等细胞因子含量的改变情况,以明确ESM-1预处理MSCs改善其生物学特性的机制。结果 通过不同浓度的ESM-1干预MSCs后,各浓度组TNF-α、TNF-β、HIF、TGF-β1含量随着ESM-1干预浓度的升高而升高,各组之间差异有统计学意义（P=0.000）。结论 ESM-1预处理MSCs可提高与炎性反应、细胞凋亡和细胞生长分化相关的多种细胞因子的含量,可能通过多种信号转导通路改善MSCs的生物学特性。     

白介素-37抗四氯化碳诱导的小鼠肝脏炎症及机制研究

目的观察IL-37对CCL4诱导的小鼠肝脏的影响及机制。方法昆明雄性小鼠60只随机将其均分为6组,即正常对照组,模型组,空质粒A组,空质粒B组,预防组A组,治疗组B组。每组按照处死时间点（8周,12周）随机分成2小组。检测小鼠肝脏组织中的ALT及AST活力,IL-1,IL-6,TNF-α、TGF-β1表达水平。结果肝脏坏死炎症活动评分8周及12周预防组A组与模型组相比降低,差异有统计学意义（P<0. 05）。12周治疗组B组与模型组相比降低,差异有统计学意义（P<0. 05）。8周时预防组A组与模型组相比AST活力减低,差异有统计学意义（P<0. 05）;治疗组B组12周时ALT、AST活力比8周时明显降低,差异有统计学意义（P<0. 05）。肝组织IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1在8周时预防组A组与模型组相比明显降低,差异有统计学意义（P<0. 05）; 12周时,预防组A组及治疗组B组较模型组明显降低,差异有统计学意义（P<0. 05）。治疗组B组肝组织IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1水平在12周较8周显著降低,差异有统计学意义（P<0. 05）。结论 IL-37能通过降低CCL4诱导的小鼠肝脏IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1细胞因子的表达,从而对其肝脏炎症具有保护作用及潜在的抗肝纤维化作用。     

茯苓、薏苡仁与冬瓜子对肺纤维化大鼠血清TGF-β1和TNF-α浓度影响

目的通过检测肺纤维化大鼠血清中转化生长因子-β1(TGF-β1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的浓度来探讨茯苓、薏苡仁、冬瓜子治疗肺纤维化的效果及其机制。方法健康雄性Wistar大鼠72只,随机分为正常对照组、模型对照组、醋酸泼尼松组、茯苓组、薏苡仁组、冬瓜子组,每组12只。除正常对照组外,其他各组均以支气管内注射博莱霉素的方法制作肺纤维化动物模型,于造模后第2天给予相应药物干预。给药后14、28d各组均处死6只大鼠,光镜下观察大鼠肺组织病理变化情况;采集动物血清标本,ELISA法检测血清中TGF-β1、TNF-α的浓度。结果给药后14、28d,与正常对照组比较,模型对照组大鼠肺组织出现明显的肺间质纤维化,TGF-β1、TNF-α浓度均显著增高(F=181.586～488.612,q=28.253～89.142,P<0.05);与模型对照组比较,各治疗组肺纤维化明显改善,TGF-β1、TNF-α浓度显著降低(q=8.613～75.682,P<0.05);醋酸泼尼松组TGF-β1、TNF-α浓度低于茯苓组、薏苡仁组和冬瓜子组(q=3.538～12.563,P<0.05)。给药后28d,茯苓组TGF-β1、TNF-α浓度低于薏苡仁组、冬瓜子组(q=3.953～4.845,P<0.05),薏苡仁组、冬瓜子组比较差异无显著性(P>0.05)。结论茯苓、薏苡仁、冬瓜子能够减轻博莱霉素诱导的肺纤维化,其机制可能与TGF-β1及TNF-α的浓度降低有关。     

