阿托伐他汀对白蛋白诱导的HK-2细胞凋亡的影响及机制初探

目的探讨阿托伐他汀（atorvastatin, ATO）对白蛋白诱导的人肾小管上皮细胞（human renal tubular epithelial cells, HK-2）凋亡的影响,并对其可能作用机制进行初步探讨。方法体外培养HK-2细胞,将培养到85%～90%的HK-2细胞随机分为7组:空白对照组（A组）、白蛋白诱导组(B组:5 mg·mL-1白蛋白)、ATO组(C组:10-8 mol·L-1 ATO)、低浓度ATO+白蛋白诱导组(D组:10-10 mol·L-1 ATO+5 mg·mL-1白蛋白)、中浓度ATO+白蛋白诱导组(E组:10-9 mol·L-1 ATO+5 mg·mL-1白蛋白)、高浓度ATO+白蛋白诱导组(F组:10-8 mol·L-1 ATO+5 mg·mL-1白蛋白)、RhoA/ROCK信号通路阻断剂组(G组:10μmol·L-1 Y27632+5 mg·mL-1白蛋白);予以各实验组细胞干预培养48 h后,流式细胞仪检测各组HK-2细胞的早期凋亡,采用RT-PCR检测各组HK-2细胞RhoAmRNA、ROCK1mRNA的表达。结果空白对照组与ATO组HK-2细胞的早期凋亡、RhoAmRNA、ROCK1mRNA的表达比较差异均无统计学意义（均P>0.05）;不同浓度的ATO+白蛋白诱导组及RhoA/ROCK信号通路阻断剂组HK-2细胞较白蛋白诱导组早期凋亡降低（均P<0.05）,且随着ATO浓度的升高,其抑制HK-2细胞早期凋亡的作用越明显;不同浓度的ATO+白蛋白诱导组HK-2细胞RhoAmRNA、ROCK1 mRNA的表达较白蛋白诱导组减少（均P<0.05）。结论 ATO可抑制白蛋白诱导的HK-2细胞的早期凋亡,其作用机制可能与部分阻断RhoA/ROCK信号通路有关。     

高浓度葡萄糖诱导大鼠肾小球系膜细胞VEGF的表达上调依赖于PKCβⅠ和RhoA的活化

目的:研究高浓度葡萄糖是否通过蛋白激酶C(PKC)βⅠ和RhoA信号通路介导大鼠肾小球系膜细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达上调。方法:体外培养SD大鼠肾小球系膜细胞,给予葡萄糖和各种抑制剂处理细胞,提取细胞蛋白,采用Western免疫印迹检测PKCβⅠ及RhoA蛋白的表达量变化,同时提取RNA,采用实时定量PCR观察VEGF mRNA浓度变化。结果:高浓度葡萄糖(30mmol/L)诱导肾小球系膜细胞VEGF mRNA表达增加,而甘露醇对照组VEGF mRNA表达水平未见明显改变(P>0.05)。高浓度葡萄糖刺激系膜细胞RhoA和PKCβⅠ发生活化,RhoA-GTP蛋白和胞膜PKCβⅠ蛋白均呈时间依赖性增加。使用Rho激酶特异性抑制剂(HA-1077)预处理细胞后,VEGF mRNA表达量与高糖组相比明显下调(P<0.05)。进一步使用广谱PKC抑制剂(PMA)、传统PKC抑制剂(G6976)以及PKCβ特异性抑制剂(LY333531)预处理细胞后,VEGF mRNA和RhoAGTP蛋白表达量与高糖组相比均受到抑制(P<0.05)。结论:高浓度葡萄糖可能通过间接活化PKCβⅠ来激活RhoA信号通路,从而上调系膜细胞VEGF的表达,该信号通路在糖尿病肾病的病理过程中发挥着重要作用。     

