细胞周期素依赖性激酶抑制剂olomoucine对大鼠脊髓损伤后轴突再生微环境的影响及其意义

目的 探讨细胞周期素依赖激酶抑制剂olomoucine对脊髓损伤后轴突再生微环境的影响及意义。方法 建立脊髓半切损伤模型,实验大鼠随机分为假手术组、损伤对照组和olomoucine干预组,采用Western印迹分析脊髓损伤后细胞周期相关蛋白的表达;应用免疫荧光技术检测损伤区域胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、硫酸软骨素蛋白多糖（CSPG）以及生长相关蛋白43（GAP-43）的表达;采用改良的Gale联合评分法对大鼠瘫痪后肢进行运动功能评估。结果 假手术组细胞周期素（cyclin）A、B1、E和增殖细胞核抗原以及GFAP、CSPG和GAP-43的表达较弱;脊髓损伤后cyclinA、cyclinB1、cyclinE和细胞周期素（PCNA）等细胞周期相关蛋白的表达显著增高,星形胶质细胞明显活化增殖,GFAP和CSPG的表达明显增强（均P〈0．01）,GAP-43的表达高于假手术组（P〈0．05）;给予olomoucine干预后,细胞周期相关蛋白的表达显著下调,损伤区域星形胶质细胞的增殖和胶质瘢痕形成受到抑制,胶质瘢痕产生的CSPG的表达明显减少,GAP-43的表达显著增高,瘫痪后肢的运动功能明显改善（均P〈0．05）。结论 olomoucine可通过调控细胞周期,抑制脊髓损伤后胶质细胞的活化增殖和胶质瘢痕的形成,减少抑制因子CSPG的表达以及上调有利于轴突再生的GAP-43的表达。改善损伤后轴突再生微环境最终促进瘫痪后肢的运动功能恢复。     

细胞周期素依赖性激酶抑制剂olomoucine对大鼠脊髓损伤后轴突再生微环境的影响及其意义

探讨细胞周期素依赖激酶抑制剂olomoucine对脊髓损伤后轴突再生微环境的影响及意义。建立脊髓半切损伤模型，实验大鼠随机分为假手术组、损伤对照组和olomoucine干预组，采用Western印迹分析脊髓损伤后细胞周期相关蛋白的表达；应用免疫荧光技术检测损伤区域胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、硫酸软骨素蛋白（CSPG）以及生长相关蛋白43（GAP-43）的表达；采用改良的Gale联合评分法对大鼠瘫痪后肢进行运动功能评估。结果，假手术组细胞周期素（cyclin）A、B1、E和增殖细胞核抗原（PCNA）以及GFAP、CSPG和GAP-43的表达较弱；     

利用RNAi建立脊髓性肌萎缩症的细胞模型

目的：应用RNA干扰沉默SMNI基因的表达建立脊髓性肌萎缩症（SMA）的细胞模型。方法：将pshRNA—SMN1重组质粒转染人骨髓间充质干细胞（hMSCs）,经G418筛选得到能稳定表达目的shRNA的单克隆细胞系后将其诱导分化为神经元样细胞（NLCs）建立SMA细胞模型组。同期设立转染重组质粒pshRNA-0的对照组和未转染重组质粒的空白对照组。观察NLCs的细胞形态,采用免疫细胞化学染色分析NLCs的NSE和NF蛋白表达,用RT—PcR和免疫印迹方法检测NLCs的SMN mRNA及其蛋白表达。结果：诱导后各组细胞呈典型的神经元样细胞形态且NSE和NF蛋白表达阳性;其fl-SMNmRNA,△7-SMN mRNA及n—SMN蛋白表达均较诱导前增加（P＜0．05）,但SMA细胞模型组的fl-SMN mRNA及蛋白表达仍明显低于对照组（P＜0．01）;而诱导后△7-SMN mRNA的表达在各组间差异无统计学意义（P＞0．05）。结论：SMN1 mRNA及其蛋白被抑制的MSCs诱导分化为NLCs后可以作为SMA的细胞模型。     

