地高辛标记探针检测重组人p43蛋白宿主DNA残留量的研究

目的:建立重组人p43蛋白原液中宿主DNA残留量的检测方法。方法:以重组人p43工程菌基因组DNA为模板,制备地高辛标记的探针,并以此探针与阳性对照品及供试品进行杂交及显色反应。结果:3批次重组人p43蛋白原液中每人份剂量的宿主DNA残留量均小于10 ng。结论:该方法灵敏度高,特异性强,重复性好,操作安全简便,可用于重组人p43制备过程中的原液检定及质量监控。     

地高辛标记探针检测重组人肿瘤坏死因子α衍生物中残余DNA

本文用地高辛标记工程菌ＤＮＡ片段作探针，通过分子杂交和免疫显色检测ｒ－ｈＴＮＦαＤ半成品和制剂中的残余ＤＮＡ。该法对半成品和制剂分别采用蛋白酶Ｋ膜后处理和酚与氯仿抽提方法，消除了蛋白质或甘露醇对ＤＮＡ测定的干扰。本法特异、准确，灵敏度达１ｐｇ／点。用此法测定３批ｒ－ｈＴＮＦαＤ半成品和制剂（ｎ＝５），其残余ＤＮＡ均小于１００ｐｇ／剂量且重复性较好。     

地高辛标记探针检测重组双功能水蛭素中的DNA残留量

为检测注射用重组双功能水蛭素半成品中的DNA残留量，应用地高辛标记重组双功能水蛭素工程菌DNA，并以此为DNA探针进行点杂交，同时做特异性及灵敏度实验，结果表明，该方法检测最低限值可达1pg,且重复性好，特异性强，操作较简便，可用于双功能水蛭素制备工艺的质控及半成品的检定。     

斑点杂交法测定Vero细胞DNA残留量的探针选择

目的：为精确检测以Vero细胞为基质的生物制品中宿主细胞残余DNA含量。方法：将提取的Vero细胞DNA分别用不同时间的超声波和HindⅢ内切酶进行断链处理，电泳和序列分析并确定DNA片段长度，地高辛标记后制备成检测探针，测定已知的不同浓度的样品DNA和疫苗中DNA残留量。结果：HindⅢ内切酶处理断链后产生172bp、344bp、516bp、688bp不同长度的DNA，并选取172bp长度的DNA片断和超声波处理30s的DNA长度为500～750bp的DNA片断作为检测用探针。结论：两种方法处理的DNA探针检测DNA的灵敏度可达0．1pg，重复性均较好，超声波处理的探针特异性优于酶切探针，并能成功的应用于疫苗产品中残余宿主细胞DNA的检测。     

生物制品中宿主细胞残留DNA检测的研究进展

宿主细胞残留DNA是指可能出现于生物制品中的来自宿主细胞的DNA片段。用传代细胞株生产的生物制品,其宿主细胞残留DNA可能会传递肿瘤或病毒相关基因,存在潜在的危险性。各国药品监督管理机构对宿主细胞残留DNA的残留量有着严格的限度控制,同时各国药典也提供数种经典的检测方法。建立合适的宿主细胞残留DNA检测方法有助于监测生产工艺,确保生物制品的安全性和质量。此文对宿主细胞残留DNA潜在的危害、国内外监管机构对宿主细胞残留DNA检测标准和检测方法以及各方法的特点及研究进展做一综述。     

定量PCR法和DNA杂交法检测聚乙二醇修饰尿酸酶原液中DNA残留量的比较

目的 建立快速准确的聚乙二醇修饰重组尿酸酶(PEGylated uricase,PEG-UHC)原液DNA残留量测定法,为其他多位点PEG修饰蛋白药物的DNA残留量检测提供参考。方法 参照中国药典2020年版三部“外源性DNA残留量检测法”第一法DNA探针杂交法和第三法定量PCR法,检测PEG-UHC原液DNA残留量;对定量PCR法进行检测限度、线性范围、准确度和精密度等方法学验证;进行3批次PEG-UHC原液DNA残留量测定。结果 探针杂交法DNA残留量测定线性范围为1×10^-4~0.1 ng·µL^-1,3批次PEG-UHC原液未见明显显色,DNA残留量均低于每剂10 ng。PCR法检测限度为1×10^-5 ng·µL^-1,DNA浓度在1×10^-4~100 ng·µL^-1内线性关系良好(R²=0.999)。不同浓度的标准DNA在PEG-UHC原液中的回收率范围为92.57%~114.17%,表明PEG偶联物对定量PCR影响较小。3批次PEG-UHC原液中DNA残留量分别为每剂0.143,0.187,0.154 ng,符合国家药品监督管理局限量要求。结论 DNA探针杂交法为传统定性检测,耗时较长,准确度较低。定量PCR法操作简便快速、灵敏度高,且可定量分析,适于PEG-UHC等多位点PEG修饰蛋白药物DNA残留量测定。     