促红细胞生成素对高糖诱导人肾小球系膜细胞纤维化的影响及其机制研究

目的 研究促红细胞生成素（EPO）对高糖诱导人肾小球系膜细胞（MCs）增殖及其表达相关细胞因子和炎性因子的影响,探讨EPO对肾脏组织的生物学效应。方法 2014年12月-2015年5月选取人MCs,采用随机数字表法分为：空白对照组、高糖诱导组、甘露醇对照组、EPO对照组、5 U/ml EPO干预组、10 U/ml EPO干预组、20 U/ml EPO干预组、Rho激酶抑制剂组。采用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）法检测RhoA、锌离子相关的RhoA蛋白1（ROCK1）mRNA表达水平;酶联免疫吸附试验法（ELISA）检测结缔组织生长因子（CTGF）、Ⅳ型胶原蛋白、白介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）表达水平;CCK-8法测定细胞增殖吸光度（OD值）。结果 高糖诱导组较空白对照组RhoA、ROCK1 mRNA表达水平升高（P＜0.05）;5 U/ml EPO干预组、10 U/ml EPO干预组、20 U/ml EPO干预组较高糖诱导组RhoA、ROCK1 mRNA表达水平降低（P＜0.05）;5 U/ml EPO干预组、10 U/ml EPO干预组、20 U/ml EPO干预组RhoA、ROCK1 mRNA表达水平组间两两比较,差异均有统计学意义（P＜0.05）;Rho激酶抑制剂组较5 U/ml EPO干预组、10 U/ml EPO干预组、20 U/ml EPO干预组RhoA mRNA表达水平升高,ROCK1 mRNA表达水平降低（P＜0.05）。高糖诱导组、5 U/ml EPO干预组、10 U/ml EPO 干预组、20 U/ml EPO 干预组RhoA mRNA表达水平与ROCK1 mRNA表达水平均呈正相关（r值分别为0.829、0.898、0.831、0.861,P＜0.05）。高糖诱导组较空白对照组培养24 h时CTGF及Ⅳ型胶原蛋白、培养24 h及48 h 时IL-6及TNF-α表达水平升高（P＜0.05）;5 U/ml EPO干预组、10 U/ml EPO干预组、20 U/ml EPO干预组、Rho激酶抑制剂组培养24 h时CTGF及Ⅳ型胶原蛋白,培养24 h及48 h 时IL-6及TNF-α表达水平较空白对照组升高,较高糖诱导组降低（P＜0.05）;10 U/ml EPO干预组、20 U/ml EPO干预组、Rho激酶抑制剂组较5 U/ml EPO干预组培养24 h时CTGF及Ⅳ型胶原蛋白、培养24 h及48 h 时IL-6及TNF-α表达水平降低（P＜0.05）;20 U/ml EPO干预组、Rho激酶抑制剂组较10 U/ml EPO干预组培养24 h时CTGF及Ⅳ型胶原蛋白、培养24 h及48 h 时IL-6及TNF-α表达水平降低（P＜0.05）。培养24、48、72 h时,高糖诱导组、EPO对照组、5 U/ml EPO干预组、10 U/ml EPO干预组、20 U/ml EPO干预组较空白对照组MCs增殖OD值升高,Rho激酶抑制剂组较空白对照组MCs增殖OD值降低（P＜0.05）;5 U/ml EPO干预组、10 U/ml EPO干预组、20 U/ml EPO干预组较高糖诱导组MCs增殖OD值升高,Rho激酶抑制剂组较高糖诱导组MCs增殖OD值降低（P＜0.05）;5 U/ml EPO干预组、10 U/ml EPO干预组、20 U/ml EPO干预组MCs增殖OD值组间两两比较,差异均有统计学意义（P＜0.05）;3组MCs增殖OD值培养24、48、72 h时两两比较,差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论 高糖可抑制人MCs增殖;高糖可促进人MCs的CTGF、Ⅳ型胶原蛋白和IL-6、TNF-α的表达,而EPO在一定浓度和时间范围内可抑制高糖诱导MCs的CTGF、Ⅳ型胶原蛋白和IL-6、TNF-α的表达,促进增殖,保护肾脏,其机制可能与RhoA/ROCK信号转导通路有关。     