星形胶质细胞对PC12细胞的分化及突触素和生长相关蛋白43表达的影响

目的：体外观察星形胶质细胞对PC12细胞向神经元分化的作用，以及对PC12细胞突触素和生长相关蛋白43（GAP-43）表达的影响，探讨星形胶质细胞促进非神经元细胞形成神经突触的可能性。方法：采用PC12细胞与新生大鼠皮层组织来源的星形胶质细胞共同孵育，分为共育组和对照组，应用免疫荧光技术检测星形胶质细胞对PC12细胞分化、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、突触素和GAP-43表达的影响。结果：共育组培养4d，大部分PC12细胞已具备神经元形态，PC12有突细胞／总细胞数目比率、突起长度和突触数目明显高于对照组（P〈0．01）；NSE、突触素和GAP-43免疫荧光染色强阳性的PC12细胞明显增多，与对照组比较具有统计学意义（P〈0．01）。结论：提示星形胶质细胞有助于促进非神经元细胞形成神经突触。     

脊髓损伤后m6A甲基化修饰在神经干细胞自发分化中的调控作用

目的探讨脊髓损伤后mRNA m6A甲基化修饰对神经干细胞自发分化的调控作用。方法8周龄C57小鼠构建脊髓钳夹损伤模型,采用后肢运动功能评分（basso mouse scale, BMS）评价小鼠脊髓钳夹损伤模型构建情况;脊髓组织冰冻切片免疫荧光染色检测脊髓损伤1、3d后,损伤位点周围神经干细胞的数量及m6A甲基化水平;microRNA干扰技术敲低神经干细胞内的METTL14蛋白表达,并利用细胞免疫荧光检测神经干细胞自发分化后,神经元细胞、少突胶质细胞及星形胶质细胞数量;Western印迹法及Northern印迹法检测髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein, MBP）与神经干细胞共培养后神经干细胞内METTL3、METTL14、FTO及ALKBH5蛋白表达情况及细胞内m6A甲基化水平。结果BMS评分结果表明小鼠脊髓钳夹损伤模型构建成功。免疫蛋白印迹结果显示,脊髓损伤后组织内脊髓损伤后星形胶质细胞的细胞标志蛋白GFAP显著增加,神经元标志蛋白NeuN和少突胶质细胞标志蛋白MBP表达显著降低。组织免疫荧光结果表明,损伤早期受损位点周围神经干细胞标志蛋白NESTIN达量增加,但m6A水平减少。细胞免疫荧光结果表明,m6A甲基化水平降低可促进神经干细胞神经向星形胶质细胞的自发分化。免疫蛋白印迹结果显示,MBP处理神经干细胞可使细胞内METTL3/METTL14表达量及细胞整体m6A甲基化水平降低。结论脊髓损伤后mRNA m6A甲基化降低可促进神经干细胞向星形胶质细胞分化。     

存活蛋白反义寡核苷酸对XWLC-05细胞的影响

目的 研究存活蛋白反义寡核苷酸对宣威肺腺癌细胞株(XWLC)-05增殖、凋亡及细胞周期的影响.方法 通过设计合成XWLC-05靶向存活蛋白反义寡核苷酸.将其分为对照组、单纯脂质体组(Lip组)、正义寡核苷酸转染组(Lip-SODN组)、反义寡核苷酸转染组(Lip-ASODN组).转染48 h后,蛋白质印迹法检测各细胞组中存活蛋白表达情况,流式细胞仪检测各细胞组凋亡率.结果 转染后的XWLC-05 存活蛋白表达明显下降.Lip-ASODN组细胞在12、24、48 h凋亡率分别为3.01±0.26、7.89±2.63、17.24±3.92,明显高于其他组(P<0.05).结论 存活蛋白反义寡核苷酸转染能下调宣威肺腺癌细胞株XWLC-05存活蛋白表达,诱导细胞凋亡,抑制细胞增殖.     