肝硬化大鼠TGF-α和TGF-β1变化及丹参素的作用

目的：探讨复合致病因素诱导的肝硬化大鼠TGF-α和TGF-β1改变及丹参素的保护作用。方法：取24只健康雄性SD大鼠,随机分为正常对照组（8只）、肝硬化组（8只）、丹参素干预组（8只）。采用复合致病因素法复制大鼠肝硬化模型,丹参素干预组采用丹参素进行干预[0.05 g/（kg·w）,每日灌胃]。于实验第8周末取材;检测血浆谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）和内毒素水平;检测血浆和肝组织匀浆中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、转化生长因子-α（TGF-α）和转化生长因子-β1（TGF-β1）水平;肝组织切片行HE染色,观察病理学变化。结果：与正常对照组相比,肝硬化组脂肪变性明显,有典型的假小叶形成;血浆ALT、AST和内毒素水平显著升高（P〈0.05）;血浆和肝组织匀浆TNF-α和TGF-β1水平也显著升高（P〈0.05）,而TGF-α水平无明显变化。与肝硬化组相比,丹参素干预组大鼠肝纤维化程度明显减轻;血浆ALT、AST和内毒素水平显著降低（P〈0.05）;血浆和肝组织匀浆TNF-α和TGF-β1水平也显著降低（P〈0.05）,而TGF-α水平显著增高（P〈0.05）。结论：在持续的肠源性内毒素作用下,TNF-α大量产生,TGF-α和TGF-β1之间失平衡,可能是复合致病因素诱导的大鼠肝硬化发病的重要机制,丹参素可以通过某种机制降低内毒素水平,减少TNF-α的产生,在一定程度上维持TGF-α和TGF-β1之间的平衡,对肝脏发挥促再生和保护作用。     

人骨髓间充质干细胞向Leydig细胞或产类固醇激素细胞体外诱导分化的研究

目的探讨体外诱导人骨髓间充质干细胞(MSCs)向睾丸Leydig细胞分化,并确定诱导条件。方法将分离培养所获得的第3代MSCs细胞经含黄体生成素(LH)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、血小板衍化生长因子(PDGF)及白介素-1α(IL-1α)的诱导液诱导,按诱导液中各因子浓度不同分为A、B、C组和对照组,分别于7d、14d、21d时观察细胞形态变化,并行3β-羟类固醇脱氢酶(3β-HSD)免疫细胞化学染色和免疫荧光染色,检测各组细胞3β-HSD的表达。以人睾酮ELISA试剂盒检测诱导细胞分泌类固醇的功能情况。结果诱导10～14d后,细胞具有Leydig细胞的形态特点;免疫细胞化学染色及免疫荧光染色显示,本研究条件下,随着诱导液中各因子浓度加大及诱导时间延长,诱导细胞3β-HSD表达阳性数和阳性率逐渐增多,以A组浓度及21d为最佳诱导浓度及时间(P<0.05),并且A组诱导21d分泌睾酮量最高(P<0.05)。结论人骨髓MSCs经体外诱导后可以分化为Leydig细胞或产类固醇细胞。     

全反式维甲酸诱导肝前体细胞向肝细胞分化的研究

目的：探讨全反式维甲酸（All-trans retinoic acid,ATRA）对肝前体细胞分化的影响。方法：取孕14.5 d胎鼠制备肝前体细胞,瞬时转染带白蛋白启动子（Albumin promoter）的荧光素酶报告质粒pALB-Luc,以便实时检测细胞的分化状态。优化ATRA诱导条件,分别于诱导后3、6、9 d收集细胞总RNA,半定量RT-PCR检测分化相关指标的变化。并于诱导后11 d用苏木精-伊红染色法观察细胞形态的改变,PAS染色观察细胞的分化成熟程度。结果：ATRA浓度为1 μmol/L时对肝前体细胞分化诱导作用最强。与对照组相比,随培养时间的延长,ATRA组分化早期指标膜蛋白（Delta like,DLK）、细胞角蛋白（Cytokeratin19,CK19）表达降低更为明显,而甲胎蛋白（Alpha fetal protein,AFP）、白蛋白（Albumin,ALB）表达更为升高。形态学观察细胞体积增大,呈多边形,核浆比率降低,相嵌紧密排列,可见双核细胞。PAS染色阳性率上升。结论：浓度1 μmol/L的ATRA对肝前体细胞分化诱导作用最强,ATRA能诱导肝前体细胞分化为类肝细胞。     