红细胞生成素对高糖诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响及其可能机制

目的：肾间质纤维化（ renal interstital fibrosia , RIF）的核心是肾小管上皮细胞转分化。探讨促红细胞生成素（Erythropoietin, EPO）对高糖诱导的正常人肾小管上皮细胞（human kidney cells, HK-2）转分化的影响及其可能机制。方法体外培养HK-2细胞,按随机数字表法分为空白对照组、高糖诱导组（高糖终浓度30 mmol/L）、甘露醇对照组（甘露醇浓度24．5 mmol/L）、EPO对照组（ EPO终浓度为20 U/mL）、5 U/mL EPO干预组、10 U/mL EPO干预组、20 U/mL EPO干预组及ROCK抑制剂（ Y27632）组（ Y27632终浓度为30μmol/L,加入Y2763230 min后加高糖,高糖终浓度为30 mmol/L）,各组均刺激24 h。应用RT-PCR法检测细胞 RhoA mRNA、ROCK1 mRNA 的水平;细胞免疫荧光法检测细胞 E-钙黏蛋白、α-平滑肌肌动蛋白（αsmoothmuscleactin,α-SMA）的表达;ELISA法检测上清液纤维连接蛋白（fibronectin, FN）的表达。结果 RT-PCR结果显示高糖诱导组RhoA mRNA及ROCK1 mRNA表达较空白对照组显著升高（1．400±0．022 vs 0．945±0．132,1．913±0．011 vs 1．007±0．002,P＜0．05）;5、10、20 U/mL EPO干预组,RhoA mRNA的表达水平（0．278±0．006、0．770±0．005、0．334±0．009）均较空白对照组（0．945±0．131）减少（P＜0．05）,ROCK1 mRNA的表达水平（1．418±0．006、0．919±0．004、0．477±0．002）较空白对照组（51．007±0．002）减少（P＜0．05）;ELISA及细胞免疫荧光结果显示高糖诱导组FN、α-SMA蛋白的表达较空白对照组明显增加[（14545．53±317．27）ng/mL vs （2582．50±87．20）ng/mL,0．335±0．006 vs 0．224±0．006,P＜0．05];直线相关性分析,高糖诱导组,5、10、20 U/mL EPO干预组RhoA mRNA与ROCK1 mRNA表达均呈正相关（P＜0．05）。高糖诱导组α-SMA较空白对照组上升,E-钙黏蛋白较空白对照组下降（P＜0．05）;EPO干预组及ROCK抑制剂组E-钙黏蛋白表达较高糖诱导组增加,而α-SMA表达下降（P＜0．05）;ELISA结果显示,EPO干预组ROCK抑制剂组FN表达较高糖诱导组下降（P＜0．05）,且下降程度与EPO浓度相关。结论 EPO可抑制高糖诱导的HK-2细胞转分化,从而延缓肾间质纤维化,其机制可能与RhoA/ROCK信号通路有关。     

高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞中NO的变化及其对细胞外基质的影响

目的 探讨高糖培养的肾小球系膜细胞中一氧化氮（NO）合成的变化,以及上述变化对细胞外基质的影响.方法 体外培养大鼠肾小球系膜细胞,按干预方法分为正常组（NG组,5.56 mmol·L-1 DMEM）,高糖组（HG组,25 mmol·L-1 DMEM）、一氧化氮供体组（SNP组,5.56 mmol·L-1 DMEM＋100 μmol·L-1 SNP）、NO清除剂组（C-PTIO 组,25 mmol·L-1 DMEM＋200 μmol·L-1 C-PTIO）,以Griess比色法测定培养上清中NO水平;用ELISA法测定培养上清中Ⅳ型胶原、层黏蛋白含量.结果 高糖培养条件下上清中NO增多（P〈0.05）,Ⅳ型胶原、层黏蛋白含量增加（P〈0.01）,应用C-PTIO可显著降低上清中NO的含量,Ⅳ型胶原、层黏蛋白的含量也降低.结论 高糖可诱导大鼠肾小球系膜细胞产生NO,异常增多的NO又可导致系膜细胞中Ⅳ型胶原、层黏蛋白的积聚.     

雷公藤甲素上调PRDX2抑制2型糖尿病肾病的氧化应激状态

目的:通过观察雷公藤甲素对2型糖尿病肾病小鼠肾脏和人肾小球系膜细胞氧化应激的影响,探讨雷公藤甲素改善2型糖尿病肾病的分子机制。方法:体内实验分3组:C57小鼠对照组、KK-Ay小鼠模型组和KK-Ay小鼠加用雷公藤甲素干预组。雷公藤甲素200 μg/（kg·d）灌胃12周后取肾脏组织进行HE染色;体外实验采用人肾小球系膜细胞为研究对象,分为正常糖组、高糖刺激模型组和雷公藤甲素干预组3组。分别用含有5.5 mmol/L（培养基组成）的D-葡萄糖、30 mmol/L的D-葡萄糖、及30 mmol/L的D-葡萄糖加10 μg/L的雷公藤甲素培养24 h。采用ELISA法检测小鼠肾脏和人肾小球系膜细胞中SOD活性和MDA含量。Western blot方法检测各组小鼠肾脏和人肾小球系膜细胞中PRDX2的蛋白表达量。结果:体内外实验结果均显示,与相应对照组相比,2型糖尿病肾病小鼠模型组肾脏和人肾小球系膜细胞高糖刺激模型组细胞中SOD活性明显下降,MDA含量明显增加,PRDX2蛋白表达水平明显降低（P<0.05）;雷公藤甲素干预组较模型组SOD活性明显升高,MDA含量明显减少,同时PRDX2蛋白表达水平明显增加（P<0.05）。结论:雷公藤甲素可以通过上调PRDX2抑制2型糖尿病肾病肾脏氧化应激状态。     