利用CRISPR/Cas9建立PIN1基因敲除的成体神经干细胞系

目的：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除成体神经干细胞（neural stem cell,NSC）PIN1基因,建立PIN1基因敲除的成体神经干细胞系。方法：取8周龄C57BL/6小鼠脑室下区的脑组织进行体外培养;设计靶向小鼠PIN1基因的单导向RNA（single guide RNA,sgRNA）,以PX330质粒为骨架,构建PIN1的Cas9打靶载体,转染小鼠的成体神经干细胞,通过puro筛选和测序鉴定获得PIN敲除的单克隆细胞;利用免疫荧光染色和Western blot测定PIN1蛋白表达水平,免疫荧光染色鉴定神经干细胞的特征性标志物巢蛋白（Nestin）的表达,Beta Ⅲ Tubulin免疫荧光染色鉴定神经干细胞分化为神经元的能力。结果：成功构建PIN1基因的Cas9/sgRNA表达载体,转染后获得PIN1敲除的神经干细胞克隆9个。免疫荧光染色及Western blot显示PIN1蛋白无表达,免疫荧光染色显示PIN1敲除的神经干细胞Nestin阳性,神经干细胞分化培养时可部分分化为Beta Ⅲ Tubulin阳性的神经元细胞。结论：CRISPR/Cas9基因编辑技术可实现对小鼠成体神经干细胞PIN1基因的编辑。在PIN1基因敲除后PIN1蛋白无表达,初步表型分析显示,神经干细胞仍表达特征性标志物Nestin,并具有向神经元分化的能力。     

PPARγ基因修饰对兔骨髓间充质干细胞成脂分化及ADRP、LPL表达的影响

目的观察过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）基因转染对免骨髓间充质干细胞（MSCs）向脂肪细胞分化的影响,探讨PPARγ在脂肪细胞早期分化中可能的调控机制。方法原代培养新西兰大白兔MSCs,应用脂质体介导法将pEGFP-N1-PPARγ表达载体转入MSCs中,G418筛选。分成不诱导组、空转染诱导组及转染诱导组以成脂诱导剂诱导分化,每日观察细胞形态学变化,镜下计数并计算脂肪细胞分化率,采用RT-PCR方法检测脂肪分化相关蛋白（ADRP）、脂蛋白脂酶（LPL）mRNA表达,Western blot检测ADRP、LPL蛋白表达。结果不诱导组细胞内没有脂滴出现,空转染诱导组和转染诱导组部分细胞成功分化为脂肪细胞,转染诱导组分化率明显高于空转染诱导组（P〈0.05）;不诱导组ADRP、LPLmRNA及蛋白均不表达,转染诱导组ADRP、LPLmR-NA及蛋白表达水平显著高于空转染诱导组（P〈0.05）。结论PPAR-γ基因转染MSCs可促进其向脂肪细胞分化,增强其分化能力,可能与促进ADRP、LPL基因和蛋白的表达有关。     

miR-205促进hAS Cs细胞系向软骨细胞方向分化的作用及机制研究

目的 探讨微小RNA(miR)-205通过调控核心结合因子α-1(Cbfα-1)表达促进人脂肪干细胞(hASCs)细胞系向软骨细胞方向分化的作用及机制.方法 慢病毒转染法将Lenti-miR-205、Lenti-control慢病毒液分别转染至hASCs细胞,命名为miR-205过表达组、miR-NC组,另取未处理细胞为对照组;RT-qPCR法检测转染后miR-205基因表达量,MTT比色法检测细胞增殖;用甲苯胺蓝染色、免疫细胞染色及免疫荧光染色观察转染后第3代hASCs细胞诱导分化情况,RT-qPCR、Western blot法检测诱导分化2周后各组Cbfα-1、Smad3、TGF-β1、ColⅡmRNA和蛋白表达.结果 转染后miR-205过表达组miR-205基因相对表达量高于miR-NC组和对照组(P<0.001).miR-205过表达组转染后hASCs细胞培养3、7 d MTT试验吸光度(A)值高于对照组和miR-NC组(P<0.05).诱导分化2周后,甲苯胺蓝染色显示,miR-205过表达组细胞染色呈强阳性深蓝染色,对照组和miR-NC组为微弱浅蓝色;免疫细胞化学染色显示,miR-205过表达组细胞及胞外基质强阳性棕黄染色,对照组和miR-NC组为弱阳性淡黄染色;免疫荧光染色显示,miR-205过表达组红色荧光强度较强,对照组和miR-NC组红色荧光强度较暗淡.miR-205过表达组诱导分化后Cbfα-1 mRNA和蛋白相对表达量低于对照组和miR-NC组,Smad3、TGF-β1、ColⅡmRNA和蛋白相对表达量高于对照组和miR-NC组(P<0.05).结论 miR-205过表达可促进hASCs细胞增殖、促进细胞向软骨细胞方向分化,可能通过抑制Cbfα-1、激活TGF-β1/Smad3信号通路发挥调控作用.     

