特发性弱精子症精浆蛋白差异表达研究

目的 探讨精浆蛋白在成年男性特发性弱精子症中的差异表达情况.方法 纳入2017年1-5月我院泌尿外科门诊特发性弱精子症患者15例作为试验组,年龄24 ～ 47岁.同时,纳入精液正常成年男性15例作为对照组,年龄21 ～ 44岁.用等重同位素多标签相对定量蛋白质组学(isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ) 的方法研究成年男性正常精浆蛋白以及特发性弱精子症患者的精浆蛋白表达情况.结果 共发现精浆中2 784个蛋白质.其中,与正常组相比,特发性弱精子症患者精浆中表达上调蛋白数为14个,精浆中表达下调蛋白数为79个(表达差异倍数> 1. 2倍,且P＜0. 05) .经斑点印迹技术验证蛋白INF2表达水平与iTRAQ结果一致.经GO(gene ontology) 蛋白功能注释及富集分析,特发性弱精子症精浆中差异蛋白功能主要包括调节钙离子跨膜转运、胞浆内转运以及螯合、蝶呤钼辅因子合成及代谢、调节铜离子跨膜转运等.经KEGG蛋白通路注释及富集分析,特发性弱精子症精浆中差异蛋白主要富集于叶酸生物合成、金黄色葡萄球菌感染等通路.结论特发性弱精子症患者精浆蛋白同正常成年男性精浆蛋白存在差异,其可能是引起特发性弱精子症的原因.     

聚精颗粒对弱精子症CDY基因表达变化的作用研究

目的评价聚精颗粒治疗核蛋白组型转换异常弱精子症的有效性和安全性以及CDY（Chromodomain Y-like protein）基因表达变化。方法选择核蛋白组型异常弱精子症患者63例,给予聚精颗粒治疗3个月,观察治疗前后精液常规参数以及核蛋白组型转换、CDY基因定量表达的变化。并以56例正常生育者作为对照。结果与正常对照组比较,精子密度差异有统计学意义（P〈0.05）,且精子核蛋白组型转换半定量值、a级精子、（a＋b）级精子和活动率差异均有统计学意义（P〈0.01）。在聚精颗粒治疗3个月后,精子密度与治疗前比较,差异有统计学意义（P〈0.05）,且治疗后精子核蛋白组型半定量值和a级精子、（a＋b）级精子、活动率等主要精液参数指标与治疗前比较,差异均有统计学意义（P〈0.01）。治疗后CDY基因均有不同程度的改善。结论聚精颗粒不但能够改善主要精液参数指标,而且能够促进精子核蛋白组型转换半定量值下降,通过促进CDY基因的表达增加,从而达到调节精子核蛋白组型转换的作用。     

CRISP2基因及蛋白在弱精子症患者中的表达及其临床意义

目的 弱精子症作为男性不育的重要因素之一,影响着全球15％的育龄夫妇,但其发病机制尚待阐明.课题组前期研究通过基因芯片技术发现CRISP2在弱精子症患者精子中表达明显下调,但其临床意义仍有待进一步阐明.方法 收集2013年1月至2013年6月的弱精子症患者及健康男性精液标本各24例,检测这些精液样本中CRISP2基因及蛋白表达水平,探讨其与精子形态、运动能力及生育预后的相关性.结果 弱精子症患者精液标本中CRISP2蛋白表达水平明显低于正常对照组,而CRISP2基因mRNA表达水平并无明显统计学差异.相关性分析显示CRISP2蛋白表达水平与形态正常精子率(r=0.6182,P=0.0037)及前向运动能力(r=0.6309,P=0.0029)呈明显正相关.经过密切随访,CRISP2蛋白高表达患者配偶受孕率明显高于CRISP2蛋白低表达患者(80.0％vs20.0％,P=0.0230).结论 CRISP2蛋白表达水平与弱精子症患者的精子形态、前向运动能力呈正相关,且CRISP2蛋白低表达的弱精子症患者生育预后不良,提示CRISP2作为弱精子症患者治疗新靶点的潜在价值.     

