SOCS1沉默的树突状细胞疫苗在喉癌治疗中的实验研究

目的:研究SOCS1沉默的树突状细胞(DC)疫苗特异性抗肿瘤作用机制,并探讨RNAi技术在喉癌基因治疗中的应用前景,为DC的临床应用提供新思路。方法:以细胞因子GM-CSF、IL-4和TNF-α体外诱导扩增外周血单核细胞来源的DC,倒置显微镜下观察DC形态特征;构建RNAi载体转染DC,Western blot检测SOCS1的表达情况,筛选抑制SOCS1表达的有效靶序列;流式细胞术检测DC表面分子CD83、CD86和HLA-DR的表达;ELISA法分析上清中IFN-γ的含量;MTT法评估DC刺激T细胞增殖的能力及诱导细胞毒性T细胞(CTL)的杀伤活性。结果:DC体外诱导培养成功;设计的RNAi载体经测序验证无误。干扰序列5可显著下调SOCS1表达水平;SOCS1沉默联合喉癌Hep-2抗原致敏的DC可显著上调表面分子标志CD83(85.61±0.96)%、CD86(96.86±1.20)%和HLA-DR(98.02±0.94)%的表达;该组DC能有效刺激T细胞增殖,增加IFN-γ的分泌量,最终增强CTL的特异性杀伤作用,效靶比为50∶1时其杀伤活性与对照组之间的差异有统计学意义(P<0.01)。结论:SOCS1沉默并负载喉癌Hep-2抗原的DC疫苗可以产生高效而特异性的抗喉癌免疫应答。     

树突状细胞表型抗原在喉咽癌颈部淋巴结中的表达

目的：探讨喉咽癌颈部淋巴结中树突状细胞（Dc）表型抗原的表达与喉咽癌转移及预后的关系。方法：对37例喉咽癌144枚淋巴结DC的表型抗原S-100、CD1a、CD83的表达用Envision HIS的方法检测,并观察CD45RO^＋T细胞与DC的关系。结果：S-100^＋DC、CD1a^＋DC、CD83^＋DC在转移组淋巴结中的数目较非转移组淋巴结中减少,差异有统计学意义。CD83^＋DC在转移淋巴结的癌巢中的数目较癌旁中的少,差异有统计学意义。在生存组淋巴结中的浸润数目较死亡组多,差异有统计学意义。CD45RO^＋T细胞主要分布在CD83^＋DC的周围。结论：表达不同表型抗原的DC具有不同的功能,CD83^＋DCs被认为是成熟DC分布在癌旁与其激活T细胞的抗原提呈功能有关,对于肿瘤免疫防御机制的建立起着重要作用。DC在淋巴结中的浸润程度及表型抗原的表达情况是反映宿主肿瘤免疫状况的重要指标,也是预测喉咽癌转移和预后的一项重要指标。     

鼻咽癌可溶性抗原负载DC诱导CTL杀伤鼻咽癌细胞的体外研究

目的用负载鼻咽癌细胞(CNE)可溶性抗原的树突状细胞(dendritic cells, DC)诱导自身淋巴细胞,使之活化为鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)特异性细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL),观察其对鼻咽癌细胞的体外特异性杀伤作用. 方法用GM-CSF、IL-4和TNF-α体外诱导健康成人外周血单核细胞,使其分化为高纯度DC.用鼻咽癌细胞(CNE)可溶性抗原负载成熟DC,流式细胞仪检测负载前后DC的表型特征,MLR检测负载前后DC对同种异体T淋巴细胞增殖的能力.在白细胞介素-2(IL-2)的作用下,用负载鼻咽癌细胞可溶性抗原的DC诱导自身淋巴细胞成NPC特异性CTL,通过杀伤活性实验观察它对鼻咽癌细胞(CNE)的特异性杀伤效应. 结果人外周血单核细胞体外在GM-CSF、IL-4、TNF-α诱导下获得具典型表型特征的成熟DC.负载CNE可溶性抗原对成熟DC表面共刺激分子及特异性表面标志无影响,仍有较强的刺激同种异体淋巴细胞增殖能力,所诱导的CTL对鼻咽癌细胞(CNE)有明显的特异性杀伤作用.结论负载鼻咽癌细胞(CNE)可溶性抗原的DC所诱导的CTL在体外对鼻咽癌细胞有特异性杀伤作用,对NPC的临床治疗有潜在的应用价值.     