人红细胞生成素对高糖诱导肾近曲小管上皮细胞转分化过程中炎性因子的影响及其可能机制

目的 探讨重组人红细胞生成素（rhEPO）对高糖诱导的正常人肾小管上皮细胞（HK-2细胞）转分化过程中炎性因子的变化及其可能机制。方法 体外培养HK-2细胞,采用随机数字表法分为空白对照组（未加任何刺激物）、高糖诱导组（高糖终浓度为30 mmol/L）、甘露醇对照组（甘露醇为24.5 mmol/L）、rhEPO对照组（rhEPO终浓度为20 U/ml）、不同浓度rhEPO干预组（rhEPO终浓度分别为5、10、20 U/ml+高糖）及Rho激酶抑制剂（Y27632）组（Y27632终浓度为30 μmol/L,加入Y27632 30 min后加高糖,高糖终浓度为30 mmol/L）,以上各组均培养24 h。采用RT-PCR检测各组细胞RhoA mRNA、ROCK1 mRNA表达水平;采用细胞免疫荧光法检测E-钙黏蛋白（E-cadherin）、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达水平;采用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测人纤维连接蛋白（FN）、白介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）的蛋白表达水平。结果 各组RhoA mRNA、ROCK1 mRNA表达比较,差异均有统计学意义（P＜0.05）;其中高糖诱导组与5 U/ml rhEPO组RhoA mRNA、ROCK1 mRNA表达均高于空白对照组,10 U/ml rhEPO组、20 U/ml rhEPO组及Rho激酶抑制剂组RhoA、ROCK1 mRNA表达均低于空白对照组（P＜0.05）;不同浓度rhEPO组RhoA mRNA、ROCK1 mRNA表达均低于高糖诱导组（P＜0.05）,Rho激酶抑制剂组ROCK1 mRNA表达低于高糖诱导组（P＜0.05）;10 U/ml rhEPO组与20 U/ml rhEPO组RhoA mRNA、ROCK1 mRNA表达均低于5 U/ml rhEPO组（P＜0.05）;20 U/ml rhEPO组RhoA mRNA、ROCK1 mRNA表达均低于10 U/ml rhEPO组（P＜0.05）。各组α-SMA、E-cadherin、FN、IL-6及TNF-α蛋白表达比较,差异均有统计学意义（P＜0.05）;其中高糖诱导组、不同浓度rhEPO组、Rho激酶抑制剂组α-SMA、FN、IL-6及TNF-α蛋白表达均高于空白对照组,E-cadherin均低于空白对照组（P＜0.05）;不同浓度rhEPO组、Rho激酶抑制剂组α-SMA、FN、IL-6及TNF-α蛋白表达均低于高糖诱导组,E-cadherin均高于高糖诱导组（P＜0.05）;10 U/ml rhEPO组、20 U/ml rhEPO组α-SMA、FN、IL-6及TNF-α蛋白表达均低于5 U/ml rhEPO组,E-cadherin均高于5 U/ml rhEPO组（P＜0.05）;Rho激酶抑制剂组α-SMA、FN蛋白表达均低于5 U/ml rhEPO组,E-cadherin均高于5 U/ml rhEPO组（P＜0.05）;20 U/ml rhEPO组α-SMA、FN、IL-6及TNF-α蛋白表达均低于10 U/ml rhEPO组,E-cadherin均高于10 U/ml rhEPO组（P＜0.05）;Rho激酶抑制剂组α-SMA、E-cadherin、FN蛋白表达均低于10 U/ml rhEPO组（P＜0.05）。Pearson直线相关结果分析,高糖诱导组、不同浓度rhEPO干预组RhoA mRNA与ROCK1 mRNA表达水平呈正相关（r=0.885、0.901、0.886、0.868,P＜0.05）。结论 rhEPO可抑制高糖诱导的HK-2细胞转分化,rhEPO还可以通过减少炎性因子的产生,减轻炎性反应,从而延缓糖尿病肾病（DN）的进展,延缓肾间质纤维化,其机制可能与RhoA/ROCK信号通路有关。     

