幽门螺杆菌黏附素基因（hpaA）的表达及重组蛋白的免疫原性检测

 目的   研究幽门螺杆菌黏附素 A（adhesin A of Helicobacter pylori,HpaA）基因在大肠杆菌中的表达和检测纯化 HpaA 的免疫原性。方法   将hpaA/pET28a表达质粒转入大肠杆菌BL21（RP）株并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达,通过Ni²⁺亲和层析和分子筛层析纯化表达蛋白。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表达蛋白的相对分子质量,用蛋白质印迹法对表达蛋白进行特性确认。将纯化HpaA腹腔注射Balb/c小鼠,并检测小鼠的抗体水平。结果   表达蛋白的相对分子质量约为30 000,与HpaA相符。纯化的表达蛋白可与抗HpaA抗体发生特异性反应。腹腔注射HpaA的小鼠与对照小鼠间的血清抗HpaA IgG抗体水平差异存在统计学意义（t=8.367,P<0.01）。结论   HpaA在大肠杆菌BL21（RP）株中得到成功表达,且纯化HpaA具有较好的免疫原性。     

HCBP12融合蛋白的表达、纯化及多抗制备

目的：构建丙型肝炎病毒核心抗原结合蛋白12（HCVCore binding protein,HCBP12）原核表达载体,在大肠埃希菌中进行表达、纯化HCBP12融合蛋白并制备兔抗HCBP12多克隆抗体。方法：应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）,以提取的HepG2细胞mRNA为模板,扩增获得HCBP12基因片段,插入至原核表达载体pET-32a（＋）中,构建原核表达载体pET-32a（＋）-HCBP12,转化大肠埃希菌BL21,以异丙基硫代β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导,获得HCBP12融合蛋白的可诱导性表达,并通过SDS-PAGE电泳、Western Blot免疫印迹分析和证实融合蛋白表达的特异性。利用Ni＋亲和柱对表达蛋白进行纯化及柱上复性。纯化蛋白免疫新西兰兔,获得抗HCBP12多克隆抗体。以纯化HCBP12为抗原,利用Western blot和ELISA法对多克隆抗体进行特异性和效价检测。结果：HCBP12融合蛋白表达成功。SDS-PAGE分析表明其为包涵体表达。成功获得了融合蛋白纯品及兔抗HCBP12多克隆抗体。ELISA法表明多克隆抗体效价〉1512000,Western blot检测证明多克隆抗体的特异性良好。结论：成功表达、纯化HCBP12融合蛋白,并获得高特异性、高效价兔抗HCBP12多克隆抗体,为研究HCBP12蛋白的生物学功能及丙肝的临床治疗提供了重要的实验工具。     

C端截短的乙型肝炎病毒核心抗原的原核表达及免疫原性

 目的   原核表达C端截短的乙型肝炎病毒核心抗原（hepatitis B virus core antigen,HBcAg）〔HBcAg(aa 1-149）〕,并研究其在小鼠中的免疫原性。方法   用聚合酶链反应扩增C端截去34个氨基酸的HBcAg基因片段,构建含HBcAg（aa 1-149）基因的克隆质粒及表达质粒,在大肠杆菌Rossatta2中以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导重组蛋白的表达。表达产物经Ni²⁺亲和层析柱纯化后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、蛋白质印迹法鉴定。将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,用ELISA法检测血清抗-HBc水平。结果   重组原核表达质粒pET15b HBcAg(aa 1-149)经双酶切和SDS-PAGE鉴定证明构建正确。重组HBcAg（aa 1-149）在大肠杆菌中获得高效表达,表达形式主要为可溶性蛋白。蛋白质印迹法显示在预期位置（相对分子质量约17 000位置）出现特异性条带。纯化后的重组蛋白纯度较高（＞90%）,并可在小鼠中诱生较高水平的抗-HBc。结论   重组HBcAg（aa 1-149）在原核系统中获得成功表达,并可在小鼠中诱导抗体应答。     

