TaqMan荧光定量PCR法检测CHO细胞中外源基因拷贝数的方法建立

目的 以β₂-微球蛋白(B2M)为内参基因,建立一种检测CHO细胞中外源基因H拷贝数的TaqMan荧光定量PCR方法。方法 使用含有目的基因H和内参基因B2M的质粒作为标准品,分别建立目的基因H和内参基因B2M的标准曲线。提取重组CHO细胞基因组DNA,并对所提基因组中目的基因H和内参基因B2M的拷贝数同时进行q PCR检测。结果 成功建立了目的基因H和内参基因B2M的标准曲线,扩增效率分别为92.09%和94.96%。标准曲线的相关系数均在0.99以上,且具有良好的重复性。随着细胞传代的增加,目的基因的拷贝数相对稳定。结论 成功建立了TaqMan荧光定量PCR法检测CHO细胞中外源基因拷贝数的方法,该方法可用于外源基因在CHO细胞中的遗传稳定性研究。     

毕赤酵母重组子PCR模板制备方法的比较

目的比较5种用于PCR实验的毕赤酵母(Pichia pastoris)重组子基因组DNA的制备方法,以寻求一种稳定、可靠、简便的DNA模板制备方法,用于毕赤酵母重组子的分析。方法分别用酵母基因组提取试剂盒法、蜗牛酶法、煮沸法、煮-冻-煮法、微波法制备重组毕赤酵母基因组DNA模板,在相同条件下进行PCR扩增并比较其差异。结果以5种方法制备的重组酵母DNA作为模板进行PCR,其结果均可达到鉴定酵母重组子的效果,其中酵母基因组提取试剂盒法和微波法可以鉴定酵母重组子的基因表型。结论微波法所需时间短、费用低、操作简便而且结果稳定,并能够鉴定酵母重组子的基因表型,是采用毕赤酵母表达系统进行PCR鉴定时制备模板DNA的首选方法。     

实时荧光定量PCR法检测门冬氨酸鸟氨酸原料药中毕赤酵母菌DNA残留量

目的 建立可定量检测门冬氨酸鸟氨酸原料药中毕赤酵母菌DNA残留量的实时荧光定量PCR方法。方法 采用宿主细胞残留DNA样本前处理试剂盒（磁珠法）提取毕赤酵母菌DNA,利用毕赤酵母残留DNA检测试剂盒（PCR-荧光探针法）进行扩增反应,绘制标准曲线,建立毕赤酵母菌DNA残留量的Real-time PCR检测方法,并验证其准确性和精密性。结果 毕赤酵母菌DNA质量浓度在0.03~300 pg·μL^-1内线性良好（r>0.99）,定量限为0.03 pg·μL^-1;应用该法对3批门冬氨酸鸟氨酸原料药进行测定,毕赤酵母菌DNA残留量均远低于每剂10 ng。结论 该方法可用于门冬氨酸鸟氨酸原料药中毕赤酵母菌DNA残留量的定量测定。     

毕赤酵母高效电转化条件的研究

目的建立毕赤酵母的高效电转化方法,为利用毕赤酵母重组表达海洋药物功能基因提供方法基础。方法采用电穿孔的方法把外源DNA转化进毕赤酵母基因组中。通过对毕赤酵母生长状态,电击条件等影响因素进行探索。结果当采用对数生长中期的菌体制备感受态细胞、电压为1.5kV、质粒浓度为0.15g.L-1和0.2cm电转化杯时,转化效率达到最大值,为每微克质粒DNA 36个转化子。经抽样PCR鉴定所得到的转化子均为阳性克隆。结论通过对电转化各种条件的优化,获得了高效电转化技术方法。     

SYBR-Green实时定量PCR用于Vero宿主细胞DNA残留量的检测

目的:建立基于SYBR-Green荧光染料实时定量PCR检测Vero宿主细胞DNA残留量的方法。方法:提取Vero细胞基因组DNA,设计细胞基因组高度重复顺序AGMr(HindIII)-1基因片段的特异性引物,通过PCR扩增AGMr(HindIII)-1序列中一段特异性cDNA片段,克隆至pGEM-T Vector,重组质粒经酶切及测序鉴定合格后命名为pGEM-T/AGMr(HindIII)-1-S。结果:使用重组质粒和细胞基因组DNA分别作为检测标准品,均取得了良好的结果,其检测灵敏度分别达到了0.03 fg.μL-1和0.03 pg.μL-1。结论:SYBR-Green实时定量PCR可用于Vero宿主细胞DNA残留量的准确定量。     

荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒DNA的研究

目的用荧光定量PCR对HBV-DNA载量进行实验性研究。方法扩增含有3个乙肝病毒基因组pBR322质粒中的乙肝病毒目的序列,并通过AT亚克隆至pBS-T载体中。经过筛选、鉴定及测序验证保证相对更高的拷贝数。对3个保守序列进行了常规PCR退火温度的优化和灵敏度的检测,建立荧光定量PCR反应体系从而制备标准曲线。结果曲线相关系数为99.5%,具有较高的可信度。负相关范围在5×10^3-5×10^9copies/μl。不论是批内还是批间其变异系数值均小于5%。结论荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒DNA可以灵敏度好,准确度高,应加大研究降低成本应用于检验应用。     

重组rPA基因在毕赤酵母细胞中的胞内表达研究

目的构建含rPA全长基因的重组酵母胞内表达质粒pPIC9K rPA ,并在毕赤酵母中进行表达。方法用限制性内切酶BamHI和NotI将含有rPA全长基因的质粒pJZ1 6双酶切后 ,克隆至酵母表达载体pPIC9K中 ,构建酵母重组表达质粒。rPA基因经DNA序列测定准确无误。通过电穿孔法转染毕赤酵母菌GS1 1 5 ,PCR鉴定阳性酵母转化子 ,将rPA基因整合入酵母基因组DNA ,在毕赤酵母中实现了胞内非融合表达。表达产物进行SDS PAGE、Western blots以及溶纤维蛋白活性检测。结果表达产物以胞内包涵体的形式存在 ,未糖基化。SDS PAGE结果显示表达蛋白质的相对分子量约为 39kD。Western blots检测表明表达蛋白质能与单克隆抗体发生特异性反应。包涵体经 8mol L脲溶液溶解后 ,有明显的溶纤维蛋白活性。结论在毕赤酵母中成功地实现了rPA重组蛋白的胞内表达     

荧光定量PCR检测重组人干扰素α2b中宿主基因组的残留DNA

目的 采用荧光定量PCR法检测注射用重组人干扰素α2b半成品中宿主基因组的残留DNA.方法 选择重组人干扰素α2b工程菌的宿主菌23S核糖体RNA基因为模板设计扩增引物,建立基于SYBR Green Ⅰ荧光染料的荧光定量PCR检测法.结果 宿主基因组DNA的量与荧光定量反应的Ct(循环阈值)值呈良好的线性关系(r~2=0.9803).结论 所用方法操作简便、快速,可用于重组人干扰素α2b制备过程中的质量监控及半成品的检定.     

实时荧光定量PCR检测人组织因子及其剪切体方法的构建

目的建立检测人组织因子(flTF)及其剪切体(asTF)的实时荧光定量PCR检测技术。方法分别采用文献报导及自行设计的检测人flTF和asTF的引物及TaqMan探针,经优化反应体系及反应条件后,用于检测人flTF和asTF基因。将扩增的人flTF和asTF的基因片段纯化后分别与pMD19-T载体连接,分别克隆构建含flTF和asTF基因片段的重组质粒,作为实时荧光定量PCR检测flTF和asTF基因表达的标准品。结果 PCR扩增产物分别经测序证实为flTF和asTF的特异性片段。本法检测flTF和asTF基因表达的灵敏度均为40拷贝/μl,线性范围均为4.00×101~4.00×107拷贝/μl,相关系数均为1.000;扩增效率分别为flTF 91.15%,asTF 90.53%,批间变异系数分别为flTF 3.04%~9.31%,asTF 3.01%~9.64%。结论成功建立了检测人flTF和asTF的实时荧光定量PCR方法,且该方法特异性好,灵敏度高。     

人胰岛素生长因子-1基因在毕赤酵母中的表达

研究人胰岛素生长因子-1(Insulin-like growth factor-1,IGF-1)在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中的表达.用聚合酶链反应法(PCR)和基因重组技术构建重组人胰岛素生长因子毕赤酵母表达载体并在毕赤酵母中进行表达.SDS-PAGE分析和质谱测定产物分子量7.6kD和理论值相同.人胰岛素生长因子在毕赤酵母的分泌表达为今后的研究打下基础.     