大鼠脊髓半切损伤后突触分化诱导基因产物SynDIG1的表达增强

目的 探讨大鼠脊髓半切损伤后(spinal cord injury, SCI) 突触分化诱导基因产物(synapse differentiation induced gene 1,SynDIG1)的表达变化及意义.方法 SD大鼠随机分成对照组和脊髓损伤组(n=75),切断大鼠脊髓一半作为实验模型,只咬除椎板而不损伤大鼠脊髓作为对照模型.在手术后7、14、21、28、35天采集损伤区域的脊髓组织,用免疫荧光和免疫印迹技术检测各组各时间点SynDIG1的蛋白表达,并且与半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)、神经生长蛋白43(GAP-43)等神经元特异性标志物做免疫荧光双标技术检测.结果 在脊髓损伤后第7天就发现神经元有SynDIG1表达,在第28天达到高峰,随后维持在较高水平.通过免疫荧光双标技术发现脊髓损伤后SynDIG1与GAP-43存在共表达.结论 脊髓损伤后中期神经元大量表达SynDIG1,激活了神经生长因子,促进神经元再生,有利于神经系统的修复.     

小鼠坐骨神经S180肉瘤侵害后脊髓GAP-43表达的实验研究

目的研究S180肉瘤对小鼠坐骨神经受损害后脊髓生长相关蛋白(GAP-43)表达的影响.方法采用小鼠后肢肌肉内坐骨神经走行处接种S180肉瘤细胞悬液的方法,建立坐骨神经受肿瘤损害的动物模型,分别在坐骨神经损害后4、7、14、21天和28天取出小鼠相应节段的脊髓,免疫组织化学法观察生长相关蛋白GAP-43的表达,并对实验结果进行图像分析.以相同时间段的坐骨神经外伤损伤组为对照.结果实验组和对照组相应节段脊髓灰质细胞均出现GAP-43表达,7天以内两组无差别.对照组于伤后7天达高峰,实验组于神经损害后14天达高峰,与各自时间段比差异有显著性(P<0.01).结论S180肉瘤损害小鼠坐骨神经后可引起脊髓灰质细胞GAP-43表达.     

经皮电刺激促进坐骨神经损伤大鼠脊髓GAP—43mRNA的表达

目的：观察经皮电刺激对坐骨神经损伤大鼠的脊髓中神经生长相关蛋白－43（GAP－43）mRNA表达的影响。方法：60只Wistar大鼠制成坐骨神经损伤模型,经皮电刺激治疗后,用原位杂交技术观察坐骨神经相应脊髓节段GAP－43mRNA的表达。结果：电刺激组第1d阳性细胞数增多,7d达高峰,14d后明显减少,28天后基本未见阳性细胞存在;模型组第1d至第7d持续阳性细胞数增多,14d略减少,28d后仍可见阳性细胞存在。结论：电刺激能缩短GAP－43mRNA表达时间,有利于突触重建。     

MK-801与七叶皂苷纳联合应用对损伤脊髓细胞的保护作用

目的探讨N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂MK-801与七叶皂苷钠联合应用对损伤脊髓细胞的保护作用。方法60只大鼠随机分为治疗组、对照组和正常组,采用改良Allen背侧打击法、损伤脊髓。治疗组给予MK-801与七叶皂苷钠,对照组给生理盐水。受伤后1d、3d检测脊髓组织SOD活性及MDA食量,并用免疫组化方法检测脊髓组织内神经生长和修复相关GAP-43,MAP-2和CyclinD1的表达情况。结果对照组SOD活性降低,MDA含量增高(P<0.05),神经组织呈破坏性改变,损伤区周GAP-43、MAP-2和CyclinD1表达增高(P<0.05),治疗组可减轻脊髓组织损害,并增强GAP-43和MAP-2的表达(P<0.01),抑制CyclinD1的表达。结论脊髓损伤后MK-801与七叶皂苷钠联合应用可减轻脊髓组织水肿,清除自由基,抑制细胞凋亡和蛋白水解,对损伤脊髓细胞有明显保护作用,并促进神经组织的修复。     