IGF-1与TGF-β1联合诱导藻酸钙-脂肪干细胞混合凝珠软骨化的研究

目的探讨以藻酸钙凝珠为载体的立体培养的兔脂肪干细胞(ADSCs),胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、转化生长因子β1(TGF-β1)共同诱导下向软骨细胞分化的作用。方法利用新西兰大白兔提取兔ADSCs培养传代并鉴定。取第3代ADSCs制成藻酸钙-脂肪干细胞混合凝珠进行立体培养并分为4组:A组(未诱导组)、B组(IGF-1诱导组)、C组(TGF-β1诱导组)、D组(TGF-β1和IGF-1联合诱导组)。连续培养3周后对细胞采用HE染色、免疫组化染色方法进行检测,对比各组之间的表达结果。结果流式细胞术的结果显示提取细胞中ADSCs的纯度>95%;HE染色结果表明细胞分化:D组>C组>B组,A组无明显变化;利用Scion Image图像分析免疫组化中Ⅱ型胶原表达量:D组>C组>B组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论以藻酸钙凝珠为载体的脂肪干细胞能定向诱导成软骨细胞,并且在立体培养TGF-β1+IGF-1两种生长因子联合诱导优于TGF-β1或IGF-1单一诱导,两者之间起协同作用。     

炎性微环境下TGF-β1通过TGF-β1/Smad3 通路促进BMSCs成骨分化

目的 研究炎性微环境下转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨分化的影响及作用机制。方法 应用肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)体外模拟炎性微环境,检测不同浓度TGF-β1对BMSC增殖活性的影响。实验分为对照组[BMSC+成骨诱导液(osteogenic medium,OM)]、实验组(BMSC+TGF-β1+OM)和抑制组[BMSC+SB431542 (TGF-β1拮抗剂)+OM]。应用ALP染色、茜素红染色、实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)及Western blot法对BMSCs成骨分化能力和TGF-β信号通路因子Smad2、Smad3进行检测并比较3组间的差异。结果 低浓度TGF-β1作用下BMSCs增殖活性较高,高浓度(50ng/ml)抑制BMSCs增殖活性;成骨诱导7天和10天时,实验组与其他两组比较,ALP染色较深、面积最大;茜素红染色结果显示,实验组体外矿化结节形成均高于其他两组;RT-qPCR检测结果显示,实验组成骨分化基因OPN、RUNX2与ALP表达均增高,TGF-β信号通路中Smad3在实验组表达最高,抑制组表达最低,差异有统计学意义(P<0.01)。Western blot法检测结果显示,实验组内OPN、RUNX2与ALP蛋白表达水平增高,差异有统计学意义(P<0.05);TGF-β信号通路中Smad3蛋白表达在3组中差异不明显,而p-Smad3在实验组中表达明显增高、抑制组中明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 炎性微环境中TGF-β1通过激活TGF-β/Smad3信号通路促进了BMSCs成骨分化。     

犬骨髓基质干细胞分离培养与向软骨样细胞诱导分化的研究

【目的】探讨犬骨髓基质干细胞的提取、分离和体外扩增的最佳条件,研究其在体外培养中定向诱导分化为软骨样细胞的可能。【方法】从幼年犬骨髓中分离基质干细胞进行培养扩增,观察其生长特性,体外应用碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）和转化生长因子β1（TGF-β1）对第3代传代细胞诱导分化,并通过细胞的染色和Ⅱ型胶原免疫组化鉴定诱导分化细胞的类型。【结果】原代培养时形成由基质干细胞组成的细胞集落融合周期约6～9d左右。第3代传代细胞经碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）和转化生长因子（TGF-β1）诱导后,传代细胞在形态上呈软骨样改变;甲苯氨蓝异染性、阿新蓝染色阳性;Ⅱ型胶原免疫组化染色呈阳性。【结论】犬骨髓基质干细胞在体外培养条件下生长良好和持续扩增,在碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）和转化生长因子（TGF-β1）作用下可被诱导分化为软骨样细胞。     

外源性NO对脂肪干细胞成软骨分化的影响

目的 通过观察不同浓度外源性一氧化氮（nitric oxide ,NO）供体硝普钠（SNP）对脂肪干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）增殖状况及相关基因表达的影响,探讨外源性NO在ADSCs成软骨分化中的作用。方法 获取并培养ADSCs,分别进行成骨和成脂诱导,采用茜素红染色和油红O染色进行多向分化鉴定。NO检测试剂盒检测ADSCs成软骨分化过程中NO的变化;采用细胞计数试剂盒-8(CCK8)法检测不同浓度SNP（0.25 mmol/L、1.00 mmol/L、4.00 mmol/L）下ADSCs的增殖情况。以Real time-PCR（RT-PCR）方法检测ADSCs在不同浓度SNP下,表达转化生长因子-β1（TGF-β1）以及成软骨分化特异基因——信号传导蛋白Smad3、 Ⅱ胶原蛋白（Col-Ⅱα1）基因的变化。结果 培养的细胞经成骨和成脂诱导后茜素红染色和油红O染色呈阳性;ADSCs成软骨分化过程中,培养上清液中NO浓度始终比对照组高（P<0.05）;与对照组相比,低浓度SNP（0.25 mmol/L、1.00 mmol/L）对ADSCs的增殖无明显影响（P>0.05）,高浓度SNP（4.00 mmol/L）抑制ADSCs增殖,差异有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR检测发现SNP能抑制ADSCs自身TGF-β1 mRNA的表达,同时抑制Smad3 mRNA和Col-Ⅱα1 mRNA的表达。结论 在ADSCs成软骨分化过程中,外源性NO可以通过抑制ADSCs自身产生TGF-β1,并且抑制TGF-β下游信号通路,从而抑制成软骨分化。     

