高糖对H9C2心肌细胞系和乳大鼠心室肌细胞钙库操纵性钙内流及相关蛋白的影响

目的 探究高糖环境对大鼠胚胎心肌细胞系（H9C2）和乳大鼠心室肌细胞（neonatal rat ventricular myocytes,NRVMs）钙库操纵性钙内流（store operated calcium entry,SOCE）功能的影响,对基质相互作用分子1（stromal interaction molecule 1,STIM1）蛋白表达及其激活结构的作用,完善SOCE在糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy,DCM）中的潜在致病机制。方法 将H9C2和NRVMs细胞分为2组,对照组（5.5 mmol/L葡萄糖）和高糖组（25 mmol/L葡萄糖）,分别培养48 h后用激光共聚焦显微镜实时观察各组心肌细胞在毒胡萝卜素（thapsigargin,TG）刺激后Ca²⁺荧光强度值的变化;采用Western blotting技术检测各组细胞STIM1和钙释放激活钙通道调节分子1（calcium release-activated calcium channel modulator 1,Orai1）蛋白表达的变化;借助化学交联技术和免疫荧光法检测NRVMs的STIM1蛋白的聚集变化;免疫共沉淀技术观察NRVMs心肌细胞内源性STIM1和Orai1蛋白的直接相互作用。结果 与对照组相比,高糖组H9C2和NRVMs心肌细胞钙内流（Ca²⁺ influx）显著增加（P<0.05）;高糖组H9C2和NRVMs心肌细胞STIM1以及Orai1蛋白表达上调（P<0.01）;钙库排空后,高糖组NRVMs心肌细胞STIM1蛋白聚集体显著增多（P<0.01）。结论 体外高糖能诱导大鼠胚胎心肌细胞系H9C2及乳大鼠原代培养心室肌细胞NRVMs的STIM1和Orai1蛋白表达上调,促进STIM1蛋白激活形成聚集体和SOCE激活,Ca²⁺内流增多。该作用提示高糖增加的心肌细胞SOCE可能与糖尿病心肌肥大有关。     

蟾蜍灵通过程序性坏死途径诱导人胃癌细胞SGC-7901死亡

目的 探讨蟾蜍灵（Bufalin）诱导人胃癌SGC-7901细胞死亡过程中程序性坏死途径的发生机制。方法 体外培养SGC-7901细胞,于对照组加入RPMI 1640培养液,实验组加入不同浓度的蟾蜍灵（50、100、150、200 nmol/L）,对照组与实验组细胞继续培养48 h。MTT法检测细胞活性,DAPI染色法观察细胞核形态改变,透射电镜观察细胞膜及细胞核改变,流式细胞术检测细胞坏死率,Western blotting法检测程序性坏死关键蛋白受体相互作用蛋白激酶1（receptor interacting protein kinase 1,RIP1）的表达。结果 MTT实验结果表明,蟾蜍灵对SGC-7901细胞的生长具有显著的抑制作用（P<0.05）。通过透射电镜可以观察到细胞坏死时的特征性改变,如细胞膜破裂、细胞内空泡的产生以及细胞器的崩解。DAPI染色显示,蟾蜍灵（100 nmol/L）处理细胞48 h后,无明显细胞凋亡特征性改变,如细胞核固缩、核碎裂、凋亡小体形成。与对照组相比细胞坏死率升高（P<0.05）。蟾蜍灵对程序性坏死途径关键蛋白RIP1的表达有促进作用（P<0.05）。结论 蟾蜍灵通过程序性坏死途径诱导SGC-7901细胞死亡。     