大鼠脊髓横断伤后大脑运动皮质的再生反应的实验研究

目的研究成年SD大鼠大脑运动皮质在脊髓横断伤后的再生反应。方法在胸9水平完全横断脊髓，术后1、3、5、7和14d，取大鼠大脑运动皮质和脊髓分别进行GAP-43mRNA组织原位杂交和NF200免疫组化。结果大鼠在脊髓横断伤后出现大脑运动皮质GAP-43mRNA表达，主要分布在大脑运动皮质的V、Ⅵ层；脊髓横断伤组在术后14d内，脊髓断端白质内NF200的表达逐渐由稀疏至消失。结论实验揭示了大鼠脊髓横断后，皮质脊髓束神经元在两周内不会出现数量减少；并发现大脑运动皮质在皮质脊髓束横断后能出现短时间的再生反应。     

脊髓内移植纤维蛋白胶包裹嗅粘膜固有层促进损伤轴突再生

目的：将富含嗅神经鞘细胞的大鼠嗅粘膜固有层(OLP)碎片裹以纤维蛋白胶(FG)，移植到脊髓全横断断端间隙内，观察对脊髓两断端连接及轴突再生的影响。方法：成年雄性SD大鼠24只，全横断胸10节段脊髓。分别于脊髓断端间隙内移植OLP(OLP组)、FG包裹的OLP(FG-OLP组)或等量的FG(FG组)，每组6只；另6只仅行脊髓横切（单纯全切组）。10wk后处死动物，取材观察四组大鼠脊髓断端的连接情况。再取损伤区2cm范围脊髓节段，行冰冻水平切片，免疫组化ABC法染色，观察神经丝（NF）和生长相关蛋白－43(GAP－43）免疫组化染色阳性神经纤维的分布与形态，同时行NF和GAP－43的免疫荧光双标染色，激光共聚焦显微镜下观察两者的相互关系及形态异同。结果：单纯全切组和OLP组脊髓两断端连接较差;FG组和FG－OLP组断端连接较好，少有空洞。单纯全切组和FG组损伤区可见少量NF及GAP－43免疫组化染色阳性纤维，分布弥散，纤维细小，排列方向凌乱。OLP组可见较多NF及GAP－43免疫组化染色阳性纤维，但未见跨越脊髓横切部位；而FG－OLP组损伤区内有大量NF及GAP－43免疫组化染色阳性纤维，并跨越脊髓横切部位。NF和GAP－43免疫荧光双标结果显示，二者在损伤区的分布相同。结论：脊髓断端间隙内移植FG包裹的OLP碎片可促进脊髓两断端的连接及轴突的再生。     

补肾对脑脊髓炎大鼠生长相关蛋白-43及微管相关蛋白-2的影响

目的观察补肾对实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)大鼠生长相关蛋白-43(GAP-3)及微管相关蛋白-2(MAP-2)的影响,探讨其对轴突损伤的保护作用。方法应用髓鞘碱性蛋白(MBP)与完全福氏佐剂按1∶1(体积比)制成抗原并注射于大鼠双后足皮下,建立大鼠EAE模型。以醋酸泼尼松作对照,用苏木素-伊红染色(HE)观察各组大鼠造模后14 d、28 d脑和脊髓的组织病理变化,用轴突染色及免疫组织化学染色法观察脑和脊髓轴突损伤及再生情况。结果EAE模型组大鼠脑和脊髓组织中可见大量炎性细胞浸润,轴突存在明显损伤。脑和脊髓GAP-43及MAP-2表达显著降低,与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.05或0.01),分别用补肾方剂(左归丸和右归丸)干预后,大鼠炎症反应及轴突损伤较EAE模型组明显减轻,GAP-43及MAP-2表达明显高于模型组(P<0.05或0.01),以左归丸更为明显。结论补肾方剂能够上调GAP-43及MAP-2的表达,具有促进和增强轴突再生的作用。     