全反式维甲酸对高糖环境下HK-2细胞转分化的影响及其可能机制

目的：探讨全反式维甲酸（ATRA）对高糖环境下正常人肾小管上皮 HK‐2细胞株转分化的影响及其可能机制。方法将体外培养的 HK‐2细胞按随机数字表法分为以下7组：空白组、高糖组、高渗组、高糖＋低浓度ATRA组、高糖＋中浓度ATRA组、高糖＋高浓度ATRA组、Rho激酶抑制剂Y27632干预组。采用实时荧光定量聚合酶链反应（RT‐PCR）检测各组细胞RhoA及ROCK1 mRNA表达水平,采用细胞免疫荧光检测高糖环境下 HK‐2细胞α‐平滑肌肌动蛋白（α‐SMA）及E‐钙黏蛋白的表达变化。结果 RT‐PCR结果显示：空白组与高渗组RhoA及ROCK1 mRNA表达水平比较,差异均无统计学意义（P＞0．05）;高糖组RhoA及ROCK1 mRNA表达水平较空白组、高渗组高,差异均有统计学意义（P＜0．05）;予以ATRA或Y27632干预后, RhoA及ROCK1 mRNA表达较高糖组减少,差异均有统计学意义（P＜0．05）,且呈现ATRA浓度依赖性。相关性分析示,高糖组及各ATRA干预组RhoA mRNA与ROCK1 mRNA表达水平呈正相关（P＜0．05）。细胞免疫荧光检测结果显示：空白组与高渗组α‐SMA及E‐钙黏蛋白表达水平比较,差异均无统计学意义（P＞0．05）;高糖组α‐SMA表达水平较空白组高,E‐钙黏蛋白表达水平较空白组低,差异均有统计学意义（P＜0．05）;予以ATRA或Y27632干预后,α‐SMA表达明显减少,E‐钙黏蛋白表达明显增多,差异均有统计学意义（P＜0．05）。结论 ATRA可部分逆转高糖环境下 HK‐2细胞转分化的过程,其机制可能与抑制RhoA／ROCK信号通路有关。     

Resveratrol对高糖所致大鼠肾小球系膜细胞TGF-β1表达的影响

目的:探讨高糖对大鼠肾小球系膜细胞TGF-β1表达的影响及Resveratrol的干预作用.方法:体外培养大鼠肾小球系膜细胞.①分为正常对照组(NC组,匍萄糖浓度5.6 mmol/L)、高糖组(HG组,葡萄糖浓度30 mmol/L),分别观察24、48、72 h;②分为NC组、HC组、Resveratrol组(Res组,葡萄糖浓度5.6 mmol/L+Resvemtrol 20 μmol/L)和高糖+Rcsvcratrol组(HG+Res 组,葡萄糖浓度30 mmol/L+Resveratrol浓度分别为5、10、15、20 μmol/L),各组细胞分別培养48 h.用半定量RT-PCR和Western blotting法检测细胞内TGF-β1 mRNA和蛋白表达变化.结果:①与NC组相比,HG刺激后大鼠系膜细胞TGF-β1 mRNA和蛋白表达明显增加,差异均有显著性,P值均<0.01;②与HC组相比,HG+Resveratrol干预后,大鼠系膜细胞TGF-β1 mRNA和蛋白表达呈浓度依赖性减少,差异均有显著性(P值分别为<0.05,<0.01).Res组和NC组之间TGF-β1 mRNA和蛋白表达的差异无显著性(P>0.05).结论:高糖能上调大鼠肾小球系膜细胞TGF-β1 mRNA和蛋白表达,Resveratrol可能通过抑制高糖引起的系膜细胞TGF-β1高表达而在糖尿病肾病中起治疗作用.     

青光安Ⅱ号方有效组分对青光眼模型DBA/2J小鼠视网膜中RhoA、ROCK及Caspase-3蛋白表达的影响

目的观察青光安Ⅱ号方有效组分对青光眼模型DBA/2J小鼠视网膜中RhoA、ROCK及Caspase-3蛋白表达的影响。方法将8只(16只眼)雌性C57BL/6小鼠设为空白组(A组),48只(96只眼)雌性DBA/2J小鼠随机分成6组,每组8只(16只眼),分别为:模型组(B组)、益脉康分散片组(C组)、青光安II号汤剂组(D组)、青光安Ⅱ号有效组分低浓度组(E组)、青光安Ⅱ号有效组分中浓度组(F组)、青光安Ⅱ号有效组分高浓度组(G组),B、C、D、E、F、G组DBA/2J小鼠喂养38周龄建立青光眼模型后开始干预,干预4周后Western blot法检测DBA/2J小鼠视网膜中RhoA、ROCK及Caspase-3蛋白的相对表达量。结果干预4周后,与A组比较,B组RhoA、ROCK、Caspase-3蛋白相对表达量明显升高,差异均有统计学意义(P0.05);与B组比较,C、D、E、F、G组RhoA、ROCK、Caspase-3蛋白表达减少,差异均有统计学意义(P0.05);与C组比较,D、E、F组RhoA、ROCK、Caspase-3蛋白相对表达差异无统计学意义(P0.05);与C、D组比较,G组RhoA、ROCK、Caspase-3蛋白表达减少,差异有统计学意义(P0.05)。结论青光安Ⅱ号方有效组分能抑制Rho/ROCK信号通路及凋亡相关蛋白Caspase-3的表达,其中高浓度青光安Ⅱ号方有效组分效果优于益脉康分散片和青光安Ⅱ号方汤剂,推测青光安Ⅱ号方及其有效组分治疗青光眼的机制可能与其抑制Rho/ROCK信号通路及视网膜细胞凋亡相关蛋白表达有关。     