酪氨酸激酶受体B在鼻咽癌中的表达及临床意义

目的：探讨酪氨酸激酶受体B（TrkB）及其配体脑源性神经营养因子（BDNF）的表达水平在鼻咽癌（NPC）发生与发展中的作用。方法：用免疫组织化学染色法检测TrkB及其配体BDNF在NPC患者活检切片中的表达。结果：TrkB和BDNF在NPC组中的阳性表达率分别为82．5％（47／57）和52．6％（30／57），均高于鼻咽炎组（均P〈0．05）；TrkB在NPC组中的表达水平与肿瘤的TNM分期及临床分期有关，在T3＋T4、Ⅲ＋Ⅳ期比在T1＋T2、Ⅰ＋Ⅱ期高（均P〈0．05）；NPC伴颈部淋巴结转移组较非转移组的表达高（P〈0．05）；TrkB和BDNF的表达在NPC组织学类型之间差异无统计学意义（P〉0．05）；BDNF的表达与NPC TNM分期、临床分期及有无颈部淋巴结转移无关（均P〉0．05）；NPC组中TrkB与BDNF的表达无相关性（r=0．049，P〉0．05）。结论：TrkB及其配体BDNF表达上调对NPC的发生具有重要作用，NPC组织中TrkB及其配体BDNF蛋白表达水平可作为预测NPC发生及浸润转移的重要指标。     

喉咽癌树突状细胞表型抗原表达

目的对喉咽癌中树突状细胞(Dendriticcells,DCs)的表型抗原的表达进行研究,探讨DC表型抗原的表达与喉咽癌各临床因素尤其是转移和预后的关系。方法对45例喉咽癌标本,用EnvisionHIS的方法检测DC的表型抗原S-100、CD1a、CD83的表达,并观察CD45RO T细胞与DC的关系。结果S-100 DCs在高分化组以及生存组中的数目明显多于中低分化组及死亡组,具有显著性差异。CD83 DCs的表达与喉咽癌的分化程度、远处转移、生存以及是否复发有关,差异具有显著性;CD83 DCs在癌巢中的数目较癌旁中的少,差异具有显著性。CD1a DCs的表达与喉咽癌的各临床因素间未发现明显相关性。CD45RO T细胞主要分布在CD83 DCs的周围。结论表达不同表型抗原的DC具有不同的功能,CD83 DCs被认为是成熟DC分布在癌旁与其激活T细胞的抗原提呈功能有关,对于肿瘤免疫防御机制的建立起着重要作用。DC在喉咽癌中的浸润程度及表型抗原的表达情况是反映宿主肿瘤免疫状况的重要指标,也是预测喉咽癌转移和预后的一项重要指标。     

RECK基因在鼻咽癌中的表达及其临床意义

目的检测伴有Kazal域的富含半胱氨酸的逆转诱导蛋白（reversion-inducing cysteine-rich protein with Kazal motif,RECK）基因在鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC）组织中的表达及其与临床病理因素的关系。方法采用原位杂交技术检测60例原发性NPC（颈淋巴结转移组和无颈淋巴结转移组各30例）、10例NPC颈部转移淋巴结（metastastic lymph node,MLN）和20例鼻咽黏膜慢性炎症组织（chronic nasopharyngitis tissue,CNT）中RECK mRNA的表达,并对NPC各临床病理参数进行分析。结果 CNT、NPC和MLN中RECK的阳性表达率分别为85.0%（17/20）、26.7%（16/60）和30.0%（3/10）。与CNT比较,NPC和MLN中RECK表达下调,差异均有统计学意义（P均〈0.05）。NPC有淋巴结转移组与无淋巴结转移组RECK阳性表达率分别为13.3%（4/30）和40.0%（12/30）,两者比较,差异有显著性（P〈0.05）。NPC原发灶中RECK低表达与患者性别、年龄、T分级和临床分期无关（P均〉0.05）,与颈淋巴结转移、复发和治疗后5年生存期有关（P均〈0.05）。结论 RECK基因低表达可能与NPC的进展有关,它可作为评估NPC颈淋巴转移、复发及预后的生物学参考指标。     