少精子症、弱精子症和畸形精子症患者精子凋亡率比较

目的：比较少精子症、弱精子症和畸形精子症患者精子凋亡率。方法：应用计算机辅助精液分析（CASA）对生育组(n=14)、不育组［(n=48),少精子症(精子密度<10×10^６•mL^-1)11例、弱精子症(a+b级精子百分率<50%)25例、畸形精子症(形态正常精子百分率<14%)12例］进行精液参数检测,瑞-姬染色检测精子凋亡率。结果：不育组及不育组中的少精子症组精子凋亡率均明显高于生育组（P<0.05）;弱、畸形精子症组精子凋亡〖JP3〗率与生育组比较差异均无显著性（P>0.05）。密度异常组(精子密度<20×10⁶•mL^-1)精子凋亡〖JP〗率明显高于密度正常组(精子密度≥20×10⁶•mL^-1)（P<0.05）;a+b级异常组(a+b<50%)精子凋亡率与正常组比较差异无显著性（P> 0.05）;精子形态异常组(形态正常精子<14%)凋亡率与正常组比较差异无显著性（P> 0.05）。结论：不育组精子凋亡率高于生育组,尤其是少精子症患者精子凋亡率增加更明显。     

DNA-PKcs影响肝癌耐药细胞BEL7402/5-FU耐药性的机制

目的利用RNA干扰技术探讨DNA-PKcs基因沉默影响肝癌细胞BEl7402/5-FU耐药性的机制。方法将靶向DNA-PKcs的干扰质粒shDNA-PKcs转染肝癌耐药细胞BEL7402/5-FU,利用实时荧光定量PCR及Western blot法检测转染干扰质粒后DNA-PKcs基因的沉默效率;Western blot检测Artemis、磷酸化Artemis蛋白水平的表达。结果实时荧光定量PCR及Western blot检测结果显示转染shDNA-PKcs后,DNA-PKcs mRNA及蛋白水平表达均下调（P〈0.05）;Western blot检测结果显示shDNA-PKcs转染组Artemis蛋白表达水平与对照组相比均有所降低（P〈0.05）,磷酸化Artemis蛋白表达水平在转染前后无明显变化（P〉0.05）。结论 ShDNA-PKs干扰质粒能抑制Bel-7402/5FU细胞中DNAPKcs、Artemis蛋白的表达、但对P-Artemis的表达无影响。     

硒蛋白K在小鼠中的组织差异表达及T淋巴细胞内定位

目的检测硒蛋白K(Sel K)在小鼠脾、肾、肠、肺、脑、肝组织中的表达差异及在T淋巴细胞内的定位,为研究Sel K的分布与生物学功能的关联性提供参考。方法采用实时荧光定量PCR,Western blot以及免疫组化方法检测硒蛋白K在小鼠各组织的表达差异,并采用细胞免疫化学的方法 ,用激光共聚焦显微镜观察硒蛋白K在小鼠T淋巴细胞内的定位。结果实时荧光定量PCR结果显示硒蛋白K在小鼠各组织中均有表达,并且在脾脏中的表达明显高于其他组织(P0.05)。Western blot及免疫组化结果与实时荧光定量PCR结果基本一致。细胞免疫化学结果显示硒蛋K在小鼠T淋巴细胞中定位于内质网。结论硒蛋白K是一种在脾脏中高表达的内质网蛋白。     

圆头精子症患者精子形态观察及全外显子测序分析

目的:观察1例圆头精子症患者的精子形态,并进行全外显子测序,探索其发病的遗传学基础.方法:取1例圆头精子症患者和1名健康对照精液各2μL,滴于GoldCyto Spermblue精子形态染色分析玻片上,用光学显微镜观察精子形态.抽取患者静脉血3 mL,提取基因组DNA,进行全外显子测序,并采用实时荧光定量PCR和San...     

