同种异体软骨细胞复合PLGA支架修复关节软骨缺损的免疫学观察

目的应用同种异体软骨细胞移植修复兔膝关节软骨缺损,评估术后免疫学表现及其修复效果。方法供体为1月龄新西兰兔1只,取其膝关节全层软骨片,0.25%胰蛋白酶和0.2%Ⅱ型胶原酶消化,分离培养软骨细胞。受体为4月龄新西兰兔30只,暴露股骨髁前面关节面,用钻在股骨内髁制作直径4mm、深2mm（达髓腔）的关节软骨缺损模型。软骨细胞移植组植入体外培养12d的PLGA软骨细胞复合体,PLGA移植组只植入PLGA,假手术组只做皮肤切开手术。术后不固定患肢,兔笼中活动。术前、术后3、5、7、12周分离受体外周血淋巴细胞,检测其与异体软骨细胞和PLGA混合后的刺激指数（stimulation index,SI）;术后5、7、12周取修复区软骨及软骨下骨观察局部组织学反应。结果软骨细胞移植组术后检测到淋巴细胞增殖,移植物局部见到淋巴细胞浸润。结论同种异体软骨细胞复合PLGA移植存在免疫反应。     

骨髓间充质干细胞和软骨细胞共培养复合同种异体脱钙骨基质修复关节软骨全层缺损

目的:探讨自体骨髓间充质干细胞(BMSCs)与软骨细胞共培养复合同种异体脱钙骨基质(DBM)修复关节软骨缺损的可行性,评价修复效果,为优化种子细胞源提供依据.方法:取浓度为5×109/L的第二代BMSCs和软骨细胞,按2:1比例混匀共培养作为种子细胞.DBM与共培养细胞复合植入修复为实验组(A组),单纯材料DBM组(B组)和不处理组(C组)作为实验对照组.移植8和16 wk后经大体观察、组织学评分和免疫组化染色评价缺损修复.结果:共培养的软骨细胞基质合成丰富,细胞增殖快,共培养5～7 d两种细胞比例达1:1以上.A组缺损修复组织呈软骨样,表面光滑平坦,与周围软骨整合的软骨细胞更为成熟.B组和C组的修复组织呈纤维组织.组织学评分表明A组优于B,C两组,差异具有统计学意义(P＜0.01),B组与C组差异无统计学意义(P＞0.05).免疫组化染色显示A组修复组织的细胞为透明软骨样细胞,柱状排列,Ⅱ型胶原染色阳性,与周围软骨及软骨下骨整合良好.结论:自体BMSCs与软骨细胞共培养,BMSCs能增强软骨细胞的增殖,促进软骨细胞基质合成,缩短软骨细胞培养时间和减少传代次数,可节省大量的软骨细胞,与DBM复合后能有效修复关节软骨缺损.     

异体脱蛋白松质骨复合骨唾液酸蛋白修复兔桡骨缺损

目的 探讨骨唾液酸蛋白(Bone sialoprotein,BSP)在修复新西兰大白兔桡骨缺损中对骨形成和骨改建的作用,本实验拟评价骨唾液酸蛋白在兔体内的成骨活性,并为临床治疗骨缺损提供理论基础.方法 采选用合适龄新西兰大白兔36只,前肢中段外侧骨段(连同骨膜)15mm,建立兔桡骨缺损模型,随机分为脱蛋白松质骨复合骨唾液酸蛋白组(A组),脱蛋白松质骨组(B组),自体骨移植组(C组),分别于骨缺损处植入蛋白松质骨复合骨唾液酸蛋白,脱蛋白松质骨,自体骨移植,并在术后第4、8、10、12周,ABC三组各组随机选择3只动物,处死后游离桡骨标本备检.分别观察各组动物桡骨愈合x线片正侧住片情况,肉眼观察标本愈合情况,组织学观察.结果 ①脱蛋白松质骨复合骨唾液酸蛋白组肉眼观察,X线检查,HE染色均显示骨愈合均快于脱蛋白松质骨组,②脱蛋白松质骨复合骨唾液酸蛋白组肉眼观察,X线检查,HE染色均显示骨愈合均稍慢于自体骨移植组.结论 脱蛋白松质骨复合骨唾液酸蛋白组与脱蛋白松质骨组相比,成骨活性增加,具有一定程度成骨活性,但较自体骨仍有差异.     