KAI1/CD82在喉癌组织中的表达及其临床意义

目的：探讨KAI1／CD82在喉癌组织中的表达水平及与患者临床病理特征的关系。方法：选取61例喉癌患者手术切除的病理组织标本（喉癌组）及61例癌旁组织标本（对照组），应用免疫组织化学法检测KAI1／CD82的表达水平。结果：喉癌组KAI1／CD82的表达水平低于对照组（P〈0.05）；肿瘤原发灶KAI1／CD82表达水平高于淋巴结转移灶（P〈0.05）；KAI1／CD82的表达水平与喉癌患者的淋巴结转移密切相关（P〈0.05），但在不同年龄、临床分期及组织分化程度的患者之间的表达差异无统计学意义（P〉0.05）。结论：KAI1／CD82的表达在喉癌的转移过程中具有一定作用，可作为预测肿瘤转移潜能的指标。     

喉癌患者树突状细胞的体外培养和功能研究

目的 体外分离培养喉鳞状细胞癌患者外周血来源的树突状细胞（dendritic cell,DC）,并研究其功能.方法无菌条件下常规采集外周血20 ml,密度梯度离心分离淋巴细胞,去除悬浮细胞后获得外周血单核细胞.加入GM-CSF、TNF-α、IL-4三种诱导因子,孵育7天后,行透射电镜检查、流式细胞仪检测DC表面活化T细胞所必须的共刺激分子CD80及MTT法检测负载肿瘤抗原后的DC对自体混合淋巴细胞的刺激增殖作用.结果喉癌患者外周血来源的单核细胞经体外培养7天后形态上具有典型的DC特征,高表达DC活化T细胞所必须的共刺激分子CD80为69.15%,且较未在体外诱导培养前（33.76%）明显增高.少量负载肿瘤抗原的DC即可激发强烈的T淋巴细胞增殖作用.结论喉癌患者外周血来源的DC前体细胞可通过体外的分离和培养得到功能正常的DC.     

EB病毒潜伏膜蛋白2A诱导细胞毒性T细胞抗鼻咽癌的体内外实验

目的观察EB病毒（Epstein—Barr virus，EBV）-潜伏膜蛋白2A（1atent membrane protein2A，LMP2A）转染人树突状细胞（dendritic cell，DC）诱导特异性细胞毒性T细胞（cytotoxicity T lymphocyte，CTL）的体外生物学特性；建立表达EBV—LMP2A的裸鼠鼻咽癌动物模型，探讨LMP2A特异性CTL在荷瘤鼠体内的抗肿瘤效应。方法分离人外周血单核细胞（pripheral blood mononuclear cell，PBMC），以粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte—monocyte colony stimulating factor，GM—CSF）、白细胞介素4（interleukin-4，IL4）及肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α，TNF—α）诱导培养获得DC，荧光激活细胞分选仪（fluorescence activated cell sorter，FACS）检测成熟DC的表面分子表达。用LMP2A重组腺病毒转染成熟DC，将转染DC与自体PBMC混合培养，在白细胞介素2（interleukin-2，IL-2）作用下诱导针对LMP2A的特异性CTL，FACS检测CTL群体中阳性细胞的组成。将鼻咽癌CNE细胞接种BALB／c裸鼠，建立鼻咽癌动物模型；在裸鼠肿瘤局部注射LMP2A特异性CTL，观察治疗后移植瘤生长情况及病理变化。结果人外周血PBMC体外在GM—CSF、IL4、TNF—α诱导下获得典型形态及表型特征的成熟DC。FACS检测表明，以LMP2A重组腺病毒转染DC诱导的CTL细胞群体以CIM、CD8阳性细胞组成为主。在接种CNE细胞3周后建立表达EBV—LMP2A的裸鼠鼻咽癌动物模型；动物体内实验表明注射CTL的裸鼠肿瘤生长缓慢，体积明显小于对照组（P〈0．01）；病理检查显示肿瘤局部发生液化性坏死并有淋巴细胞浸润。结论人外周血单核细胞体外经细胞因子诱导，可生成具典型特征的成熟DC。利用LMP2A重组腺病毒将LMP2A基因转入DC，可在同一个体体外诱导出针对LMP2A的特异性CTL。CNE细胞接种裸鼠，可成功构建鼻咽癌动物模型；LMP2A特异性CTL在动物体内可明显抑制鼻咽癌肿瘤的生长，发挥有效的抗肿瘤作用。     

阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征T细胞CD69的表达

目的　探讨阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征（OSAHS）患者外周血T细胞CD69表达率的检测及意义。方法　选择81例经多道睡眠图监测确诊的OSAHS患者,根据呼吸暂停低通气指数（AHI）分为轻度、中度、重度3组,每组27例;27例无OSAHS的打鼾者作为对照组。流式细胞术检测T细胞CD69表达率,分析T细胞CD69表达率与一般资料多道睡眠图监测指标的相关性。结果　①OSAHS患者外周血T细胞CD69表达率随着OSAHS严重程度上升逐渐增加（F =14.736,P＜0.01）;两两比较,对照组与轻度组间T细胞CD69表达率无明显差别（t =1.649,P＞0.05）;其余组间比较,均存在明显差别（P＜0.05）。②OSAHS患者外周血T细胞CD69表达率和体质量指数、年龄、性别均无相关 性（P＞0.05）,和AHI呈正相关,与最低动脉血氧饱和度呈负相关（P＜0.05）。③手术及持续气道正压通气联合治疗的27例重度OSAHS患者AHI及外周血T细胞CD69表达率 明显降低,最低动脉血氧饱和度明显上升,存在显著差别（P＜0.05）。结论　外周血T细胞CD69表达率上升可能为OSAHS并发心血管疾病机制之一,T细胞CD69表达率的检 测对OSAHS患者病情程度的反映及并发心血管损害趋势的评估具有一定的临床意义。     

鼻咽癌患者外周血CD4+CD25high调节性T细胞分析

目的:探讨鼻咽癌患者外周血CD4 CD25h igh调节性T(Tr)细胞比例变化的特点及其临床意义。方法:采用流式细胞术检测54例初治鼻咽癌患者(鼻咽癌组)和15例健康者(对照组)外周血中CD3 、CD4 、CD8 及CD4 CD25h ighT细胞比例。结果:鼻咽癌患者CD4 T细胞比例、CD4 /CD8 比值均低于对照组(均P<0.05),但CD4 CD25h ighTr细胞比例明显高于对照组(P<0.01)。随疾病进展鼻咽癌患者外周血CD4 CD25h ighTr细胞比例升高[Ⅰ Ⅱ期为(2.28±1.07)%,Ⅲ期为(3.65±1.21)%,Ⅳ期为(4.72±0.87)%],Ⅰ Ⅱ期与Ⅲ、Ⅳ期比较,均P<0.01;Ⅲ期与Ⅳ期比较,P<0.01。结论:CD4 CD25h ighTr细胞可能是鼻咽癌患者免疫抑制的重要原因之一,与鼻咽癌免疫逃逸有关。外周血CD4 CD25h ighTr细胞比例可能成为鼻咽癌一种新的预后判断指标,去除这群细胞可有效诱导肿瘤免疫,为肿瘤治疗提供一种新的方法。     