低钙透析对低甲状旁腺激素血液透析患者矿物质及骨代谢的影响

目的 低钙透析对低甲状旁腺激素血液透析患者甲状旁腺激素及骨代谢的影响。方法 选取70例血清全段甲状旁腺激素(intact parathyroid,iPTH)<100 pg/mL的维持性血液透析患者。应用1.25 mmol/L钙浓度透析液进行血液透析治疗,随访1年。常规检测生化指标——血钙、血磷、血清碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP),化学发光法检测iPTH、骨钙素(osteocalcin, OC)、I型前胶原氨基末端前肽(procollagen type I amino-terminal propeptide, PINP)、β胶原蛋白(β-crosslaps, β-CTX),观察患者应用1.25 mmol/L钙浓度透析液前及应用后1、3、6、12个月时血钙、血磷、ALP、iPTH变化以及OC、PINP、β-CTX等骨代谢指标的变化。结果 1)血清iPTH浓度于应用1.25 mmol/L钙浓度透析液3个月后显著升高(P<0.001);2)更换透析液后各时间点与更换前比较,血清OC浓度、PINP浓度及β-CTX浓度于更换1个月后显著升高,差异有统计学意义(P<0.001);3)OC浓度变化与年龄呈负相关(r=-0.816,P<0.001)、与基线iPTH浓度呈正相关(r=0.673,P=0.037);β-CTX浓度变化与年龄呈负相关(r=-0.718,P<0.001)、与基线iPTH浓度吴正相关(r=0.651,P=0.020);4)更换透析液前基线血清iPTH浓度(P<0.001)、糖尿病史(P=0.012)是iPTH改善的独立影响因素。结论 低钙透析可以改善低甲状旁腺激素患者iPTH浓度,升高OC、PINP及β-CTX浓度,增加骨代谢,是治疗低转运骨病的有效方法。     

腰椎损伤疝出型椎间盘组织JNK信号通路激活情况的研究

目的:探究c-Jun氨基末端激酶（JNK）信号通路在腰椎损伤疝出型椎间盘组织中激活情况。方法:随机选择24例行手术治疗的腰椎间盘突出症（LDH）患者,其中12例损伤疝出型和12例退变突出型,分别为损伤疝出组和退变突出组。收集术中摘除的椎间盘组织,HE染色观察髓核组织病理变化;TUNEL染色分析髓核细胞凋亡情况;免疫蛋白印迹技术检测MKK4、JNK、pJNK、JunD蛋白表达水平。结果:损伤疝出组出现炎性细胞浸润的比例、髓核细胞凋亡计数以及MKK4、JNK、pJNK、JunD蛋白表达水平高于退变突出组（P<0.05）。结论:损伤疝出型髓核组织炎症反应更明显;JNK信号通路异常激活与髓核细胞凋亡增加可能是损伤疝出型LDH病理机制之一;JNK信号通路激活可能是LDH病理分型的标志之一。     

β-羟丁酸对脑胶质瘤细胞增生糖酵解的影响

目的 本研究探讨生酮饮食（ketogenic diet,KD）代谢产物之一的β-羟丁酸（β-hydroxybutyrate,β-HB）对脑胶质瘤细胞增生及糖酵解水平的影响,研究KD治疗脑胶质瘤的机制。方法 用不同浓度的β-HB处理脑胶质瘤细胞系U87及LN229后,通过CCK8实验检测细胞增生,糖酵解压力测试检测细胞糖酵解能力,实时定量聚合酶链式反应（real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）法检测c-myc基因表达,Western blotting法检测c-myc蛋白表达。结果 β-HB对LN229及U87细胞的生长抑制随着药物浓度增加而升高,呈现出剂量依赖性;与未处理组相比,实验组细胞糖酵解水平及最大糖酵解能力明显降低;经过β-HB处理后细胞c-myc表达降低。结论 β-HB可能通过c-myc抑制脑胶质瘤细胞U87及LN229的糖酵解能力,从而影响细胞增生。提示KD可以作为治疗脑胶质瘤的方法之一。     

一种肠肌间神经丛胶质细胞无血清原代培养法的建立

目的 肠胶质细胞（enteric glial cell,EGC）在肠道多种生理及病理过程的调节中发挥重要作用,为了深入研究EGC的功能,排除在体及组织水平中神经体液因素的影响,获得一种简便高效的原代EGC分离培养方法非常必要。方法 取小鼠结肠纵行肌-肌间神经丛组织,经消化分离肠胶质细胞,采用含血清和无血清培养基交替培养法去除成纤维细胞后常规传代;运用细胞免疫荧光染色法检测原代EGC纯度;运用胞内钙成像技术实时观察EGC内Ca²⁺浓度（[Ca²⁺]i）变化以检测细胞活性。结果 每次实验获得的EGC至传代前细胞量可达约6.8×10⁵;无血清培养后成纤维细胞污染显著降低;胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）阳性的EGC占细胞总数的98.44%±1.07%,钙结合蛋白S100β阳性EGC占93.61%±3.16%,GFAP与S100β双阳性EGC占93.09%±2.99%;96.00%±4.00%的细胞在ATP诱导下发生胞内钙瞬变。结论 结合无血清培养可有效去除成纤维细胞污染,得到纯度较高、活性较好的肌间神经丛EGC。     