TGF-β2和geneX对BrdU标记骨髓间充质干细胞增殖与成骨分化的作用

［摘要］ 目的　研究TGF-β2和geneX对BrdU标记的骨髓间充质干细胞增殖与成骨分化作用的影响．方法　采用全骨髓贴壁培养法分离骨髓间充质干细胞,传代并鉴定,设实验组和空白对照组,实验组分4组:A组:BrdU标记后的BMSCs组;B组:BrdU标记后的BMSCs+TGF-β2组;C组:BrdU标记后的BMSCs+geneX组;D组:BrdU标记后的BMSCs+geneX+TGF-β2组．空白对照组为BrdU标记后的单纯BMSCs加入基础培养基避光培养．诱导培养后观察骨髓间充质干细胞生长形态、检测生长动力学（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）、碱性磷酸酶（ALP）和钙定量、进行细胞Von-Kossa法染色,观察成骨分化作用．结果　（1）4组BMSCs吸光度值（OD）分析比较显示:细胞组间差异有统计学意义（P＜0.05）;（2）各组BMSCs成骨诱导后碱性磷酸酶（ALP）和钙定量检测结果显示:细胞组间差异有统计学意义（P＜0.05）;（3）进行细胞Von-Kossa法染色,D组可见大量钙结节;C组可见较多钙结节;B组可见部分钙结节;A组可见少量钙结节;空白对照组未见钙结节．结论　（1）TGF-β2可促进骨髓间充质干细胞的增殖和诱导其向成骨细胞分化;（2）geneX可促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,且在细胞因子TGF-β2联合作用下成骨分化作用更明显．     

GLP-1对非酒精性脂肪肝大鼠肝氧化应激及TNF-α、TGF-β1的影响

目的观察胰高血糖素样肽-1（GLP-1）对非酒精性脂肪肝大鼠肝氧化应激及肿瘤坏死因子α（TNF-α）、转换生长因子β1
（TGF-β1）的影响。方法雄性SD大鼠30只,随机分为3组,分别予普通饮食10只（ND组）、高脂饮食10只（HFD组）、高脂饮食
加利拉鲁肽腹腔注射10只（GLP-1组）。高脂饮食12周建立大鼠NAFLD模型,建模成功后GLP-1组予利拉鲁肽腹腔注射治疗4
周。16周末处死各组大鼠,生物化学法检测血清ALT、血清和肝组织甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）,分光光度计测定肝匀浆超
氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MAD）及FFAs,酶联免疫吸附法测定血清TGF-β1、肝匀浆TNF-α。结果与ND组比较,HFD组
大鼠体质量、肝指数、血清ALT、TG、TC、TGF-β1及肝匀浆TG、TC、MAD、FFAs 、TNF-α均明显升高（P>0.05）,肝匀浆SOD活力
明显降低（P<0.05）,肝脏脂肪变性程度和炎症活动度显著增高（P<0.05）;而与HFD组比较,GLP-1组可促进上述指标恢复（P<
0.05）。结论利拉鲁肽可以减轻高脂饮食诱导肝脂肪变,改善氧应激及脂质过氧化,降低TNF-α及TGF-β1的含量,有可能作为
治疗非酒精性脂肪肝病的有效药物。
     