异体脱蛋白松质骨复合骨唾液酸蛋白修复兔桡骨缺损

目的探讨骨唾液酸蛋白（Bone sialoprotein,BSP）在修复新西兰大白兔桡骨缺损中对骨形成和骨改建的作用,本实验拟评价骨唾液酸蛋白在兔体内的成骨活性,并为临床治疗骨缺损提供理论基础。方法采选用合适龄新西兰大白兔36只,前肢中段外侧骨段（连同骨膜）15mm,建立兔桡骨缺损模型,随机分为脱蛋白松质骨复合骨唾液酸蛋白组（A组）,脱蛋白松质骨组（B组）,自体骨移植组（C组）,分别于骨缺损处植入蛋白松质骨复合骨唾液酸蛋白,脱蛋白松质骨,自体骨移植,并在术后第4、8、10、12周,ABC三组各组随机选择3只动物,处死后游离桡骨标本备检。分别观察各组动物桡骨愈合X线片正侧位片情况,肉眼观察标本愈合情况,组织学观察。结果①脱蛋白松质骨复合骨唾液酸蛋白组肉眼观察,X线检查,HE染色均显示骨愈合均快于脱蛋白松质骨组,②脱蛋白松质骨复合骨唾液酸蛋白组肉眼观察,X线检查,HE染色均显示骨愈合均稍慢于自体骨移植组。结论脱蛋白松质骨复合骨唾液酸蛋白组与脱蛋白松质骨组相比,成骨活性增加,具有一定程度成骨活性,但较自体骨仍有差异。     

同种异体脂肪干细胞复合脱钙骨材料修复兔尺骨缺损

目的：探讨同种异体脂肪干细胞（adipose—derivedstemcells,ADSCs）组织工程骨修复兔管状骨缺损的可行性。方法：获取新西兰大白兔的肩胛部脂肪,分离培养具有多向分化潜能的ADSCs;第三代兔ADSCs与脱钙骨复合后,体外成骨诱导培养（LG—DMEM）设为对照。制造兔两侧尺骨临界大小（长度15mm）的缺损,分别植入兔ADSCs一脱钙骨复合物（实验侧）和单纯脱钙骨材料（对照侧）;12周后取样本,三维CT和组织学检测观察成骨情况。结果：细胞一材料复合物植入12周后,三维CT显示实验侧有新生骨基质长成,对照侧未见骨组织生成;组织学检测显示实验侧缺损区被典型的骨组织取代,可见新生骨小梁附着于脱钙骨表面,而对照侧只有少量的骨组织和纤维组织充填。结论：兔ADSCs能在脱钙骨上很好的黏附和生长,兔ADSCs-脱钙骨材料复合物植人体内能成功修复临界大小的管状骨缺损。     

聚羟基丁酸酯-羟基戊酸酯支架复合同种异体软骨细胞修复关节软骨缺损的实验研究

目的:探讨聚羟基丁酸酯-羟基戊酸酯(PHBV)三维多孔材料作为软骨组织工程支架的可行性及有效性.方法:采用"压片-热处理-粒子析出技术"制备PHBV多孔支架.体外分离培养软骨细胞后接种到PHBV支架体外培养4周,期间扫描电镜观察细胞在支架上的生长情况,然后与单纯PHBV支架同时植入兔膝关节软骨缺损区继续培养4、8、12周后取材,分别行大体、组织学、Ⅱ型胶原免疫组化观察.进行Wakitani评分,观察其体内修复关节缺损效果.结果:电镜观察示软骨细胞在支架上黏附、增殖良好并能分泌细胞外基质,组织学观察示PHBV支架浅层有新生软骨组织形成,于4周后开始形成透明软骨样结构且表面基本平整与宿主整合良好,组织学切片上可见类软骨形成并分泌甲苯胺蓝异染的软骨基质和软骨特异性Ⅱ型胶原. 结论:PHBV可以作为软骨组织工程支架材料,能够用于再生修复软骨的缺损.     