核钙信号调控的研究进展

细胞核内游离钙在调控核内功能上起重要作用,如调控蛋白跨核膜转运、基因转录、DNA合成、DNA修复以及有丝分裂等一系列细胞生理过程[1].近期随着生物学技术的发展,人们认识到,细胞核具有独立的钙运输转导系统,而不依赖于胞浆钙离子浓度的改变对其发挥调控作用,并且发现核钙运输系统动力学稳态失衡可诱发多种心血管疾病,如(如心肌细胞肥大、凋亡、坏死、心肌电生理的紊乱)[2].因此,核钙信号的研究将逐渐成为心血管疾病医学领域的研究热点.     

新生大鼠心肌细胞内Ca2+的空间分布及调控的离体研究

目的 观察心肌细胞胞浆和核Ca^2 的空间分布和钙变化的形式。方法 以Fluo-4/AM荧乐指示剂负载培养的心肌细胞，应用激光共聚焦扫描显微镜观察心肌细胞的钙信号形式及胞浆和核内[Ca^2 ]i的变化。结果 心肌细胞核的荧光强度明显高于细胞浆，并存在小幅度的钙震荡，AngⅡ使钙震荡幅度增大，其作用可被NO所完全抑制。Ca^2 -ATPase抑制剂Thapsigargin(10^-6mol/L)、钙释放通道Ryanodine受体2激动剂咖啡因（5mmol/L）和大剂量L－型Ca^2 通道阻滞剂Vreapamil(500μmol/L）使心肌细胞胞浆内和核膜上出现钙闪烁现象。EGTA道德螯合心肌细胞内的游离Ca^2 ，继之螯合钙库Ca^2 ，最后仅显示心肌细胞核膜腔Ca^2 库影。L－型Ca^2 通道阻滞剂Verapamil引起心肌细胞自发的钙波传递消失，核和胞浆内荧光强度一过性升高后下降。结论 心肌细胞内存在钙闪烁、钙波以及钙震荡等多种钙信号形式，胞浆和核Ca^2 库对Ca^2 的摄取和释放在细胞功能的调节中起重要作用。     

ether-a-go-go相关基因通道在胰岛β-细胞中的作用

目的 探究ether-a-go-go相关基因（ether-a-go-go related gene,ERG）通道在胰岛β-细胞中的作用。方法 提取野生型（wild type,WT）与ERG基因敲除型（knockout,KO）小鼠胰岛β-细胞,利用全细胞膜片钳技术记录钾离子电流与动作电位,分析敲除ERG基因后钾电流与动作电位的变化。对两组小鼠进行腹腔注射葡萄糖耐量实验,分析基因敲除后小鼠糖耐量的变化,探究ERG基因是否对体内血糖浓度有影响。结果 在两组小鼠胰岛β-细胞中记录到的钾离子电流均呈现内向整流趋势,KO组钾离子电流明显减小,动作电位时程明显延长。动物实验中,KO组小鼠糖刺激2 h后血糖浓度较WT组显著降低。结论 ERG通道电流是胰岛β-细胞中钾离子电流的重要组成部分,可显著影响动作电位时程,进而影响体内血糖浓度。     