鼻咽癌患者外周血γδ T细胞的体外扩增及对鼻咽癌细胞的体外杀伤活性

目的：通过体外扩增鼻咽癌（NPC）患者外周血γδT细胞，研究对NPC细胞体外细胞毒作用，以探讨γδT细胞在NPC免疫机制中的作用。方法：用抗体固相法体外扩增7例NPC患者（NPC组）及6例健康者（对照组）的外周血γδT细胞，以流式细胞仪检测γδT细胞亚型，对MTT法观察不同来源的γδT细胞在不同效靶比条件下，对Daudi、CNE1和CNE2细胞的细胞毒作用。结果：对照组与NPC组外周血γδT细胞经体外扩增，纯度可达到82％以上，其中90％为Vγ/Vδ2亚型；γδT细胞对Daudi、CNE1和CNE2细胞显示出作用强度相同的细胞毒作用（P＞0．05）。随效靶比升高，γδT细胞对CNE1和CNE2的细胞毒作用明显增强，在相同效靶比时对Daudi细胞的细胞毒作用最强。结论：NPC患者外周血γδT细胞对NPC细胞有明显体外杀伤作用。     

CD4+C25+Treg细胞与喉鳞状细胞癌的相关性研究

［摘要］目的：研究CD4+CD25+Treg细胞与喉鳞状细胞癌的相关关系。方法：收集2005年7月至2005年12月山东大学齐鲁医院耳鼻咽喉科手术治疗的30例喉鳞状细胞癌患者和同期13例健康献血者的外周血，应用流式细胞仪检测外周血中CD4+CD25+Treg细胞的百分比，用ELISA法检测外周血中TGF β，IL 10，IFN γ的含量。结果：喉鳞状细胞癌患者与正常对照组外周血中CD4+CD25+Treg细胞的百分比分别为（8.72±1.54）%和（4.64±0.93）%，喉鳞状细胞癌组高于正常对照组(P＜0.05)，但与性别、年龄、临床分期、淋巴结转移无关。喉鳞状细胞癌患者外周血中TGF β，IL 10含量分别为(10.96±1.19)?pg/ml和(15.87±2.17)?pg/ml，高于正常对照组的(6.77±0.72)?pg/ml,(1.8±2.5)?pg/ml (P＜0.05)；但IFN γ的含量为(16.67±8.39)?pg/ml，低于正常对照组的(21.98±9.64)?pg/ml(P＜0.05)。结论：CD4+CD25+Treg细胞在喉癌患者外周血中大量增加,下调T细胞介导的肿瘤免疫。     

变应性鼻炎患者血清CD23和CD19表达及其与血清总IgE的关系

目的：探讨变应性鼻炎（AR）患者外周血淋巴细胞CD23、CD19表达及其与血清总IgE、鼻部过敏症状的关系。方法：对46例AR患者进行症状评分后,采用流式细胞术及免疫化学发光法检测其外周血淋巴细胞CD23、CD19表达率和血清总IgE水平,并以32例健康体检者为对照。结果：①AR患者外周血CD23^＋、CD19^＋及CD23^＋／CD19^＋淋巴细胞百分率（^-x±s）分别为11.6±1.9、22.8土3.3和10.2±1.7,分别高于对照组（P〈0.05）。②CD23^＋、CD19^＋、CD23^＋／CD19^＋表达百分率与血清总IgE水平、AR症状评分之间存在正相关。③三者之中以CD23^＋／CD19^＋表达百分率与血清总IgE水平、AR症状评分相关性最强（r值分别为0.65和0.49,P〈0.05）。④CD23^＋／CD19^＋与AR症状评分相关程度优于血清总IgE对应值（r=0.33,P〈0.05）。结论：外周血淋巴细胞CD23、CD19表达参与AR发病,并可能是血清总IgE水平的影响因素,检测CD23^＋／CD19^＋表达率有助于对AR病情的判断。     

阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征患儿手术前后淋巴细胞亚群分析

目的 检测阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(OSAHS)患儿手术前、后外周血淋巴细胞亚群的比例,研究手术前及手术后3～6个月患儿淋巴细胞亚群比例的改变情况.方法 随机选择30例OSAHS患儿,采集外周静脉血进行淋巴细胞亚群检测,所有患儿均住院在全麻下接受扁桃体联合腺样体等离子切除手术,术后3～6个月进行复查.选取30例年...     