脂多糖和肿瘤坏死因子α对人牙髓干细胞增殖和成骨分化的影响

目的 探讨脂多糖(LPS)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)对人牙髓干细胞(hDPSCs)增殖和分化的影响。方法 体外分离培养hDPSCs,分别用不同浓度LPS(0,0.1,1,10μg/mL)和TNF-α(0,1,10,100 ng/mL)培养细胞。培养24,48,72 h,应用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测hDPSCs增殖活性变化;培养7,14,21 d应用茜素红(AR)染色试剂盒和5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐(BCIP)/氯化硝基四氮唑蓝(NBT)碱性磷酸酯酶(ALP)显色试剂盒检测hDPSCs肉眼观AR染色变化、钙结节定量、ALP染色和ALP活性等成骨分化指标。结果 (1)CCK-8实验显示1,10,100 ng/mL TNF-α作用于hDPSCs 24,48,72 h后细胞增殖活力降低(P<0.05)。AR成骨诱导染色结果显示培养7,14 d, TNF-α各浓度组肉眼观AR染色无明显差异;培养21 d, 10 ng/mL和100 ng/mL TNF-α组矿化程度相比0 ng/mL组低(P<0.05)。ALP染色和ALP活性试剂盒分析显示诱导培养7,14,21...     

异佛莱心苷抑制四氯化碳致小鼠肝纤维化的初步研究

目的探讨异佛莱心苷对四氯化碳(carbon tetrachloride, CCl4)所致小鼠肝纤维化的抑制作用。 方法将24只C57BL6J小鼠随机分为空白对照组、肝纤维化模型组、异佛莱心苷治疗组和水飞蓟素治疗组,每组6只。肝纤维化模型组、异佛莱心苷治疗组和水飞蓟素治疗组通过腹腔注射CCl4建立肝纤维化模型,每周3次,共12周。从第6周起,异佛莱心苷治疗组小鼠每日灌胃异佛莱心苷（10 mmol/L）,水飞蓟素治疗组小鼠每日灌胃水飞蓟素100 mg/kg,连续给药6周。采集各组小鼠静脉血,血清检测丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase, ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase, AST）;肝组织做HE染色、Masson染色和天狼星红染色;组织免疫荧光检测TGF-β1的表达;ELISA法检测各组血清中TGF-β1、IL-1β、IL-6和TNF-α含量;Western印迹法检测肝脏AKT/Smad2通路变化。 结果肝纤维化模型组血清ALT和AST较空白对照组显著升高(P<0.05),异佛莱心苷治疗组和水飞蓟素治疗组小鼠血清ALT和AST均较肝纤维化模型组显著降低(P<0.05),小鼠肝重和肝重/体重也较肝纤维化模型组显著降低(P<0.05)。两组小鼠肝组织病理学形态较肝纤维化模型组有一定程度的改善。组织免疫荧光显示肝纤维化模型组TGF-β1表达较空白对照组升高;异佛莱心苷和水飞蓟素治疗后肝脏TGF-β1表达降低。异佛莱心苷治疗组和水飞蓟素治疗组炎症指标（TGF-β1、IL-1β、IL-6和TNF-α）较肝纤维化模型组显著降低(P<0.05)。Western印迹法结果显示肝纤维化后p-Smad2、Smad2和p-AKT蛋白表达显著升高(P<0.05),但异佛莱心苷治疗后肝脏组织中AKT/Smad2表达下降(P<0.05),提示该通路异常激活被抑制。 结论异佛莱心苷对小鼠肝纤维化有抑制作用,其作用机制可能与抑制炎症反应和AKT/Smad2通路有关。     

TGF-β3,HA,PTHrP对人脐带间充质干细胞成软骨分化的影响

目的探讨TGF-β3、透明质酸(hyaluronic acid, HA)、甲状旁腺激素相关蛋白(parathyroid hormone-related protein, PTHrP)对人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, HUC-MSCs)成软骨分化的影响,优化培养条件的组合方式。方法体外分离培养人脐带间充质干细胞,形态学观察,流式检测表面抗体及成脂、成骨分化鉴定。取P3代细胞,加入不同组合的细胞因子进行成软骨诱导培养,分为1～21 d TGF-β3(G1)、1～28 d TGF-β3(G2)、1～21 d TGF-β3/1～21 d HA(G3)、1～28 d TGF-β3/1～28 d HA(G4)、1～21 d TGF-β3/1～21 d HA、14～21 d PTHrP(G5)、1～28 d TGF-β3、1～28 d HA、14～28 d PTHrP(G6)、1～28 d TGF-β3、1～28 d HA、21～28 d PTHrP(G7)7组。结果诱导培养28 d和21 d相比较,TGF-β3组和TGFβ3/HA组COL2α1、COL10α1、SOX9、ACAN的表达量上升;TGFβ3/HA/PTHrP组COL2α1、SOX9、ACAN的表达量上升,COL10α1下降。培养相同天数时,TGFβ3/HA组较TGF-β3组COL2α1、SOX9、ACAN的表达量上升;TGFβ3/HA/PTHrP组同TGF-β3/HA组比较,COL2α1、ACAN、SOX9的表达量增加,COL10α1表达量下降,且PTHrP加入2周较1周效果更明显。差异均有统计学意义。HE和阿利新蓝染色结果与实时荧光定量PCR的结果一致。结论 TGF-β3、HA、 PTHrP可以不同程度的促软骨分化,其中联合应用TGF-β3,HA 28 d,在第14天时加入PTHrP一起培养,这种组合方式促进HUC-MSCs成软骨分化效果最好,且能抑制细胞肥大。     