Sorbalgon藻酸钙敷料应用于鼻窦内窥手术的疗效观察

目的 研究Sorbalgon藻酸钙敷料用于鼻窦内镜手术后鼻腔填塞止血的可行性及疗效。方法 选择50例双侧慢性鼻窦炎鼻息肉患者,同体比较鼻窦内镜手术后Sorbalgon藻酸钙敷料(治疗侧)与凡士林纱条(对照侧)鼻腔填塞止血效果和填塞后鼻腔反应情况。结果 治疗侧鼻胀痛少见且程度轻,鼻腔无明显出血;抽出填塞物后鼻腔粘膜反应轻,恢复快,鼻腔恢复通气所需时间短。而对照侧多数出现疼痛反应,且程度重,大多有不同程度出血;抽纱条后鼻腔粘膜反应重,恢复慢,鼻腔恢复通气所需时间长。治疗侧和对照侧术后3个月的术腔上皮化情况基本相同。结论 应用Sorbalgon藻酸钙敷料止血效果好,在鼻窦内镜手术中具有良好的应用价值。     

小鼠内淋巴囊原代上皮细胞L型钙离子通道定位表达

目的 探讨C57BL/6小鼠内淋巴囊原代上皮细胞中电压门控钙离子通道定位表达。 方法 选取2日龄C57BL/6(P2B6)小鼠60只,P2B6小鼠8只麻醉处死取得颞骨标本,体视显微镜下定位内淋巴囊位置,提取内淋巴囊原代细胞并在低血清状态下培养。P2B6小鼠52只处理同上,颞骨标本用4%甲醛固定后脱钙包埋,采用免疫组织荧光技术和免疫细胞荧光技术定性原代内淋巴囊上皮细胞并确定L型钙离子通道表达。 结果 内淋巴囊上皮细胞在P2B6小鼠内淋巴囊中排列紧密,可见细胞聚集呈嵴状突起,胞体较小,细胞呈椭圆状,以扁平上皮为主,细胞培养光镜观察为不规则铺路石样,细胞形态大小不一,胞浆丰富,核椭圆形且大。免疫荧光检测显示L型Ca²⁺通道在内淋巴囊上皮细胞膜上均呈均匀表达,细胞核上高表达。 结论 小鼠原代内淋巴囊上皮细胞中L-型电压依赖钙离子通道α1C亚基(CACNA1C)、L-型电压依赖钙离子通道α1S亚基(CACNA1S)、L-型电压依赖钙离子通道α1D亚基(Cav1.3/ CACNA1D)表达为阳性,为细胞功能学实验提供依据,有利于进一步研究内淋巴囊维持稳态的机制。     

糖基化终极产物对乳鼠心肌细胞胞内游离钙瞬间变化的影响

目的 探讨糖基化终极产物(AGEs)刺激对体外培养乳鼠心肌细胞内游离钙的影响。方法 应用荧光钙离子指示剂Fluo-3/AM将体外培养3~5 d的乳鼠心肌细胞染色,激光共聚焦显微镜(LSCM)观察不同浓度AGEs(50、100、200 μg/ml)对心肌细胞瞬时刺激后细胞内游离钙离子浓度的影响。结果 与对照组相比,AGEs刺激可以迅速引起心肌细胞胞内游离钙浓度的升高,其恢复时程显著延长并呈剂量依赖性。结论 AGEs可能通过改变心肌细胞内游离钙离子浓度对心肌细胞造成损伤。     

李氏5号水提液在兴奋性氨基酸损伤神经元中的保护作用

目的 探讨李氏5号水提液在兴奋性氨基酸性神经元损伤中的保护作用。方法 MTT法观察不同干扰因素作用下细胞成活率和用Hoechest333258染色法荧光显微镜下观察细胞凋亡的比例;借助共聚焦显微镜钙成像和钙荧光指示剂Fluo-3/AM测细胞内钙浓度。结果 300μmol/LNMDA+5μmol/L甘氨酸作用10min后换正常培养液培养18h,细胞死亡率比正常对照组高(54.64±5.76)%;用李氏5号水提液(终浓度为0.5mg/ml)预处理3h后,加300μmol/LNMDA+5μmol/L甘氨酸作用10min,换正常培养液同时加李氏5号水提液继续培养18h,细胞死亡率明显降低。10μmol/LNMDA可明显增加海马神经元胞质游离钙浓度。李氏5号水提液本身可轻度增加胞质游离钙浓度(与正常组比较差异不显著),但明显抑制NMDA导致的胞质游离钙浓度的升高;NMDA阻断剂MK-801明显拮抗NMDA导致胞质游离钙升高的效应,但李氏5号水提液预处理后,MK-801拮抗NMDA的效应显著降低。结论 李氏5号水提液可能通过拮抗兴奋性氨基酸所致的细胞内钙超载而明显保护神经元。     