猪囊尾蚴cC1亚单位疫苗毕赤酵母高表达体系的优化

目的　优化猪囊尾蚴 c C1亚单位疫苗毕赤酵母表达系统。方法　毕赤酵母转化菌在 BMMY、BMM、MM及各加 1%酪蛋白水解物 (CA)的诱导培养基中经 0 .5 %甲醇诱导表达后 ,上清液行 SDS- PAGE。结果　高拷贝毕赤酵母转化菌 SMD116 8的表达水平高于酵母转化菌 GS115 ;Mut S型比 Mut+型表达量高 ;表达水平与拷贝数呈正相关 ,即拷贝数越高 ,表达量也越高 ;在诱导培养基 BMMY中的表达水平明显高于其它诱导培养基 ;阴性对照菌未见目的表达条带。结论　猪囊尾蚴 c C1亚单位疫苗在毕赤酵母高表达系统中得到优化 ,为大量制备生产打下了基础。     

双表达盒人骨唾液酸蛋白毕赤酵母工程细胞的构建

目的构建含人骨唾液酸蛋白(hBSP)双表达盒的毕赤酵母工程细胞,为hBSP在毕赤酵母中的高效非融合分泌表达奠定基础。方法用PCR方法扩增hBSP基因,将其亚克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA中,并在此基础上构建含有双表达盒的重组pPICZαAN-2×hBSP载体,电转化毕赤酵母GS115,通过Zeocin高抗性筛选转化子并对其表型进行PCR鉴定。结果得到GS115/pPICZαAN-hBSP和GS115/pPICZαAN-2×hBSP毕赤酵母工程细胞。结论GS115/pPICZαAN-2×hBSP毕赤酵母工程细胞中含双表达盒hBSP。     

人sCR1酵母分泌型表达载体构建及其高拷贝转化子的快速筛选

目的采用酵母分泌型载体表达人可溶性补体受体1型(sCR1),研究人sCR1高拷贝重组阳性转化子的快速筛选及鉴定。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,然后将其克隆入毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k中,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9k-sCR1),经测序鉴定正确,电转化入毕赤酵母细胞SMD1168中,将经G418抗性筛选出的重组sCR1酵母细胞株进行PCR鉴定,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化。结果获得毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k-sCR1,经G418筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母细胞株,经甲醇诱导含pPIC9k-sCR1的酵母SMD1168细胞表达出重组sCR1融合蛋白。此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr约31000的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆抗体(mAb)识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白。结论人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性。     

葡激酶在毕赤酵母中的表达及纯化

目的探索葡激酶基因在毕赤酵母中的表达和纯化方法。方法根据毕赤酵母的偏性合成了葡激酶基因,克隆到分泌型酵母表达载体pPIC9K中,重组载体线性化后,转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达。应用DEAE-Sepharose FF、Q-Sepharose FF和Sephacry1 S-200凝胶过滤层析法纯化表达产物,采用溶圈法对纯化产物进行生物学活性测定。结果葡激酶在毕赤酵母中GS115的表达量约站总蛋白的45%;表达产物经DEAE-Sepharose FF、Q-Sepharose FF和SephacrylS-200纯化后纯度达到95%;测得其比活为5.2×10^4AU/mg。结论利用毕赤酵母成功进行了重组葡激酶基因的表达及其表达产物的纯化。     

人C-型利钠肽-血清白蛋白融合蛋白质的构建及在毕赤酵母中的分泌表达

目的构建重组表达人C-型利尿钠肽(CNP)-人血清白蛋白(HSA)融合蛋白质的毕赤酵母。方法重叠PCR拼接CNP(400 bp)-HSA(1 800 bp)成融合基因,双酶切后克隆至表达载体pPIC9K中。电穿孔法转染毕赤酵母菌KM71,摇瓶培养分泌表达。结果融合基因约为2 200 bp,序列测定正确。SDS-PAGE分析相对分子质量约为80 000,Western blot和RIA鉴定显示其为CNP与HSA的杂合分子。结论实现了HSA-CNP融合蛋白质在毕赤酵母中的分泌表达。     