点种法同种异体兔软骨移植修复关节软骨缺损的研究

将 30只新西兰纯种兔共 60个膝关节随机分为 3组 :软骨块点种法移植组、软骨细胞点种法移植组和对照组。分别于术后 2、4、1 2、2 4周取标本行大体、光镜、电镜的组织学动态观察 ,并同时对修复组织进行组织学和组织化学质量评估 ,观察点种法软骨移植术修复透明软骨的效果。结果显示 :2种点种法移植组均能获得透明软骨修复 ,而对照组缺损区仅为纤维组织填充 ,并且点种法移植组兔各期平均组织学和组织化学得分均高于对照组 (P <0 .0 1 )。提示 :点种法软骨移植能获得透明软骨修复 ,尤其适用于大面积软骨缺损。     

自体软骨细胞立体培养修复兔关节软骨缺损的实验研究

目的探讨自体软骨细胞立体培养构建的组织工程软骨修复关节软骨的效果。方法24只4～6月龄新西兰大白兔进行标记,首先在股骨下端建立动物软骨3.5mm缺损模型,获取软骨细胞进行体外培养、扩增,3代后获取足够细胞数量,制成1×108/ml细胞悬液,植入细胞载体Ⅰ型胶原海绵培养,两周后移植到自体3.5mm的软骨缺损面上,分别1、2、3个月处死观察。结果软骨细胞与细胞载体Ⅰ型胶原海绵有良好组织相溶性,两者培养形成自体组织工程软骨能完成关节软骨缺损修复。第1个月修复组织初步具备纤维软骨特征,第2个月初步具备透明软骨特征,第3个月修复组织具备透明软骨的生物学特性。结论细胞载体Ⅰ型胶原海绵与软骨细胞体外培养形成的组织工程软骨,能完成关节软骨的修复,修复组织为透明软骨。     

软骨细胞纤维蛋白胶混合物修复兔关节软骨缺损的实验研究

目的：研究关节软骨细胞与纤维蛋白胶的混合物修复关节软骨全层缺损的效果。方法：（１）用自制消化瓶消化分离原代兔关节软骨细胞并培养;（２）通过硫酸铵沉淀法从兔血液中提取纤维蛋白原并制备纤维蛋白胶;（３）分别用自体或异体关节软骨细胞和纤维蛋白胶的混合物修复兔股骨滑车关节软骨全层缺损。术后１、２、３个月从大体观察,组织学等方面了解关节软骨缺损的修复情况。结果：自体软骨细胞组在术后３个月时修复组织已非常类似     

去抗原牛松质骨块/bBMP复合材料修复兔长骨骨缺损

探讨大块异种骨的制备及其在修复节段性骨缺损中的作用。方法将大块的牛松质骨制备成消除抗原性的载体,与牛骨形态发性蛋白（ＢＭＰ）组合构成去抗原牛松质骨块／ｂＢＭＰ复合材料,采用兔桡骨１５ｍｍ节段性骨缺损模型,研究去抗原质骨块／ｂＢＭＰ复合材料在修复骨缺损中的作用。     

抗坏血酸/聚已酸内酯生物材料修复新西兰白兔软骨缺损

目的 探讨抗坏血酸复合聚已内酯(PCL-AA)生物材料在关节软骨缺损修复过程中的作用.方法 将8只雄性6月龄新西兰白兔完全随机分成3组,每只动物于双侧膝关节股骨膑股关节面制备直径3.5 mm、深3 mm的单纯软骨缺损模型,不钻通骨髓腔.A组:PCL-AA;B组:单纯PCL材料;C组:单纯手术空白对照,其中A、B两组填充材料后加入制备好的纤维蛋白胶(10 μg)和凝血酶原(10 μg)混合物以固定材料,空白对照组制备缺损仅冲洗缝合,不予特殊处理.于术后6周和12周,取材,进行大体观察、HE染色、番红固绿染色、Wakitani修复效果评分以及相关定量分析.结果 6周标本外观上A组修复效果明显优于B组,C组未见软骨缺损修复,边界清楚,中央凹陷明显.A组缺损被白色半透明坚硬组织修复,富有光泽.Wakitani评分A组优于B、C两组(P＜0.05).12周A组番红固绿染色显示软骨修复情况优于6周A组标本.HE染色各组均未见急慢性炎症细胞浸润.新生软骨面积百分数和新生软骨细胞数定量分析提示PCL-AA组均明显大于单纯PCL材料组(P＜0.05),C组未见明显软骨长出.结论 PCL-AA生物材料具有良好的生物相容性,可以有效修复兔关节软骨损伤,可能成为关节软骨损伤治疗新的治疗方法.     