鼻咽癌患者外周血淋巴细胞的金属元素与T细胞亚群的研究

目的 :探讨鼻咽癌患者外周血淋巴细胞金属元素和T细胞亚群含量的变化及其与机体免疫功能的关系。方法 :采用日本岛津AA 6 70型原子吸收光谱仪火焰法测定鼻咽癌组和正常对照组外周血淋巴细胞金属元素的含量 ,流式细胞仪测定T细胞亚群。结果 :鼻咽癌组淋巴细胞铜含量显著高于正常对照组 (P <0 .0 1) ,锌含量低于正常对照组 (P <0 .0 5 ) ;鼻咽癌组CD3 、CD4细胞和CD4/CD8比值明显低于正常对照组 (P <0 .0 1)。结论 :鼻咽癌患者外周血淋巴细胞铜含量增高时 ,CD4细胞数量减少 ,表明CD4细胞的克隆发育功能受到影响 ,从而揭示鼻咽癌患者外周血淋巴细胞铜含量的变化与T细胞亚群变化的关系     

EB病毒在鼻咽癌发生中的作用

目的 :探讨鼻咽癌 (NPC)组织及患者外周血白细胞和血清中EB病毒DNA的分布及其与NPC的关系。方法 :采用多聚酶链反应 (PCR)检测 39例NPC组织 (NPC组 1)中EB病毒DNA ,2 4例NPC患者 (NPC组 2 )外周血白细胞及血清中EB病毒DNA ,2 0例慢性鼻咽炎组织 (对照组 1)中EB病毒DNA ,10例头颈部其他部位肿瘤患者 (对照组 2 )和 10例慢性鼻咽炎患者 (对照组 3)外周血白细胞及血清中EB病毒DNA ;同时采用免疫酶法检测NPC组 2、对照组 2和对照组 3血清中EB病毒VCA IgA抗体效价。 结果 :NPC组 1EB病毒DNA阳性率为 71.8% (2 8/ 39) ,对照组 1阳性率为 15 .0 % (3/ 2 0 ) ,其差异有统计学意义 (P <0 .0 5 ) ;NPC组 2外周血白细胞中EB病毒DNA阳性率为 4 1.6 7% (10 / 2 4 ) ,对照组 2阳性率为 10 .0 0 % (1/ 10 ) ,对照组 3外周血白细胞中EB病毒DNA为阴性 ,NPC组 2分别与对照组 2和对照组 3比较 ,差异均有统计学意义 (均P <0 .0 5 ) ;NPC组 2、对照组 2和对照组 3血清中EB病毒DNA均为阴性 ;NPC组 2血清中EB病毒VCA IgA抗体效价分别与对照组 2和对照组 3比较 ;差异均有统计学意义 (均P <0 .0 1)。结论 :NPC组织中检测出EB病毒DNA的阳性率较高 ,外周血白细胞中阳性率较低 ,血清中未能检测出EB病毒DNA ,说明EB病毒从癌组织—→外     

鼻咽癌患者血清血管生长素水平的临床意义初探

目的:分析血管形成素(ANG)在鼻咽癌(NPC)患者血循环中的含量及其临床意义。方法:采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定42例NPC患者(NPC组)和30例健康者(对照组)血清ANG水平。结果:NPC组治疗前血清ANG水平为(371.4±123.5)μg/L,显著高于对照组的(292.5±74.2)μg/L(P<0.01),且血清ANG水平随着NPC临床分期的增加而升高(P<0.05);治疗后血清ANG水平为(340.6±112.4)μg/L,比治疗前明显降低(P<0.05),但仍高于对照组(P<0.05)。结论:NPC患者血清ANG水平升高,且其升高的程度与肿瘤的进展有关。