地高辛核酸探针的制备及研究进展

核酸分子杂交技术是分子生物学、临床医学研究的重要手段之一。目前非同位素核酸探针标记方法所用的配基及检测手段繁多。且各具优缺点,其中尤以地高辛配基标记的核酸探针技术突出,其检测灵敏度可达同位素标记探针。具有灵敏、安全、简便、实用等优点,具有广阔的应用前景。     

标记死亡受体5、诱捕受体2地高辛探针

目的标记死亡受体5(death receptor-5,DR5/TRAILR2)和诱捕受体2(death decoyreceptor 2,DcR2/TRAILR4)地高辛探针。方法查阅核酸序列数据库上DR5和DcR2的基因全序列,计算机辅助设计引物,RT-PCR扩增目的条带,用地高辛(Digoxin,DIG)进行标记,制作DR5和DcR2地高辛探针。结果地高辛标记的DR5和DcR2电泳能力下降,标记成功。结论死亡受体5,诱捕受体2地高辛探针的标记成功为进一步研究其与喉鳞状细胞癌的关系奠定了一定的基础。     

重组人组织型纤溶酶原激活剂中细胞残余DNA的检测

采用地高辛标记探针,以核酸分子班点杂交技术检测重组人组织型纤溶酶原激活剂（ｒｔ－ＰＡ）中细胞残余ＤＮＡ的方法。从样品中去掉蛋白提取ＤＮＡ的方法能有效的避免蛋白对检测结果的干扰,其灵敏度和结果都能较好地达到ＷＨＯ的要求。     

SYBR-Green实时定量PCR用于Vero宿主细胞DNA残留量的检测

目的:建立基于SYBR-Green荧光染料实时定量PCR检测Vero宿主细胞DNA残留量的方法。方法:提取Vero细胞基因组DNA,设计细胞基因组高度重复顺序AGMr(HindIII)-1基因片段的特异性引物,通过PCR扩增AGMr(HindIII)-1序列中一段特异性cDNA片段,克隆至pGEM-T Vector,重组质粒经酶切及测序鉴定合格后命名为pGEM-T/AGMr(HindIII)-1-S。结果:使用重组质粒和细胞基因组DNA分别作为检测标准品,均取得了良好的结果,其检测灵敏度分别达到了0.03 fg.μL-1和0.03 pg.μL-1。结论:SYBR-Green实时定量PCR可用于Vero宿主细胞DNA残留量的准确定量。     

Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗宿主细胞DNA残留量检测方法研究

目的 建立Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗Vero细胞DNA残留量的检测方法.方法 提取Vero细胞基因组DNA,制备地高辛标记探针.比较样品不同处理方式的检测差异.对建立的残留DNA检测方法进行特异性、灵敏度和稳定性验证.结果 Vero细胞基因组DNA的质量浓度为295 μg/ml,260nm与280nm波长处的吸光度比值为1.88.探针灵敏度达到0.01 pg/μl.采用苯酚抽提方式处理DNA参考品,检测灵敏度为1 ng;而用碘化钠处理DNA参考品,灵敏度达到10 pg.特异性检测表明,探针与非同源DNA无杂交.灵敏度和稳定性检测结果显示,探针于-70℃保存9个月,灵敏度仍为10 pg.结论 建立了Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗Vero细胞DNA残留量的检测方法.采用碘化钠提取DNA,回收率高,操作简单,适用于Vero细胞的残留DNA检测.     

基于MDCK细胞培养的流感疫苗研究进展

流感一直是威胁全世界人类健康的疾病,每年引起数以亿计的人感染。疫苗是防控流感的重要手段。除了传统的鸡胚制备的流感疫苗,基于哺乳动物细胞培养的流感疫苗已研制成功。此文重点介绍哺乳动物MDCK细胞的不同培养方式,以及基于MDCK细胞培养的流感疫苗的研究进展。     

流感疫苗研究的新策略

疫苗接种是预防流感最有效的方法,但流感病毒的变异给疫苗研制带来了极大的困难,而减毒活疫苗能使机体获得持久免疫力,因此成为预防流感的重要疫苗.然而,目前研发的减毒活疫苗仍存在制备条件苛刻、安全性较差等问题.鉴于miRNA是调控宿主和病毒相互作用的关键因子,miRNA介导的减毒活疫苗给流感疫苗研发提供了新的思路.此文对近年来基于miRNA的流感疫苗研究进展做一综述.     