精浆内源性哇巴因水平与精子活动力和 DNA碎片指数的关系

目的：探究精浆内源性哇巴因（ EO）水平对精子前向运动（ PR）百分率的影响以及与精子DNA碎片指数（ DFI）、精浆丙二醛（ MDA）的关系。方法选取男科门诊患者的精液样本78例,计算机辅助精子分析检测PR百分率[按PR百分率不同将样本分为正常组（ PR≥32％）、轻度弱精子症组（32％＞PR≥20％）、中度弱精子症组（20％＞PR≥10％）、严重和极度弱精子症组（PR＜10％）],酶联免疫法检测精浆EO水平,核染色质扩散法检测精子DFI,硫代巴比妥酸法检测精浆MDA水平,分析精浆EO水平与上述指标的关系。结果正常组精浆EO水平明显低于各弱精子症组（P＜0．01）,各弱精子症组精浆EO水平差异无统计学意义（P＞0．05）。相关分析显示精浆EO水平与精子DFI呈正相关（ r＝0．388,P＜0．01）;精浆EO水平与精浆MDA水平呈正相关（ r＝0．397, P＜0．01）。结论精浆EO水平对精子PR能力及DNA完整性有重要影响。     

WT1在子宫内膜腺癌中的表达及其临床意义

目的：探讨Wilms肿瘤基因（WT1）在子宫内膜腺癌组织、子宫内膜不典型增生组织以及正常内膜组织中的蛋白和基因表达水平及其临床意义。方法：采用实时荧光定量PCR及2-ΔΔCt法定量分析WT1 m RNA的相对表达量,应用蛋白印迹（Western blot）法检测子宫内膜组织中WT1蛋白的表达。结果：WT1在子宫内膜腺癌组织中的基因和蛋白表达均明显高于子宫内膜不典型组织和正常内膜组织（均P〈0.01）;WT1 m RNA与子宫内膜腺癌患者年龄、绝经情况、临床分期、淋巴结浸润情况、雌激素受体（ER）和体质量指数（BMI）无显著相关性,与病理分级、肌层浸润情况和孕激素受体（PR）相关（P〈0.05）;WT1蛋白的表达与患者年龄、绝经情况、临床分期、肌层浸润、ER、PR和BMI无显著相关性,与病理分级、淋巴结转移情况相关（P〈0.05）。结论：子宫内膜腺癌中存在WT1 m RNA和蛋白表达水平上调,可能与子宫内膜腺癌的发生和进展有关。     

WT1在子宫内膜腺癌中的表达及其临床意义#br#

目的：探讨Wilms肿瘤基因（WT1）在子宫内膜腺癌组织、子宫内膜不典型增生组织以及正常内膜组织中的蛋白和基因表达水平及其临床意义。方法：采用实时荧光定量PCR及2-ΔΔCt法定量分析WT1 mRNA的相对表达量,应用蛋白印迹（Western blot）法检测子宫内膜组织中WT1蛋白的表达。结果：WT1在子宫内膜腺癌组织中的基因和蛋白表达均明显高于子宫内膜不典型组织和正常内膜组织（均P＜0.01）;WT1 mRNA与子宫内膜腺癌患者年龄、绝经情况、临床分期、淋巴结浸润情况、雌激素受体（ER）和体质量指数（BMI）无显著相关性,与病理分级、肌层浸润情况和孕激素受体（PR）相关（P＜0.05）;WT1蛋白的表达与患者年龄、绝经情况、临床分期、肌层浸润、ER、PR和BMI无显著相关性,与病理分级、淋巴结转移情况相关（P＜0.05）。结论：子宫内膜腺癌中存在WT1 mRNA和蛋白表达水平上调,可能与子宫内膜腺癌的发生和进展有关。     

囊性纤维化跨膜转导调节因子表达率与人精子受精能力的关系

目的：研究人精子囊性纤维化跨膜转导调节因子（cystic fibrosis transmembrane conduc-tanceregulator,CFTR）表达率与精子受精能力间的关系。方法：运用间接免疫荧光法及蛋白印迹分析法研究CFTR在人精子上的表达及其在不同类型（生育组、不明原因性不育组及不育组）精子上的表达率情况。结果：通过间接免疫荧光法发现CFTR表达在人精子赤道板上,蛋白印迹分析进一步证实人精子中存在CFTR,分子量为170kD;采用间接免疫荧光技术,CFTR在生育组、不明原因性不育组及不育组（包括畸形精子症、弱精症、少精症）上的表达率有显著差异：CFTR在生育组精子上的表达率（88.13%±3.79%）远高于不明原因性不育组（52.93%±15.36%）及不育组（35.89%±20.41%）（P〈0.01）。结论：CFTR表达率下降与人精子受精能力降低有关。     