重组 GST-β-GT 融合蛋白的原核表达、纯化及活性鉴定

目的：构建噬菌体β‐GT蛋白的原核重组体系,诱导表达、纯化GST‐β‐GT 融合蛋白并对其进行酶活性测定。方法利用PCR技术从T4噬菌体中扩增β‐GT基因;经T‐A克隆,获得β‐GT基因片段,经酶切连接,构建原核表达载体pGEX‐6P‐1‐β‐GT ;经测序鉴定序列正确后,将所构建的载体转化进入大肠埃希菌BL21（DE3）中进行表达。利用IPTG诱导,经10％ SDS‐PAGE鉴定目的蛋白表达后,采用GST柱纯化目的蛋白;通过酶切和qPCR鉴定其活性。结果成功扩增了噬菌体β‐GT基因;重组质粒在大肠埃希菌BL21（DE3）中诱导表达出GST‐β‐GT融合蛋白;通过GST柱纯化后获得了GST‐β‐GT融合蛋白,纯度达95％;通过酶切和qPCR验证,此GST‐β‐GT融合蛋白具有T4‐β‐GT酶的活性。结论。原核表达GST‐β‐GT融合蛋白具有糖基转移酶活性。     

PML-RARα融合基因相关蛋白原核表达载体的构建、表达和纯化

目的 构建PML-RAR o[融合基因相关重组表达质粒,在大肠埃希菌中表达可溶性蛋白并进行纯化.方法 利用聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)以PML-RAR α全长质粒为模板分别扩增出长度均为1 200 bp的PML和RAR o[序列,并将它们分别插入PET32a(+)质粒中,构建重组表达质粒,化学法转化大肠埃希菌DH5α进行克隆,菌落PCR筛选阳性转化子,双酶切和测序鉴定重组质粒的正确性.正确重组的表达质粒分别命名为PML-Flag-PET32a(+)和Flag-RARα-PET32a(+).将正确重组的表达质粒转化感受态大肠埃希菌BL21(DE3),经异丙基β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,利用表达蛋白的组氨酸“标签”(His-tag)进行Ni2+-树脂柱亲和层析纯化,SDS-PAGE和Western blotting鉴定纯化蛋白质.结果 PCR扩增获得目的基因,重组表达质粒经EcoRI/HindⅢ双酶切和测序鉴定证明构建正确.转化感受态BL21(DE3)并经诱导后得到高效表达,SDS-PAGE和Western blotting显示纯化蛋白为目的蛋白.结论 成功构建重组表达质粒,并经诱导表达后可纯化出目的蛋白,为进一步的抗体制备等实验奠定了基础.     

一种新的大肠埃希菌蛋白质快速合成方法

目的 在大肠埃希菌中建立同时进行PCR克隆和重组蛋白质快速表达的方法。方法 通过TA载体将包含目的基因和全部蛋白表达元件的蛋白表达单位引入大肠埃希菌后，无需使用任何限制性酶，直接在大肠埃希菌中表达编码的蛋白质。结果 通过小规模或大规模表达多种不同蛋白质，证实了该方法的有效性和可靠性。使用标准光谱（280 nm）定量方法分析纯化的蛋白质，发现绿色荧光蛋白的可溶性蛋白表达量达到30 mg/L，血管内皮生长因子特异性 VH的可溶性蛋白表达量达到20 mg/L。结论 该方法设计灵活，且易于进行多种蛋白质的并行表达，为快速筛选理想的蛋白突变体提供了一新途径。     

超广谱-内酰胺酶SHV-5的基因重组表达及酶活性鉴定

目的对blaSHV-5进行基因重组表达,为建立SHV类β-内酰胺酶抑制剂筛选模型研究奠定基础。方法以产blaSHV-5肺炎克雷伯菌基因组DNA为模板,自行设计一对寡核苷酸引物,通过PCR扩增获得blaSHV-5基因片断,定向克隆入质粒载体pBK-CM V构建重组质粒,对重组质粒进行酶切鉴定和DNA测序鉴定,重组质粒转化大肠埃希菌XL 1-B lue M RF′后,N itrocefin显色结合SDS-PAGE分析目的基因在大肠埃希菌中的表达及其酶活性。结果PCR扩增获得了大小约为900bp的DNA条带,定向克隆入质粒载体pBK-CM V后筛选到大小约为5.4kb的重组质粒,S acⅠ和E coRⅠ双酶切后可切下大小约900bp的插入片段,DNA测序发现插入片断的基因序列与G enB ank中肺炎克雷伯菌基因序列完全一致,重组质粒转化大肠埃希菌XL 1-B lue M RF′后可表达分子量约为31500的重组蛋白。重组菌裂解液对n itrocefin显示出较强水解活性。结论超广谱β-内酰胺酶SHV-5在大肠埃希菌XL 1-B lue M RF′中实现了基因重组表达。为进一步进行酶的纯化等相关后续研究奠定了基础。     

幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统Cag3基因的克隆表达及其质谱鉴定

目的 构建表达幽门螺杆菌(Hp)Cag致病岛(Cag-PAI)编码的Cag3(hp0522)基因重组质粒,转入大肠杆菌中表达,纯化重组蛋白.方法 以Hp 11637基因组为模板,应用PCR技术扩增Cag3基因片段,克隆至pGEM-T载体中测序,然后克隆到高效表达载体pET-28a(+)上,得到了重组表达载体pET-28a(+)-Cag3,转化表达宿主菌大肠埃希菌BL21;经IPTG诱导表达后,将大量表达的重组蛋白用Ni2+-NTA亲和层析柱纯化;采用串联飞行时间质谱技术对Cag3-His融合蛋白进行鉴定.结果 成功克隆了Cag3基因.经SDS-PAGE分析,表达蛋白相对分子质量与预期大小一致;质谱检测到Cag3重组蛋白的表达.结论 成功构建了Cag3基因的原核表达载体pET-28a(+)-Cag3.     

外膜蛋白对59株大肠埃希菌耐药性的影响

目的:研究外膜蛋白对59株耐头孢西丁大肠埃希菌耐药性的作用。方法:用聚合酶链反应(PCR)方法检测外膜蛋白OmpF基因;用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测外膜蛋白;微量稀释法测定20种抗菌药物对试验菌株的敏感性。结果:59株大肠埃希菌中,29株OmpF基因阳性(49%),其中在产AmpC酶25株中有20株OmpF基因阳性;OmpF基因缺失的30株大肠埃希菌均未出现OmpF蛋白条带,其中13株同时缺失OmpC蛋白条带,29株OmpF基因阳性菌中有4株缺失OmpF蛋白条带;这59株菌对多种抗菌药物耐药。结论:OmpF基因及蛋白的缺失是非产AmpC酶菌对头孢西丁耐药的主要原因;孔蛋白缺失主要产生头孢西丁耐药,而对试验中的其它抗菌药物影响较小。     

金黄色葡萄球菌锰转运蛋白C的原核表达及小鼠免疫评价

目的在原核系统中表达金黄色葡萄球菌(金葡菌)锰转运蛋白C(manganese transporter C, MntC), 对其免疫原性进行分析, 为筛选金葡菌疫苗候选抗原提供参考。方法合成MntC基因, 克隆至pET-22b(+)载体, 构建重组表达质粒pET-22b-mntc, 转化至E.coli BL21(DE3), 异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导表达, 镍柱纯化。将纯化产物进行免疫印迹法鉴定, 再采用分子排阻高效液相色谱法进行纯度分析。将铝佐剂吸附重组MntC免疫BALB/c小鼠作为实验组, 将铝佐剂免疫BALB/c小鼠作为对照组。经ELISA检测小鼠血清中特异性IgG抗体水平、中性粒细胞呼吸爆发试验检测小鼠血清特异性抗体功能, 再用细胞因子试剂盒检测小鼠脾淋巴细胞培养上清液中抗原特异性细胞因子水平。免疫后小鼠用致死剂量金葡菌49521菌株攻毒, 观察小鼠存活情况。结果经双酶切及测序鉴定, 重组表达质粒pET-22b-mntc构建正确。重组MntC相对分子质量约为34 000, 以可溶性形式表达, 可与抗His单克隆抗体特异性结合, 纯度大于95%。将铝佐剂吸附MntC免疫小鼠...     