KIF3A在单侧输尿管梗阻小鼠肾脏中的表达及意义

目的 通过研究KIF3A在单侧输尿管梗阻（UUO）小鼠和TGF-β1诱导的NRK-52E细胞中的表达情况,探讨KIF3A在肾间质纤维化中的作用。方法 将36只C57BL/6J小鼠随机分为假手术组（Sham, n=18）和单侧输尿管梗阻组（UUO, n=18）,分别于术后7、14、21 d 处死小鼠。苏木素-伊红（HE）染色、马松（Masson）三色法染色和天狼星红（Sirius Red）染色观察小鼠肾间质纤维化程度,RT-PCR、免疫组织化学（IHC）和免疫印迹（Western blot）检测小鼠肾组织KIF3A的表达和分布。免疫印迹检测小鼠肾组织KIF3A、E-cadherin 和α-SMA 蛋白的表达。TGF-β1诱导NRK-52E细胞转分化后,免疫印迹检测KIF3A、E-cadherin 、α-SMA、Wnt4和β-catenin 蛋白的表达。结果 与Sham组相比,UUO小鼠肾间质纤维化程度随着梗阻时间延长而增加,表明造模成功。同时,KIF3A mRNA和蛋白表达均增高,于21 d达到高峰,α-SMA蛋白表达显著上调,E-cadherin蛋白表达明显降低。NRK-52E细胞发生转分化时,KIF3A蛋白的表达增多（P<0.001）,同时wnt/β-catenin信号通路中Wnt4和β-catenin蛋白表达增加（P<0.05,P<0.0001）。结论 KIF3A可能通过wnt/β-catenin信号通路介导的上皮细胞-间充质转化参与肾纤维化的发生发展过程。     

旋毛虫及其虫源性蛋白对盲肠结扎穿孔诱导的小鼠脓毒症的影响

目的观察旋毛虫及其虫源性蛋白对盲肠结扎穿孔（CLP）诱导的小鼠脓毒症的影响。方法80只雄性BALB/c小鼠随机 分为假手术组、CLP组、旋毛虫肌幼虫（ML）预感染组、旋毛虫肌幼虫虫体可溶性蛋白（SMP）处理组和排泄分泌蛋白（MES）处理 组。ML预感染组于术前28 d经口感染300条旋毛虫肌幼虫,其余各组分别于术后30 min腹腔注射PBS或SMP（25 μg/只）或 MES（25 μg/只）。观察小鼠术后状态和72 h生存率,检测术后12 h小鼠血清中丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移 酶（AST）、尿素氮（BUN）和肌酐（Cr）水平及TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10、TGF-β水平,观察小鼠肝和肾组织病变。结果与假手术 组相比,CLP组72 h生存率降低,血清中ALT、AST、BUN和Cr水平及细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10和TGF-β水平均明显 升高（P<0.05）。肝中肝索排列紊乱,肝细胞水肿,肾中部分血管球皱缩,肾小管细胞水肿。与CLP组相比,ML预感染组血清中 ALT、AST、Cr、TNF-α和IL-1β水平降低,IL-10和TGF-β水平升高（P<0.05）;SMP处理组血清中ALT、AST、Cr、TNF-α和IL-1β水 平降低,TGF-β水平升高（P<0.05）;MES处理组72 h生存率明显升高,血清中ALT、AST、BUN、Cr、TNF-α、IL-6和IL-1β水平明显 降低,IL-10和TGF-β水平明显升高（P<0.05）,肝和肾组织结构损伤明显减轻。结论旋毛虫及其虫源性蛋白可减少CLP诱导的 脓毒症小鼠血清中促炎因子的释放,促进免疫调节因子的释放,其中MES效果更为显著,并能减轻肝和肾结构和功能的损伤。     