Differential analysis of two-dimensional gel electrophoresis profiles of spermatozoa protein in human normal motility sperm and idiopathic asthenospermia

Objective: To evaluate the application of two-dimensional electrophoresis in the research of differentially expressed proteins in the human asthenospermia. Methods: Two-dimensional gel electrophoresis was performed on 4 normal sperm samples from healthy men and 4 sperm samples from 4 asthenospermia patients. After silver staining, the differential expression proteins were analyzed by PDQuest 2D analysis software. Results: Six differential protein spots were identified. Four spots showed increased expression in the control gels compared with the patient gels. Conclusion: The protein profiles of differential expression between the normal spermatozoa and idiopathic asthenospermia were established and some differential proteins were found. The data of this study would establish the better fundament for further isolation and identification of differentially expressed proteins in human asthenospermia sperm.     

Spermatozoal protein profiles in male infertility with asthenozoospermia

Background Infertility is a major medical and social problem, and elementary research on the spermatozoal proteins and their functions are relatively scarce and there are very few confirmed and effective options for the treatment of male infertility. Thus, it is essential to find candidate proteins that affect male infertility. This study was designed to detect the proteins with differential expression in sperm from infertile patients and normal donors.Methods Semen samples from patients with idiopathic asthenozoospermia （n=114） and from fertile men with normal spermiograms （n=37） were collected. Semen sample analysis, sperm protein extraction, SDS-PAGE electrophoresis and Western blotting analysis were performed. Results were analyzed by SPSS 16.0 statistical software.Results Western blotting analysis of spermatic proteins displayed a major differentially expressed protein in spermatozoa from fertile and idiopathic asthenozoospermia patients. Densities and volumes of the identified protein in the patients were significantly decreased compared to normal donors （P=0.034 and P=0.036, respectively）. The protein was identified as DEAD-box protein 4 （DDX4, VASA）. The expression and correction value （CV） of DDX4/VASA in the patients was reduced significantly compared to normal donors （P=0.037 and P=0.031, respectively）.Conclusions The expression of spermatic protein DDX4/VASA associates with spermatic motility, implying that DDX4NASA may be a candidate marker for evaluation of spermatic motility.     

活动力不足精子尾部微管超微结构研究

以２２例活动力不足精子病人的精液为标本，对其精子进行形态学研究，以了解精子尾部的形态变化。电镜观察发现：１例精子尾部形态变化较一致。轴丝排列为９＋０微管形式；另１例精子尾部形态变化呈多样性，或部分周围微管和部分外围致密纤维以及中央微管消失，或所有微管和外周致密纤维排列混乱。结果显示部分活动力不足精子病人精子尾部的微管异常和Ｋａｒｔａｇｅｎｅｒ‘ｓ综合征特征相似，这种异常可能影响精子的运动能力，而导     

GRP_(78)在弱精症精子和活力正常精子蛋白中的表达差异研究

目的:探讨GRP78在弱精症精子和活力正常精子蛋白中的表达差异。方法:取50μg正常精子和弱精样品蛋白质,加入上样缓冲液后,沸水浴5min,充分变性蛋白质,100V恒压电泳分离,直至溴酚蓝前沿达到凝胶底部;再用Western-Blot检测GRP78表达变化。结果:GRP78正常精子蛋白样品中高表达,而在弱精子蛋白样品中低表达,Western-Blot检测结果与双向电泳凝胶图中的差异高度吻合。结论:GRP78在弱精子蛋白中低表达,提示GRP78在弱精子症发生中可能扮演着重要角色。     

Antisperm Antibodies on the Surface of Spermatozoa before＇Ejaculation from Vasectomized Men