HT22细胞系铁死亡敏感性研究

目的 检测HT22细胞系可否作为研究神经元铁死亡的良好细胞模型,在细胞水平上为研究神经元铁死亡的机制提供基础。方法 用经典铁死亡诱导剂Erastin和RSL3处理HT22细胞系,显微镜下观察细胞存活情况;使用CCK-8法检测细胞存活率;使用丙二醛法或菲罗嗪法分别检测细胞内脂质活性氧（reactive oxygen species,ROS）、Fe²⁺浓度;实时定量聚合酶链反应（quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR）法检测细胞铁死亡关键基因SLC7A11（solute carrier family 7 member 11）、PTGS2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2）的mRNA水平。结果 Erastin或RSL3处理HT22后,显微镜下发现细胞发生明显死亡,加入铁死亡抑制剂Ferrostatin-1后,细胞死亡显著减少。Erastin或RSL3诱导后HT22细胞内的Fe²⁺浓度无明显变化（P>0.05）,脂质过氧化水平明显增加（P<0.05）;Erastin或RSL3导致细胞SLC7A11、PTGS2的mRNA表达水平增加（P<0.05）,进一步验证了处理后细胞发生铁死亡。结论 HT22细胞系是一种铁死亡敏感细胞系,Erastin或RSL3诱导HT22铁死亡,HT22细胞系可用于研究神经元中铁死亡的发生及胞内脂质过氧化物蓄积机制。     

少突胶质细胞与神经元相互作用时神经元细胞内钙离子浓度的变化

目的 研究少突胶质细胞与神经元相互作用时神经元细胞内钙离子浓度的变化。方法 用分离培养的少突胶质细胞及其细胞碎片分别作用于培养的PC12细胞,于小同时相点在观察PC12细胞突起变化,同时检测PC12细胞内钙离子浓度。结果 对照组有少量^45Ca通过细胞膜流入PC12细胞内,当少突胶质细胞及其细胞碎片加入后很快就出现细胞内钙显著增高,但在加入4h后,少突胶质细胞及其碎片处理后其细胞内钙较处理10min有显著下降,但即使在处理后12h仍与正常对照组有显著性差异（P＜0.05）。钙通道阻滞剂尼莫通对少突胶质细胞引起的细胞内钙增加无明显的抑制作用,且尼莫通亦不能阻止少突胶质细胞引起的PC12细胞突起回缩及塌陷。结论 少突胶质细胞作用于PC12细胞时引起的PC12细胞内钙离子浓度的增加可能与突起的塌陷有关。     

用于钙信号研究的小鼠心室肌细胞急性分离的优化

目的：建立一种可快速获取生理状态良好的用于钙信号研究的小鼠心室肌细胞的方法,同时比较两种细胞保存液对心室肌细胞钙信号的影响。方法取成年小鼠心脏,用改进的 Langendorff 心脏灌流系统行主动脉逆行灌流,利用酶联合法消化,取得心室肌细胞置于两种不同的细胞保存液中,在显微镜下观察并检测其状态。采用共聚焦显微镜观测细胞内钙信号,记录钙火花。结果该方法可以在较短的时间内得到65％以上的长杆状心室肌细胞,细胞能够正常存活12～24 h,并且可以立即用于钙火花观测实验研究。比较两种保存液,细胞保存液 A中富含高钾离子,细胞保存液B中含有正常的胞外钙离子浓度,观察到的钙火花细胞保存液B中比A液的频率高、幅度大,在达峰时间上比A液的时间短。结论通过严格控制各项实验条件,能够成功得到存活率高、纯度高、耐钙的可用于钙火花观测的小鼠心室肌细胞。细胞保存液中的钾离子含量少,并有适量的钙离子有助于观测钙火花的发生。     