黄连-左氧氟沙星联合用药对多重耐药大肠埃希菌的体外抗菌活性研究

目的： 研究左氧氟沙星与黄连中成分联合用药对多重耐药大肠埃希菌的体外抑制作用。方法： 选择从临床标本中检出的多重耐药大肠埃希菌,分别测定黄连提取物、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀及左氧氟沙星对多重耐药大肠埃希菌最小抑菌浓度（MIC）,采用微量肉汤棋盘稀释法分别测定黄连提取物、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀与左氧氟沙星的体外联合抑菌作用。结果： 实验结果表明黄连提取物、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀与左氧氟沙星联合用药后对大部分耐药菌（90.9%）均表现为协同或相加作用,其中盐酸巴马汀与左氧氟沙星的联合应用最有效。结论： 盐酸巴马汀、盐酸小檗碱或黄连提取物分别与左氧氟沙星联合对多重耐药大肠埃希菌都有较好的体外抗菌作用,临床应用价值高,值得进一步研究。     

柯萨奇病毒A组5型VP1蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

目的 原核表达柯萨奇病毒A组5型(coxsackievirus A5,CV-A5)VP1蛋白,并制备抗VP1多克隆抗体(多抗),为CV-A5相关定性定量研究制备试剂。方法 逆转录PCR扩增N端截短的CV-A5VP1-ΔN56后,克隆至原核表达载体pGEX-6P-1,获得pGEX-6P-1-VP1-ΔN56。将其转化大肠埃希菌BL21(DE3),表达重组蛋白并纯化。用纯化的谷胱甘肽巯基转移酶-VP1-ΔN56融合蛋白经背部皮下免疫日本大耳白兔,制备多抗。结果 重组表达载体构建成功,融合蛋白以不可溶包涵体存在。ELISA、蛋白质印迹法检测表明,获得的兔多抗效价为107,可特异性识别重组和天然CV-A5 VP1蛋白。结论 成功制备重组CV-A5 VP1蛋白及特异性多抗。为中和抗原表征研究及VP1定性定量分析奠定了基础。     

C群脑膜炎球菌结合疫苗的制备及其免疫原性

 目的  制备由不同分子大小C群脑膜炎球菌多糖（group C meningococcal polysaccharide,CPS）与破伤风类毒素（tetanus toxoid,TT）共价偶联而成的结合疫苗（CPS-TT）,并检测其在小鼠中的免疫原性。 方法   将CPS降解成不同大小的片段,经碳二亚胺（carbodiimide,EDAC）或溴化氰（cyanogen bromide,CNBr）活化后偶联到TT上制成CPS-TT。NIH小鼠皮下注射制备的不同CPS-TT,用ELISA法测定小鼠血清抗CPS和TT IgG抗体。 结果   EDAC活化的降解CPS的衍化率（3.9%～5.7% ）和多糖回收率（11.4%～21.3%）均高于CNBr活化的降解CPS的衍化率（0.4%～1.2%）和回收率（2.4%～11.5%）。EDAC或CNBr活化的降解CPS制备的CPS-TT在小鼠中均具有较强的免疫原性,但EDAC活化的降解CPS制备的CPS-TT免疫小鼠的抗CPS抗体滴度高于CNBr活化的降解CPS制备的CPS-TT免疫小鼠。结论  EDAC活化的降解CPS可用于制备C群脑膜炎球菌结合疫苗。     

比阿培南与其他抗菌药物对某院临床分离致病菌的体外敏感性比较

目的:比较研究比阿培南和其他抗菌药物的体外抗菌活性。方法:收集2015年1-5月某院分离的344株临床常见致病菌,采用纸片扩散法测定比阿培南和对照药(美罗培南、亚胺培南、厄他培南、氨曲南、左氧氟沙星、哌拉西林他唑巴坦、头孢他啶和头孢吡肟)对革兰阴性菌的敏感性,及比阿培南和对照药(美罗培南、左氧氟沙星、万古霉素、利奈唑胺、克林霉素、青霉素和呋喃妥因)对革兰阳性菌的敏感性。结果:比阿培南与美罗培南、亚胺培南、厄他培南、哌拉西林他唑巴坦对产和不产ESBL的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌及其他肠杆菌的敏感率相仿,且差异无统计学意义(P>0.05),但比阿培南对铜绿假单胞菌的敏感率显著高于其他抗菌药物(P<0.05);比阿培南与美罗培南对甲氧西林敏感的金葡菌、耐甲氧西林的金葡菌、粪肠球菌和屎肠球菌的敏感率相仿,但显著低于万古霉素、利奈唑胺和呋喃妥因(P<0.001)。结论:与其他抗菌药物相比,比阿培南对某院临床分离的革兰阴性菌尤其是铜绿假单胞菌有较高的敏感率,但对鲍曼不动杆菌和肠球菌有较高的耐药率。     