眼镜蛇毒神经生长因子对去部分背根猫脊髓背角内GAP-43表达的影响

目的观察眼镜蛇毒分离纯化出的神经生长因子(NGF)对去部分背根猫脊髓背角内生长相关蛋白-43(GAP-43)表达的影响。方法对45只成年雄性家猫切除一侧L1-L5、L7-S2背根节,保留L6背根及背根节为备用背根,按给药剂量将动物分成小剂量NGF组(1μg/kg)、大剂量NGF组(2μg/kg)和生理盐水对照组,每组15只,术后分别存活3、6、12d,对L6节段脊髓作GAP-43免疫组织化学检测。结果术后术侧GAP-43阳性反应产物主要分布在脊髓、、板层的神经终末;中央管室管膜细胞呈阳性反应;脊髓前角神经毯呈阳性反应,整个脊髓板层未见阳性反应的神经元。术后3d,三组术侧、、板层即有GAP-43阳性神经纤维的表达;术后6d,三组GAP-43阳性神经纤维数量明显增多,至术后第12d,神经纤维数量增加达高峰,治疗组神经终末数量增加明显,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01),不同时间段均以大剂量组的增多尤为显著。结论蛇毒NGF能有效诱导脊髓损伤修复过程中神经元GAP-43的合成而促进保留背根的侧支出芽,其密度与蛇毒神经生长因子的治疗剂量有关。     

环孢素对大鼠坐骨神经损伤后脊髓运动神经元的保护作用

目的:通过观察应用环孢素对大鼠坐骨神经切断后脊髓前角运动神经元GAP-43mRNA的表达,研究环孢素对脊髓前角运动神经元的影响。方法:60只大鼠随机分为实验组和对照组,实验组进行环孢素干预,在3、7、14、21、28天,5个不同的时相点各从实验组和对照组中随机抽取6只大鼠,取下脊髓T12-L1节段,脊髓前角GAP-43mRNA的表达用荧光定量RT-PCR检测。结果:对照组GAP-43mRNA第3日呈低表达,第7天表达量增加,第14天表达量达到高峰,第21天表达量下降,第28天表达量接近第3天水平。实验组第3、7和14天表达量与对照组相似,第21和28天表达量较对照组有所提高,经统计学处理,第3、7和14天实验组与对照组比较,差异无显著性(P>0.05),第21天和28天实验组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:应用环孢素对坐骨神经损伤后脊髓运动神经元有一定的保护作用,可延缓神经元的退变。     

Mage-D1与活化后的p75神经营养因子受体结合可正向调节大鼠外胚间充质干细胞的矿化

目的 检测Mage-D1与活化后p75NTR的结合及对外胚间充质干细胞（EMSCs）矿化的调控。方法 取孕19.5 d SD大鼠牙胚,组织贴壁法获取EMSCs,流式细胞术检测细胞表面抗原。设置实验分组：空白对照组（NC）,100 ng/mL NGF刺激组（100 ng/mL NGF）、慢病毒干扰Mage-D1组（SH-Mage-D1）。邻位连接技术检测Mage-D1与经NGF活化后p75NTR结合的变化,并比较不同分组间的结合强度差异。茜素红与ALP染色观察染色,RT-PCR与Western blot检测ALP、Runx2、OCN、BSP、OPN、Col1、Msx1及Dlx1的表达水平。结果 组织块贴壁法获得孕19.5 dEMSCs,流式细胞术检测细胞表面抗原结果为CD44、CD90、CD29、CD146,CD105高表达,CD45低表达;邻位连接法检测Mage-D1与经NGF活化后p75NTR的结合随着时间的延长而增多,且实验组与对照组相比结合强度差异具有统计学意义（P<0.05）;茜素红与ALP染色结果显示矿化结节与碱性磷酸酶与强度变化一致;RT-PCR与Western blot检测ALP、Runx2、OCN、BSP、OPN、Col1、Msx1及Dlx1在100 ng/mL NGF组最高（P<0.05）。结论 Mage-D1在外胚层间充质细胞中可与经NGF活化后的p75NTR直接结合,且二者的结合对EMSCs的矿化有正向调节作用。