人肠三叶因子毕赤酵母表达载体的构建与鉴定

目的构建人肠三叶因子(hITF)的毕赤酵母表达载体。方法从人结肠黏膜提取总RNA,经RT-PCR得到hITF cDNA,用PCR方法扩增hITF基因,并将其克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9中,构建含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的重组表达质粒pPIC9/hITF。结果通过酶切和基因序列分析确定插入pPIC9中的片段为hITF基因片段。结论重组质粒pPIC9/hITF的成功构建,为在真核细胞中高效表达hITF。并制备其抗体的进一步研究提供基础。     

用酵母载体pPIC9k重组构建表达sCR1

目的采用酵母细胞分泌型载体pPIC9k表达人可溶性补体受体(sCR1),研究重组人sCR1融合蛋白的体外生物学活性。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,然后将其克隆入毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k中,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9k-sCR1),经测序鉴定正确,电转化入毕赤酵母细胞SMD1168中,将经G418抗性筛选出的重组sCR1酵母细胞株进行PCR鉴定,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western Blot鉴定,通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后进行生物学活性鉴定。结果获得毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k-sCR1,经G418筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母细胞株,经甲醇诱导含pPIC9k-sCR1的酵母SMD1168细胞表达出重组sCR1融合蛋白。此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr约31000的蛋白区带,在Western Blot分析中可被sCR1的CD35单克隆单抗体(mAb)识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白及较高的生物学活性。结论人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性及其生物学活性。     

T4溶菌酶在毕赤酵母中的诱导表达及抑菌活性测定

目的利用毕赤酵母诱导表达T4溶菌酶蛋白并测定其抗菌活性。方法T4溶菌酶（T4lysozyme）基因以N端融合的方式被准确插入到质粒pPIC9K的EcoR I-Not I位点内,得到分泌型重组表达载体 pPIC9K-T4L。该载体首先经限制性内切酶Sal I酶切,进而采用电击方法将线性化的重组质粒DNA导入到毕赤酵母中。经过梯度筛选得到多个单拷贝和多拷贝转化重组子。随机挑取部分重组子PCR扩增阳性克隆,经菌体培养和甲醇诱导后获得了分泌表达,表达产物存在于培养上清液中。结果表达蛋白经琼脂孔扩散抗菌实验显示抑菌圈明显;重组蛋白对金黄色葡萄球菌与肺炎链球菌均具有显著抑制作用;多拷贝与单拷贝重组表达子没有抗菌活性差异与蛋白表达量的差异;加热煮沸对于T4溶菌酶蛋白的抗菌活性无明显影响。结论T4溶菌酶在毕赤酵母中得以成功诱导与表达;表达产物不受拷贝数影响并具热稳定性。     

N-糖基化IL-24的表达及体外诱导肿瘤细胞凋亡的研究

目的构建IL-24基因的真核表达载体,在毕赤酵母GS115中高效表达,研究重组N-糖基化IL-24蛋白体外诱导肿瘤细胞凋亡的活性。方法借助过渡质粒α/pUC18,将IL-24基因插入到质粒pPIC9K的BamHⅠ和EcoRⅠ之间,构建重组质粒IL-24/pPIC9K,转化毕赤酵母GS115分泌表达,Tricine-SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白,ELISA检测蛋白表达量,糖苷酶PNGaseF分析IL-24糖基化形式和程度。MTT法和形态学分析重组IL-24诱导MCF-7乳腺癌细胞凋亡的活性。结果成功构建重组表达质粒IL-24/pPIC9K,IL-24在毕赤酵母最高表达量为(81.31±14.46)mg·L-1。约70%的IL-24发生了N-糖基化。重组IL-24诱导MCF-7乳腺癌细胞凋亡,对正常人肺成纤维细胞NHLF没有影响。N-糖基化IL-24对MCF-7抑制率约高于去糖基化IL-24。结论毕赤酵母分泌形式的表达和适度的糖基化修饰都有利于目的蛋白IL-24的生物学活性,为后续的研究提供基础。