血管化组织工程骨修复兔股骨干骨缺损

目的 观察血管化组织工程骨修复兔股骨干骨缺损的成骨特点,初步探讨其修复骨缺损的机制.方法 32只新西兰大白兔均制备左侧股骨干15 mm段性骨缺损模型,随机分为两组,实验组:兔自体骨髓基质干细胞复合β-磷酸三钙(β-TCP)构建组织工程骨同时联合血管柬植入骨缺损;对照组:单纯植入组织工程骨.于术后2、4、8、12周行组织学观察骨形成与改建情况,同时行免疫组织化学,荧光定量聚合酶链反应,免疫印迹检测修复骨段内血管内皮生长因子(VEGF)的表达.结果 组织学观察显示随着时间发展,两组成骨量均逐渐增加,从4周起实验组骨修复优于对照组;实验组各时间点组织工程骨中VEGF的表达量高于对照组,随着时间延长,VEGF呈先增高后降低趋势,在4周时表达量最大.结论 血管化组织工程骨可有效促进兔股骨缺损的修复,植入血管束能促进VEGF的表达,VEGF是促进骨再生和血管再生的重要因子.     

含天然钙化层的骨软骨材料修复猪膝关节软骨缺损

目的 构建含和不含天然钙化层的修复材料,比较两者在猪膝关节软骨缺损修复中的效果,探讨钙化层在骨软骨组织工程中的重要性.方法 选取普通实验猪膝关节骨,软骨通过Ⅱ型胶原水凝胶冻干技术和天然骨软骨脱细胞技术构建含有钙化层和无钙化层的骨软骨支架,以贵州小香猪自体骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)为种子细胞,构建移植修复材料.30只小香猪按随机数字表法分为空白对照组、无钙化层组、含钙化层组(n=10).双膝关节滑车骨软骨缺损造模,直径8 mm,深至软骨下骨,植入对应的修复材料.分别于12、24周取材,采用大体、体式显微镜观察,以及MRI检测缺损填充情况,HE染色、番红0-固绿染色,以及Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白免疫组化染色观察新生修复物的组织类别,O'Driscoll组织学评分评价修复效果.结果 各组术后24周修复效果较12周均有改善.大体和体式显微镜观察,24周空白对照组新生组织部分填充缺损,为纤维组织,软骨表面凹陷深大;无钙化层组移植物填充缺损,软骨表面凹陷;含钙化层组缺损填充较好,表面微凹陷,三层结构可见,与宿主组织整合佳.组织学观察提示空白对照组为纤维组织填充修复;无钙化层组为骨和纤维软骨修复,三层结构不明显;含钙化层组钙化层结构清晰,移植物与宿主整合,软骨表面微凹陷,透明软骨修复.O'Driscoll组织学评分,12、24周空白对照组分别为(3.80±0.83)、(5.50 ±0.52)分,无钙化层组分别为(10.30±0.63)、(14.20±0.68)分,含钙化层组分别为(15.10±0.58)、(18.80±0.87)分,各组评分差异均有统计学意义(P＜0.01),含钙化层组评分最高.结论 含有天然钙化层的骨软骨支架,在猪骨软骨缺损修复中取得了很好的修复效果,明显优于无钙化层支架和空白对照,是今后软骨组织工程支架设计的重要参考.     

自体红骨髓移植修复关节软骨缺损的实验观察

[目的 ]实验观察自体红骨髓移植修复关节软骨缺损的形态变化过程 .[方法 ]将自体新鲜红骨髓移植于 2 6例中国家兔膝关节股骨髌面制作的 3 0mm× 6 0mm全层关节软骨缺损区 ,通过肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察和图像分析等方法 ,观察不同时期修复组织的形态变化 .[结果 ]于术后第4周 ,自体新鲜红骨髓移植组修复组织细胞的形态、分布及排列接近正常软骨组织 ,其修复组织中单个细胞面积达到正常水平 .[结论 ]自体新鲜红骨髓具有良好的成软骨能力 ,成软骨的过程分为肉芽组织形成期、前软骨期和成熟软骨期 3个阶段 .     