重组脑膜炎球菌P64K蛋白的表达、纯化及载体作用

目的 表达并纯化重组脑膜炎球菌P64K蛋白,观察其载体作用.方法 利用基因工程技术在大肠杆菌中表达P64K蛋白,用硫酸铵盐析沉淀和两步层析纯化P64K蛋白.以重组P64K蛋白为载体蛋白,以已二酰肼为连接剂,在碳化二亚胺的作用下,将P64K蛋白与活化的A群脑膜炎球菌多糖(group A meningococcal polysaccharide,GAMP)结合,制备GAMP-P64K结合物.免疫BALB/c小鼠,间接ELISA法测定血清特异性抗P64K蛋白和GAMP IsG抗体,分析P64K蛋白的免疫原性.结果 重组P64K蛋白在大肠杆菌中主要以可溶性形式表达,表达量约占菌体总蛋白的35%.动物实验证明,重组P64K蛋白具有较强的免疫原性,表明P64K蛋白具有载体蛋白作用.结论 在大肠杆菌中成功表达了重组P64K蛋白,以重组P64K蛋白为载体制备的GAMP-P64K结合物具有良好的免疫原性.这为以重组P64K蛋白为蛋白载体制备其他结合疫苗奠定了实验基础.     

新型冠状病毒受体结合域-Fc融合蛋白表达及小鼠免疫原性

目的  表达制备新型冠状病毒刺突蛋白的受体结合域（receptor binding domain,RBD）-Fc融合蛋白,并评价其在小鼠模型中的免疫原性。方法  将新型冠状病毒RBD与小鼠免疫球蛋白Fc段融合基因在中国仓鼠卵巢细胞中融合表达并制备融合蛋白。将不同剂量的RBD-Fc融合蛋白分别单独或辅以氢氧化铝佐剂免疫小鼠,通过ELISA、假病毒中和试验、酶联免疫斑点试验检测诱导产生的体液和细胞免疫应答。结果  10 μg RBD-Fc融合蛋白辅以氢氧化铝佐剂能有效诱导小鼠产生良好的RBD特异性IgG抗体应答,该抗体可阻断病毒RBD与细胞表面病毒受体的结合,进一步研究表明该重组蛋白还诱导产生了针对原始毒株、Beta变异株和Delta变异株假病毒的中和抗体,中和抗体滴度分别为1 566、336和270。结论  制备的RBD-Fc融合蛋白具有较好的免疫原性,可为开发COVID-19重组蛋白疫苗提供参考。     

Ⅰ型单纯疱疹病毒gG基因片段的高效表达、纯化

目的 获得具有优势抗原表位的Ⅰ型单纯疱疹病毒糖蛋白G的表达抗原并纯化鉴定。方法 用PCR技术扩增经分析筛选出的HSVl-gG蛋白中优势抗原决定簇较集中的基因片段。将该段基因克隆至PGEX-4T-2表达载体内，转化大肠杆菌TGl，对重组体进行诱导表达，表达产物主要以可溶性形式存在，使用硫酸铵沉淀后采用Sephamse阴离子交换层析进行纯化。纯化的蛋白抗原包被酶联板分别对抗HSVl-IgM阳性血清和正常人血清标本进行检测。结果 在原核表达载体中成功地克隆了HSVl-gG，电泳分析表明在相对分子质量43．5kD处有HSVl-gG／GST融合蛋白的高效表达，并纯化获得了纯度达90％的表达蛋白。ELISA分析初步证实表达产物具有较好的抗原性和特异性。结论 成功地克隆、表达了高纯度的具有良好免疫原性的HSVl-gG蛋白，为研制高质量的HSV-1免疫学诊断试剂提供了有利条件。