乙型脑炎减毒活疫苗原液的残余PHK细胞蛋白检测方法的验证

 目的   验证PHK细胞残余蛋白检测试剂盒检测乙型脑炎减毒活疫苗（乙脑疫苗）原液的残余PHK细胞蛋白的适用性。 方法   对PHK细胞残余蛋白检测试剂盒检测乙脑疫苗原液的残余PHK细胞蛋白的准确性、精密度、专属性、耐用性和线性进行验证。 结果   PHK细胞残余蛋白检测试剂盒检测乙脑疫苗原液的残余PHK细胞蛋白的准确性良好,PHK细胞蛋白标准品的回收率为96.16%~111.44%。该试剂盒在PHK细胞蛋白质量浓度为6.25~200.00 μg/L时呈现良好的线性,决定系数为0.997,最低检测限和最低定量限分别为6.70和22.33 μg/L。该试剂盒检测乙脑疫苗原液中的残余PHK细胞蛋白的专属性良好,而且操作人员、时间和试剂盒批号变化对检测结果没影响（相对标准偏差均≤15%）。 结论   PHK细胞残余蛋白检测试剂盒适用于乙脑疫苗中的残余PHK细胞蛋白检测。     

疫苗纳米粒技术及其在流感疫苗研发中的应用

随着纳米科技的发展,纳米粒技术也被运用于疫苗的开发,在增强疫苗的免疫原性、促进APC 对抗原的识别、延缓抗原在体内的降解、延长抗原在体内作用的时间等方面具有重要作用。此文就疫苗纳米粒技术及其在流感疫苗开发中的应用进行综述。     

乙酰丙酮比色法在流感病毒裂解疫苗游离甲醛含量测定中的应用

 目的   验证乙酰丙酮比色法测定流感病毒裂解疫苗游离甲醛含量的可行性,并确认该法测定游离甲醛含量优于品红亚硫酸法。 方法   对乙酰丙酮比色法进行准确度、精密度、专属性、线性、耐用性验证,并将该法与品红亚硫酸法进行比较。结果 乙酰丙酮比色法的标准曲线具有可靠性,甲醛回收率均为100.3%~100.9%,相对标准偏差（relative standard deviation,RSD）为0.49%。该法的精密度和专属性良好,实验间和实验内RSD均＜5.0%,甲醛加样回收率均＞99.0%。与品红亚硫酸法相比,该法的线性更好,偏差更小。结论  乙酰丙酮比色法可用于流感病毒裂解疫苗游离甲醛含量测定。     

动物细胞培养技术在流感疫苗研发中的应用进展

流感是由流感病毒引发的急性呼吸道传染病,每年可引起季节性流行。疫苗接种是预防和控制流感流行和大流行期间病毒感染的主要方法,目前流感疫苗生产主要仍依赖鸡胚培养技术,但近年来,使用动物细胞基质代替鸡胚培养已成为流感疫苗技术创新的重要趋势。随着贴壁培养及无血清全悬浮培养等培养技术在生物制药领域的发展,已有多种动物细胞系用于流感疫苗生产。本文简要综述近年来动物细胞培养技术在流感疫苗研发中的应用进展。     

测定六价轮状病毒疫苗各型病毒滴度的荧光灶试验的验证

目的  验证荧光灶试验（fluorescence focus assay,FFA）作为测定六价轮状病毒疫苗各型病毒滴度方法的可行性。方法  采用FFA法测定轮状病毒G1、G2、G3、G4、G8、G9型滴度,并验证该法的专属性、精密度、线性、准确性、范围和耐用性。 结果  各型病毒均可与对应的单克隆抗体（单抗）发生特异性荧光灶反应,不与抗异型病毒单抗发生交叉反应。试验内和试验间测定结果的相对标准偏差均小于5%。各型轮状病毒实测滴度与理论滴度间的线性相关系数均≥0.99。不同稀释度各型病毒的回收率为90%~120%。改变病毒培养时间对检测结果没有影响。该法的定量限为：G1、G2、G3、G4、G8、G9型滴度分别>2.8、>4.2 、>3.7、>3.6、>4.1和>4.2 lg荧光灶单位/ml,均符合六价轮状病毒疫苗的质控要求。结论  该法测定不同型轮状病毒滴度具有较好的专属性、精密度、线性和准确性,可用于六价轮状病毒疫苗各型病毒滴度的测定。     

四价流感病毒裂解疫苗的安全性研究

目的 对四价流感病毒裂解疫苗进行肌肉刺激性、急性毒性和过敏性评价,以考察其安全性.方法 对家兔后肢股四头肌肌肉注射0.5 ml四价流感病毒裂解疫苗,每天接种1次,连续接种2d,末次接种后48 h和16d对注射部位进行肉眼和病理组织学检查.对小鼠后肢肌肉注射0.2 ml疫苗后,连续4h和14d观察各种不良反应.豚鼠后肢隔天肌肉注射0.5 ml疫苗,共接种致敏3次,分别于末次接种后14和21 d静脉注射1.0 ml疫苗进行激发,观察豚鼠30 min内是否出现过敏反应.结果 家兔在末次接种后48 h和16 d,未观察到明显的局部刺激作用.小鼠接种后全部存活,摄食量和体重指标正常,注射部位肌肉、外观体征、行为活动、呼吸、排泄、各组织脏器肉眼观察均未见异常.豚鼠静脉注射疫苗后,活动正常,未出现1-20级过敏反应症状,全身主动过敏反应呈阴性.结论 四价流感病毒裂解疫苗无肌肉刺激性、急性毒性,不引发全身主动过敏性反应.