The antisperm antibodies (AsAbs) coated on spermatozoa of the proximal vas deferens (sperm before ejaculation, SBE) from 48 fertile men who were volunteers of vasectomy and 24 vasectomized men who asked for vasovasotomy,were determined by immunobead test (IBT) and sperm cervical mucus contact test (SCMC). The results showed that in fertile men there were no positive sam ples of SBE in IBT and SCMC. In vasectomized men positive samples of SBE were found in 79.4% for IgG, 38.2% for IgA and 35.5% for SCMC. The AsAbs on SBE could be found at the time of less than one year to more than 3 years after vasectomy. The AsAbs were still found on the semen samples at 1-3 months after vasovasotomy. Our results also indicated that the incidence of AsAbs on SBE from vasectomized men could not predict the levels of AsAbs on their ejaculated sperm after vasovasotomy. There was no significant correlation between the levels of AsAbs in serium before vasovasotomy and those on SBE from vasectomized men.     

Studies on the Relationship between Urokinase Plasminogen Activator(uPA)and Human Sperm Motility

Plasminogenactivators(PAs)arehighlyselectivetrypsin--likeserineproteaseabletoconverttheinactiveplasminogen,azymogenpresentinmostextracellularfluids,intoplasmin,alsoatrypsin--likeproteaseofbroadspecificity['].SeminalplasmalevelsofPAsinmenshowup60to100foldhigherthaninbloodplasma['].ThetwoknownPAs,urokinase--type(uPA)andtissue-type(iPA)aresecretedbyalargenumberofcellsandarethoughttoexhibitmultiplefunctionsinextracellularproteolysisaccompanyingtissueremodelingandcellmigration[']'Duetotheseprop…     

基于Nrf2通路研究二仙解毒方对弱精子症大鼠精子微环境的影响*

目的基于Nrf2信号通路研究二仙解毒方对弱精子症模型大鼠精子微环境的改善作用及可能机制。方法 使用奥硝唑法构建成熟雄性大鼠弱精子症模型,随机分为模型组、二仙解毒方低剂量组、中剂量组、高剂量组、左卡尼汀组,每组各12只,连续灌胃4周后,检测各组大鼠精子浓度、精子活动力、相关氧化应激指标、大鼠睾丸及附睾中基于Nrf2蛋白表达及mRNA表达。结果 二仙解毒方可增强弱精子症模型大鼠精子活动力,剂量越高,氧化应激指标改变越显著,二仙解毒方高剂量组可将模型组大鼠的精液抗氧化能力恢复至正常大鼠水平;二仙解毒方可促进大鼠附睾、睾丸组织Nrf2基因转录与蛋白表达。结论 二仙解毒方确有提高精子活动力的作用,其可能的作用机制为通过诱导上调生殖细胞内Nrf2 mRNA和蛋白表达,以改善弱精子症大鼠精液氧化应激状态,从而提高精子活动力。     

Nek2基因沉默对卵巢癌SKOV3细胞侵袭能力的影响

目的研究RNA干扰Nek2表达对卵巢癌SKOV3细胞侵袭能力的影响以及相关的分子机制。方法设计合成3条针对Nek2基因的siRNA,转染至SKOV3细胞中,采用Real-time RT-PCR和Western blot技术筛选出抑制效率最高的Nek2-siRNA序列,用Transwell方法检测转染该序列的SKOV3细胞侵袭能力的改变,并用Western blot方法检测Nek2-siRNA转染后SKOV3细胞中MMP-2、MMP-9和TIMP-1蛋白表达的变化。结果①RNA干扰序列2对SKOV3细胞中Nek2的抑制效果最明显;②与未转染组和阴性对照组相比,转染了Nek2-siRNA的SKOV3细胞侵袭能力明显下降(P<0.01);③Western blot检测表明,与未转染组和阴性对照组相比,Nek2-siRNA转染48 h后SKOV3细胞中MMP-2、MMP-9的表达明显下调,而TIMP-1的表达明显上调(P<0.01)。结论 Nek2-siRNA能有效得沉默SKOV3细胞中Nek2的表达,通过下调MMP-2、MMP-9的表达,上调TIMP-1的表达,从而抑制SKOV3细胞的侵袭转移。