RhoA和ROCK蛋白在高脂饮食幼鼠肾小球中的表达及其意义

目的：探讨RhoA和ROCK蛋白在高脂饮食（HFD） C57BL/6J幼鼠肾小球中的表达,阐明RhoA/ROCK通路是否与HFD诱导的肾小球损伤有关。方法：36只雄性C57BL/6J幼鼠随机分为正常对照组和HFD组,每组18只,正常对照组幼鼠给予标准饲料,HFD组幼鼠给予高脂饲料,分别饲养12周。检测幼鼠体质量和血清总胆固醇（TC）及甘油三酯（TG）水平。HE染色、PAS染色和Masson染色观察2组幼鼠肾组织病理形态表现、肾小球系膜和基底膜相对面积以及肾间质纤维组织相对面积,免疫组织化学法检测2组幼鼠肾小球中RhoA和ROCK蛋白表达水平,免疫蛋白印迹法检测2组幼鼠肾小球中RhoA、ROCK和Vimentin蛋白的表达水平。结果：与正常对照组比较,HFD组小鼠体质量、血清TC和TG水平明显升高（P<0.01）。HE染色,HFD组小鼠肾小球内出现明显脂肪变性;PAS染色,HFD组小鼠出现肾小球系膜基质轻度增生;Masson染色,HFD组小鼠肾小球内蓝色胶原纤维染色物质比正常对照组增多;与正常对照组比较,HFD组小鼠肾小球系膜和基底膜相对面积明显增加（P<0.05）,肾间质纤维组织相对面积增加（P<0.05）;免疫组织化学检测,与正常对照组比较,HFD组幼鼠肾小球中RhoA的ROCK蛋白表达水平升高（P<0.05）;免疫蛋白印迹法检测,与正常对照组比较,HFD组幼鼠肾小球中RhoA、ROCK和Vimentin蛋白表达水平升高（P<0.05）。结论：给予HFD的C57BL/6J小鼠肾小球中RhoA和ROCK蛋白高表达可能是诱发肾小球损伤的原因之一。     

高糖刺激对体外培养大鼠肾小球系膜细胞表达TGF-β_1和PDGF-BB的影响

目的探讨高糖刺激对体外培养的大鼠肾小球系膜细胞(HBZY-1)表达转化生子因子(TGF-β1)和血小板源性生长因子(PDGF-BB)的影响。方法体外培养大鼠肾小球系膜细胞,传代后分为正常组(葡萄糖浓度为5.6mmol/L)、高糖A组(葡萄糖浓度为15mmol/L)、高糖B组(葡萄糖浓度为30mmol/L),分别培养12h、24h、48h后,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定各组细胞TGF-β1和PDGF-BB mRNA的表达水平,应用免疫细胞化学法检测各组细胞中TGF-β1和PDGF-BB蛋白的表达。结果①正常组细胞可表达TGF-β1及PDGF-BB;②与正常组相比,高糖各组细胞TGF-β1和PDGF-BB的mRNA及蛋白表达均升高(P<0.01);③与高糖A组比较,高糖B组系膜细胞中TGF-β1和PDGF-BB的mRNA及蛋白表达均升高(P<0.01)。结论高糖刺激可以上调大鼠肾小球系膜细胞TGF-β1和PDGF-BB的表达。     

辛伐他汀与阿托伐他汀对高糖培养大鼠肾小球系膜细胞p27蛋白表达的影响

目的探讨辛伐他汀和阿托伐他汀对高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞p27表达的影响。方法将体外培养大鼠肾小球系膜细胞分为正常对照组(葡萄糖浓度5.6mmol/L)、高糖组(葡萄糖浓度30mmol/L)、高糖辛伐他汀组(葡萄糖浓度30mmol/L,辛伐他汀浓度10μmol/L)、高糖阿托伐他汀组(葡萄糖浓度30mmol/L,阿托伐他汀浓度10μmol/L)。每组设置6个复孔,于24、48、72、120h收集细胞,Western blotting法测定大鼠肾小球系膜细胞p27蛋白的表达,逆转录PCR测定p27mRNA的表达。结果高糖组p27蛋白浓度及mRNA水平均较正常对照组升高(P<0.05);高糖辛伐他汀组及高糖阿托伐他汀组p27蛋白浓度及mRNA水平均较高糖组降低(P<0.05)。结论他汀类药物通过调节肾小球系膜细胞p27的表达,可发挥非依赖降脂的肾脏保护作用。     