荧光比率法测量平滑肌细胞内的钙动力学变化

目的建立一种荧光比率方法来测量细胞内钙离子的动力学变化,并研究血管平滑肌细胞钙动力学变化在重症休克血管反应性降低中的作用.方法复制SD大鼠失血性休克模型,分离肠系膜细动脉血管平滑肌(ASMC),使用荧光探针Fluo-3/AM、FuraRed双标记比率方法结合激光扫描共聚焦显微成像技术测定单个平滑肌细胞钙动力学变化;评估荧光比率法在动态测定胞内钙离子浓度变化中的应用及其观察ATP敏感钾通道(KATP)特异性阻滞剂优降糖对血管反应性和钙动力学影响.结果休克后2 h(失代偿期),血管反应性明显降低,NE作用带来的平滑肌细胞内钙离子浓度升高的程度明显减弱;加入优降糖可明显提高NE对平滑肌细胞内钙离子的升高作用,改善细动脉对NE的反应性,带来血管反应性部分恢复.在37℃,Fluo-3/AM、FuraRed浓度为5μnol/L的条件下,肠系膜细动脉平滑肌细胞负载40 min左右即可获得良好的标记效果.结论优降糖特异性的阻滞ATP敏感钾通道的开放,增多细胞外钙内流并提高血管反应性;使用荧光比率法可以使胞内钙离子浓度的测量不受荧光探针浓度、细胞大小、激光漂白等因素的影响,可以准确、实时、动态测量细胞内钙离子浓度变化.     

氯化两面针碱对垂体腺瘤GH3细胞的抑制作用

目的 探讨氯化两面针碱对垂体腺瘤GH3细胞的抑制作用及其机制。方法 不同浓度的氯化两面针碱作用于GH3细胞,培养不同时间后分别检测其作用效果:CCK-8检测各组GH3细胞存活率;Annexin V/PI凋亡试剂盒染色后,采用流式细胞术检测各组GH3细胞凋亡率;PI染色后采用流式细胞术进行细胞周期分析;实时定量PCR检测凋亡相关基因Bax、 Bcl-2,以及细胞周期相关基因Cyclin B1、CDK1、p21和p27的mRNA表达水平;Western blotting法检测Bax、Bcl-2、Cyclin B1和CDK1蛋白,以及丝氨酸/苏氨酸激酶(AKT)和细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路蛋白的表达水平。结果 氯化两面针碱可抑制GH3细胞增殖,促进GH3细胞凋亡及细胞周期阻滞于G2/M期;氯化两面针碱能够抑制AKT及ERK信号通路的激活。结论 氯化两面针碱有效抑制垂体腺瘤GH3细胞的增殖和促进其凋亡,可作为有效治疗垂体腺瘤的潜在药物。     

低温缺氧条件下脂质体介导的寡核苷酸对人脐静脉内皮细胞-304的转染

目的 研究在Euro-Collins溶液(ECs)中,低温(4 ℃)缺氧条件下体内阳离子脂质体转染剂(In vivo liposome)介导NF-κB诱捕物寡核苷酸(NF-κB decoy ODN)在人脐静脉内皮细胞株ECV-304中的转染效率。方法 (1) 将ECV-304在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中以37 ℃、5% CO₂的条件培养,待生长至单层融合后,进行试验。(2) 使用前配制脂质体-ODN复合物,脂质体与ODN 的+/-电荷比率为2。(3) 应用荧光显微镜和流式细胞仪,观察在ECs中、4 ℃条件下,ODN浓度分别为0.50、0.75、1.00、1.25 μmol/L时,缺氧保存2、4、6、8 h后ECV-304的平均荧光强度(MFI)和ODN的胞内分布;同时设立裸ODN转染为对照组,观察对ECV-304的转染效率。结果 在ECs中、4 ℃缺氧保存条件下,随着保存时间的延长和脂质体-ODN浓度的升高,ECV-304的MFI增强,保存6 h后MFI基本达到了最大强度,并且大部分ODN均位于细胞核内;而ODN的细胞摄取率无差异。但与裸转染相比,MFI和细胞摄取率均有显著差异性。结论 在ECs中和低温缺氧条件下,脂质体可以高效地将NF-κB decoy ODN转染到ECV-304细胞核,为供体器官在基因调控水平的保护研究提供了实验依据。