Galectin-3诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为肝样细胞

目的探索应用Galectin-3诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为肝样细胞的效果,筛选出所涉及的信号通路,并验证Hippo 信号通路。方法对大鼠股骨骨髓间充质干细胞进行提取、分离、传代培养及鉴定。取第3代细胞进行诱导培养,分为SD大鼠 BMSCs（A组）、SD大鼠BMSCs+0.5 μg/mL Gal-3（B组）、SD大鼠BMSCs+20 ng/mL HGF（C组）、SD大鼠BMSCs+0.5 μg/mL Gal-3+20 ng/mL HGF（D组）和大鼠肝细胞（E组）。分别在诱导后7、14、21、28 d进行细胞形态学观察、糖原染色观察,并行实时 定量PCR 以及Western blot 检测,鉴定其分化情况。取B组细胞行基因芯片检测。将BMSCs 与Gal-3、Gal-3+XMU-MP-1 （Hippo信号通路抑制剂）分组进行诱导,Western Blot检测YAP、P-YAP、ALB、AFP、CK-18。结果大鼠股骨骨髓分离出的细胞 符合骨髓间充质干细胞特性。诱导后,B、C、D组BMSCs形态逐渐向肝样细胞转化,D组28 d时细胞形态与肝细胞相对比相似 度最高。糖原染色28 d 时A组无染色,B、C、D组染色较前增多,B、C组间无明显差异（P>0.05）,D组染色率最高（P<0.05）。 Q-PCR检测AFP、ALB、CK-18表达逐渐升高,28 d时B组与C组各指标较接近（P<0.05）。Gal-3与HGF对AFP、ALB的mRNA 表达不存在交互效应（AFP：F=0.236, P=0.640;ALB：F=50.639, P=0.000）,对CK-18 的mRNA表达有协同效应（F=50.639, P= 0.000）。Western blot检测A组几乎不表达AFP、ALB及CK18,B、C、D组AFP、ALB及CK18蛋白表达随时间延长,逐渐增加。 基因芯片检测发现上调基因27个,下调基因62个。涉及TGF-β、PI3K-Akt及Hippo等信号通路。Gal-3及Gal-3+XMU-MP-1诱 导组的YAP表达较空白对照组增加,Gal-3+XMU-MP-1较单独应用Gal-3诱导BMSCs分化的效率高。结论Galectin-3能够单 独诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化,而且联合HGF诱导BMSCs分化的效率更高。诱导过程与TGF-β、PI3K-Akt 及 Hippo等信号通路相关。抑制Hippo信号通路可提高诱导效率。     

青蒿琥酯对转化生长因子-β1诱导的原代肺成纤维细胞分化中Notch1信号通路的影响

目的 探讨青蒿琥酯在转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的原代肺成纤维细胞分化过程中的作用及其可能机制.方法 采用酶消化法及组织贴块法提取原代肺成纤维细胞,免疫荧光检测Vimentin的表达鉴定细胞;CCK法检测青蒿琥酯半数抑制浓度(IC50),根据IC50选择药物干预浓度.无血清同步化培养细胞分为4组:对照组(无血清培养基);TGF-β1诱导组(TGF-β15 ng/mL);青蒿琥酯干预组(TGF-β1 5 ng/mL+青蒿琥酯8μg/mL);青蒿琥酯对照组(青蒿琥酯8μg/mL).培养24 h后,Masson染色检测细胞及胶原分泌情况,Western blot 检测各组Notch1、Jagged1、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达情况.结果 青蒿琥酯作用于TGF-β1诱导的原代肺成纤维细胞24 h的IC50为8.56μg/mL;Masson染色示TGF-β1诱导组胶原的表达明显高于对照组,而青蒿琥酯干预组胶原的表达较TGF-β1诱导组明显减少.在TGF-β1诱导组,与对照组比较,Notch1、Jagged1、α-SMA的表达明显升高(P＜0.05);青蒿琥酯干预组Notch1、Jagged1、α-SMA表达较TGF-β1诱导组均明显减少(P＜0.05).结论 青蒿琥酯能抑制TGF-β1诱导的原代肺成纤维细胞分化过程,其机制可能为抑制Notch信号的表达.