TRB3在非诺贝特抑制高糖诱导的肾小球系膜细胞增殖中的作用及其机制

目的探讨TRB3在非诺贝特抑制高糖诱导下肾小球系膜细胞增殖中的作用及作用其机制。方法将细胞分为正常对照
组（N,5.5 mmol/L 葡萄糖）、高糖组（H,25 mmom/L 葡萄糖）、高糖+不同浓度的非诺贝特组（FN,10、50、100 μmol/L）。采用
CCK-8法检测细胞增殖率,Hoechst33258染色观察细胞凋亡形态学改变,流式细胞术检测细胞周期改变,免疫细胞化学染色观
察TRB3表达,Western Blot检测细胞中TRB3、P-AKT蛋白的表达。结果高糖能够诱导肾小球系膜细胞增殖（P<0.001）;非诺贝
特能够抑制肾小球系膜细胞增殖（P<0.001）,且具有浓度依赖性。非诺贝特干预后细胞出现凋亡形态学改变;非诺贝特可以使
系膜细胞发生G1/S期阻滞;正常组、高糖组胞浆有少量TRB3蛋白表达,但高糖不能促进TRB3表达增多,随着非诺贝特浓度的
增加TRB3表达量增多,P-AKT表达逐渐降低。结论非诺贝特可以促进TRB3的表达;TRB3可能通过抑制AKt的磷酸化使肾
小球系膜细胞发生G1/S期阻滞从而抑制其增殖。
     

高糖对人肾小球系膜细胞MAPK活性的影响

目的研究高糖对人肾小球系膜细胞丝裂原蛋白激酶(MAPK)活性的影响,探讨其在糖尿病肾病发病中的作用.方法采用人肾小球系膜细胞进行体外培养,按培养液中葡萄糖浓度分为对照组(含11mmol*L-1葡萄糖)、高糖组(含30mmol*L-1葡萄糖)、MAPK抑制剂组(含25μmol*L-1PD98059加30mmol*L-1葡萄糖)及甘露醇组(含20mmol*L-1甘露醇),以32P标记的髓磷脂碱性蛋白为底物,用同位素示踪技术测定培养细胞的MAPK活性.结果高糖组MAPK活性明显高于其它各组;加入MAPK抑制剂后,其活性明显降低,同时细胞的增殖受到抑制.结论高糖可增加人肾小球系膜细胞MAPK活性,且可能与渗透压引起的应激刺激相关.     

蛋白激酶Cα参与高糖致人系膜细胞癌胚纤维连接蛋白的表达

目的:研究高糖环境下人系膜细胞(HMC)蛋白激酶Cα(protein kinase Cα,PKCα)、癌胚纤维连接蛋白(oncofetal FN)表达水平,并进一步探讨PKCα与oncofetal FN mRNA之间的关系。方法:实验HMC分组如下:正常葡萄糖组(NG,5 mmol/L D-葡萄糖),渗透压对照组(LG,5 mmol/L D-葡萄糖+20 mmol/L L-葡萄糖),高葡萄糖组(HG,25 mmol/L D-葡萄糖),高葡萄糖+PKCα抑制剂组(HS,25 mmol/L D-葡萄糖+40μmol/L Safingol)。以激光共聚焦显微镜观察PKCα蛋白表达及转位,RT-PCR法检测oncofetal FN mRNA表达水平。结果:(1)与NG组对比,高葡萄糖可促进蛋白激酶Cα蛋白发生核转位,定量分析示HG组胞浆/胞核强度较NG组降低20%(P<0.05),高葡萄糖刺激诱导HMC oncofetal FN mRNA上调,为NG组的2.36倍(P<0.05)。(2)与HG组比较,HS组PKCα蛋白转位激活被抑制,胞浆/胞核荧光强度比值为HG组的1.15倍,HS组oncofetal FN mRNA表达较HG组降低45%(P值均<0.05)。结论:PKCα的激活参与高葡萄糖致人系膜细胞oncofetal FN的表达。     