松质骨骨基质明胶复合软骨细胞构建组织工程软骨

目的 观察软骨细胞在同种异体松质骨骨基质明胶(BMG)上的生长、增殖和分化,探讨用松质骨BMG与软骨细胞体外构建组织工程软骨的效果.方法 分离1月龄兔关节软骨细胞,扩增后种植在松质骨BMG上体外构建组织工程软骨.于1、2、4、6周取材进行组织学、Ⅱ型胶原免疫组织化学及透射电镜观察.结果 软骨细胞在BMG上生长良好,分泌蛋白聚糖和胶原.随培养时间延长,细胞增殖,松质骨BMG空隙内细胞数量增多,软骨陷窝形成,基质分泌增强.培养6周时软骨细胞在BMG表面及孔隙内形成软骨样组织,免疫组织化学染色显示细胞周围基质富含Ⅱ型胶原,分布均匀:透射电镜显示软骨细胞超微结构正常,细胞周围有大量基质产生.结论 同种异体松质骨BMG可以促进软骨细胞的生长增殖,维持软骨细胞的分化表型;在体外成功构建了组织工程软骨,它是一种较好的软骨组织工程支架材料.

Abstract：

Objective To evaluate the use of cancellous bone matrix gelatin (BMG) combined with chondrocytes in constructing tissue-engineered cartilage by observing the growth, proliferation and differentiation of chondrocytes on allogeneic cancellous BMG. Methods The articular chondrocytes isolated from a 1-month-old rabbit were multiplied to a monolayer and seeded onto cancellous BMG to construct tissue-engineered cartilage in vitro during a period of 6 weeks. Samples were taken from the construct after 1, 2,4, and 6 weeks of culture and evaluated by histology, immunohistochemistry and transmission electron microscopy (TEM). Results The chondrocytes excreted matrix proteoglycan and collagen on cancellous BMG. With the prolongation of the culture time, the cells proliferated in the construct and the cells in the lacunae increased. Numerous chondrocytes were present the central region of the cancellous BMG and surrounded by extracellular matrix. By 6 weeks of culture, the BMG was covered with 15-20 layers of chondrocytes and cartilaginous tissue occurred in the pores throughout the cancellous BMG. Immunohistochemical staining showed rich and evenly distributed type Ⅱ collagen around the chondrocytes, and TEM revealed an ultrastructure of the chondrocyte similar to that of native chondroctyes, with abundant extracellular matrix produced around the cells. Conclusion Tissue-engineered cartilage can be constructed in vitro using allogeneic cancellous BMG combined with chondrocytes. Allogeneic cancellous BMG serves as a good scaffold material for tissue-engineered cartilage to promote the growth and proliferation of the seeded chondrocytes and allows maintenance of the differentiation phenotype of the cells.     

ACPC载药核心块状同种异体骨修复小段感染性骨缺损研究

目的：探讨自固化磷酸钙人工骨（ACPC）载药核心块状同种异体骨治疗小段创伤性骨髓炎骨缺损的临床意义.方法：应用ACPC载药核心块状同种异体骨治疗36例小段创伤性骨髓炎患者,观察患者手术前后的全身及局部组织反应、ESR及CRP、X线摄片和CT扫描;随访时间为13 ～24个月,平均18.5个月.结果：全部患者未见明显全身反应,31例局部软组织愈合好,窦道消除,X线显示ACPC与骨髓炎清除区局部骨质直接愈合,CT示界面处未见间隙存在,基本恢复骨缺损处的解剖形状,I期治愈率为86.1％.另5例需要第二次清创、ACPC载药核心块状同种异体骨植入填充手术后获治愈.结论：ACPC载药核心块状同种异体骨对小段创伤性骨髓炎骨缺损具有治疗彻底、骨缺损修复好、能较好恢复负重肢体功能的优点.     

深冻异体骨复合自体骨髓修复兔桡骨节段性骨缺损

目的：研究兔深冻异体骨复合自体骨髓对节段性骨缺损的修复及其机制。方法：36只新西兰大白兔采用桡骨15mm节段性骨缺损模型，随机分为3组．A组植人深冻异体骨复合自体骨髓．B组植入深冻异体骨，C组植入自体骨。术后不同阶段分别行大体、组织学及x线检测。结果：(1)3组骨缺损均有成骨现象发生；(2)A、C组骨生成、骨连接情况明显优于B组；(3)A、C组骨缺损愈合时间较B组明显缩短，A、C组骨缺损均于术后8周愈合．B组骨缺损在术后10周仍未愈合。结论：提示兔深冻异体骨复合自体骨髓具有良好的组织相容性及成骨作用，其取代自体骨植骨修复骨缺损具有可能性。