RhoGDI1在TNF-α诱导内皮细胞损伤中的作用研究*

目的：阐明Rho特异鸟苷酸解离抑制因子1（RhoGDI1）和Rho/ROCK信号通路在肿瘤坏死因子α（TNF-α）诱导内皮细胞损伤中的作用机制。方法：采用siRNA技术干扰人脐静脉内皮细胞RhoGDI1表达,实验分为正常对照组,10μg·L-1 TNF-α处理组和RhoGDI1干扰组。MTT法检测细胞存活率,TUNEL法检测细胞凋亡,Western blot检测RhoGDI1、RhoA、ROCK表达及活化。结果：TNF-α处理和RhoGDI1干扰均显著降低内皮细胞存活率,提高内皮细胞的凋亡。TNF-α处理后RhoGDI1表达显著下降,TNF-α处理和RhoGDI1干扰均可显著提高RhoA表达以及ROCK活化。结论：TNF-α可能通过抑制RhoGDI1促进Rho/ROCK信号通路的活化,最终引起内皮细胞凋亡。     

脂联素对高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞血管内皮生长因子表达的影响

目的 观察脂联素对高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞表达血管内皮生长因子(VEGF)的影响,探讨脂联素在糖尿病肾病中可能的保护作用.方法 体外培养大鼠肾小球系膜细胞,随机分为7组:对照组、高糖A组、高糖B组(培养液葡萄糖浓度分别为5.6 mmol/L、15 mmol/L、30 mmol/L);脂联素A、B、C、D组(各组培养液葡萄糖浓度均为30 mmol/L+脂联素,脂联素浓度依次为2.5 μg/ml、5 μg/ml、10 μg/ml、20 μg/ml),作用24 h,RT-PCR法测定各组细胞VEGF mRNA表达水平;ELISA法测定各组上清液中VEGF蛋白的含量.结果 与对照组相比,高糖A组、高糖B组大鼠肾小球系膜细胞VEGF mRNA及VEGF蛋白表达升高(P＜0.05);脂联素各组大鼠肾小球系膜细胞VEGF mRNA及VEGF蛋白表达低于高糖B组(P＜0.05).结论 高糖可刺激大鼠肾系膜细胞VEGF表达增高,脂联素可抑制高糖环境下系膜细胞对VEGF的表达.     

脂联素干预对高糖环境下大鼠肾小球系膜细胞表达色素上皮衍生因子的影响

目的:探讨脂联素对高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞中色素上皮衍生因子(PEDF)表达的影响.方法:体外常规培养大鼠系膜细胞,传代后分组:对照组(培养液葡萄糖浓度5.6 mmol/L) 、高糖A 、B组(培养液葡萄糖浓度分别为15,30 mmol/L)、脂联素A、B、C、D组 (30 mmol/L葡萄糖培养液+脂联素,使培养液脂联素浓度分别为2.5,5,10,20 mg/L),分别作用24 h后,RT-PCR法测定各组细胞PEDF mRNA的表达水平;ELISA法测定各组上清液中PEDF蛋白的含量.结果:(1)与对照组相比,高糖各组大鼠肾小球系膜细胞PEDF mRNA及PEDF蛋白表达显著降低(P<0.05);(2)脂联素干预各组高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞PEDF mRNA及PEDF蛋白表达恢复(P<0.01).结论:高糖可抑制大鼠肾系膜细胞PEDF的表达,脂联素干预可逆转这一改变.     

α受体介导的雌二醇对大鼠结肠平滑肌细胞RhoA/ROCK通路的影响

目的：探讨17β?雌二醇（17β?estraial,E2）对大鼠结肠平滑肌细胞（smooth muscle cell,SMC）RhoA/ROCK通路的影响。方法：体外分离培养Sprague?Dawley（SD）大鼠结肠SMCs。细胞免疫荧光双标法观察ROCK1、雌激素受体（ER)α与α肌动蛋白（α?SMA）共表达。不同浓度和不同时间E2刺激后,以反转录实时荧光定量qRT?PCR、Western blot检测RhoA、ROCK1表达。不同浓度ROCK抑制剂Y27632刺激后,Western blot检测E2对其下游蛋白表达情况。观察ER阻断剂ICI182780、牛血清白蛋白结合的E2（BSA?E2）、ERα激动剂PPT及ERβ激动剂DPN在E2影响RhoA、ROCK1表达的作用。构建ERα、ERβ的siRNA,观察E2刺激对转染后SMC中RhoA、ROCK1表达的影响。结果：细胞免疫荧光示结肠SMC上 ROCK1与α?SMA共表达。50 nmol/L E2刺激24 h可显著抑制大鼠结肠SMC上RhoA、ROCK1表达（P < 0.05）。Y27632可浓度依赖性抑制下游蛋白p?MYPT1、p?CPI17、p?MLC表达。E2组及PPT组RhoA、ROCK1表达显著低于其他各组（P < 0.05）。ERα siRNA组可上调RhoA、ROCK1表达（P < 0.05）。结论：大鼠结肠SMC上存在ROCK1,E2可抑制RhoA/ROCK通路表达,该作用由雌激素α受体介导。