人白细胞介素6在大肠杆菌中的高效表达

应用PCR和重组DNA技术,结合人工合成寡核苷酸引物,成功地构建成人白细胞介素6高效表达克隆,命名为pBMhIL6,使人rIL-6编码基因受控于P_RP_L串联启动子和人工合成SD序列,且以TAA终止密码子代替原人IL-6的TAG,在E.coli中获得人rIL-6的高效表达。SDS-PAGE和凝胶密度扫描分析证明表达的人rIL-6蛋白占E.coli总菌体蛋白的28%,分子量为21KDa,Western Blot证明其能特异地与抗IL-6 McAb结合。人rIL-6诱导表达动力学研究表明在42℃条件下诱导6小时,表达达峰值。不同菌株表达人rIL-6及其生长状态影响研究提示以E.coli DH5a生长菌密度至0.7时,人rIL-6诱导表达产率较高。以7TD1细胞株~3HTdR法测定表达的人rIL-6的HPGF活性为5×10~6u/L菌液。     

人白细胞介素—15cDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达

从正常人外周血中分离粘附的单核细胞，加入ＬＰＳ刺激４ｈ后提取细胞ｍＲＮＡ反转录获得ｃＤＮＡ第一链，用两对特异引物进行巢式ＰＣＲ扩增出含ＢａｍＨＩ酶切位点的编码人１Ｌ－１５成熟蛋白的ｃＤＮＡ，其大小约３６０ｂｐ。用ＰＥＧ法回收其片段并将其连接到ｐＢＳＳＫ载体的ＳｍａⅠ位点上进行序列分析，结果表明其序列与文献报道一致。然后再将其片段亚克隆插入到ｐＧＥＸ－２Ｔ的ＢａｍＨＩ位点。筛选插入方向正确的克隆，转化大肠杆菌ＪＭ１０９，以１ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ诱导５ｈ收集菌体直接进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，与阴性对照相比，ＭＷ４４ＫＤ处多出一条带，紫外扫描显示此带占菌体蛋白总量的８．８％。ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ证实此带能够特异地与兔抗人ＩＬ－１５的抗体发生反应。证明ＲＴ－ＰＣＲ所得的人ＩＬ－１５ｃＤＮＡ在大肠杆菌中获得了表达，为进一步探讨人ＩＬ－１５的生物学作用打下基础。     

重组小鼠白细胞介素4在大肠杆菌中的高效表达

应用多聚酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)及 DNA 重组技术,我们成功地构建了重组小鼠 IL-4表达克隆,命名为 pBV-mIL4.该质粒含有 P_RP_L 串联启动子,合成 SD 序列和温度敏感的CIts857基因,并且去除了完整小鼠 IL—4 cDNA 中3′侧翼非编码区,以原核系统高频使用的强终止密码子TAA 代替了原小鼠 IL-4基因的终止密码子 TAG,经 SDS-PAGE 及凝胶密度扫描分析,表达的重组小鼠 IL-4分子量约为14.2KDa,占总菌体蛋白量的25～30%.用 HT-2细胞株的~3H-TdR 掺入法测定表明:表达的重组小鼠 IL-4具有 TCGF 样活性,约每升细菌培养物可获1x10~7单位重组小鼠 IL-4,且这种 TCGF 样活性可被抗小鼠 IL-4单克隆抗体特异性中和.在大肠杆菌中表达具有生物活性的重组小鼠 IL-4,为其实验室研究及应用以及批量生产提供了可能.     

人白细胞介素18 cDNA的克隆和在大肠杆菌中的表达

白细胞介素１８（ＩＬ－１８）是１９９５年克隆的一种新型细胞因子，又称ＩＦＮ－γ诱导因子，主要由活化的巨噬细胞产生，其相对分子质量（Ｍｒ）为１８　３００［１、２］。ＩＬ－１８可诱导ＴＨ１细胞产生ＩＦＮ－γ和ＧＭ－ＣＳＦ等细胞因子，增强ＮＫ细胞和ＣＴＬ的活性［１、２］，促进ＩＬ－２介导的Ｔ细胞增殖；增强ＴＨ１等细胞产生ＴＨ１类细胞因子［３、４］；促进免疫细胞表达ＦａｓＬ，增强Ｆａｓ介导的细胞毒作用等多种生物学功能［５］，在抗病原微生物感染﹑抗肿瘤及抗超敏反应等方面具有潜在的应用前景。因此，我们采用Ｒ…     

人重组IL—1受体拮抗剂在大肠杆菌的高效表达

利用ＰＣＲ技术从分裂素刺激的人外周血细胞ｃＤＮＡ文库扩增出人白细胞介素－１受体拮抗剂（ｈＩＬ－１ｒａ）的成熟分子编码区ｃＤＮＡ，将其克隆化插进高效表达的质粒载体ｐＫｐＬ－３α后，在大肠杆菌中高效表达出ｒｈＩＬ－１ｒａ，其Ｎ端序列与预期结果一致。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，ｒｈＩＬ－１ｒａ的表达量占菌体蛋白的３０％以上。体外试验证明，该表达产物对单核细胞衍生的ＩＬ－１活性有明显抑制作用。     

人可溶型IL－4受体在大肠杆菌中的基因克隆与表达

利用ＰＣＲ技术从ＴＦＩ细胞中克隆和扩增人ＩＬ－４ＲｃＤＮＡ胞外片段。经ＤＮＡ测序证实后，定向插入到原核表达载体ｐＢＶ２２０中，井获得了高效表达。表达蛋白经纯化和复性后具有ＩＬ－４结合活性。     

抗人白细胞介素- 4单克隆抗体的制备及应用研究

白细胞介素 4 (ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ,ＩＬ 4 )又称Ｂ细胞生长因子(ＢＣＧＦ)或Ｂ细胞刺激因子 1(ＢＳＦ 1) ,是一种主要由Ｔｈ2细胞亚群产生的细胞因子。ＩＬ 4可促进活化的Ｂ细胞增殖、ＩｇＥ的产生及上调ＦｃεＲⅡ (ＣＤ2 3)分子的表达。ＩＬ 4水平的异常增高 ,见于某些过敏性疾病、传染病和自身免疫性疾病。ＩＬ 4与Ｔｈ1和Ｔｈ2细胞的平衡也有密切的关系[1] 。因此 ,建立一种简便、灵敏的检测体液和细胞中ＩＬ 4的方法 ,对ＩＬ 4的基础及临床研究具有重要的意义。为此 ,我们制备了分泌抗ｒｈＩＬ 4ｍＡｂ的杂交瘤细胞系 ,鉴定了其…     

重组人IL—6在E.coli中的高效表达

通过计算机分析设计,人工合成了寡核苷酸引物,并优化了翻译起始区,应用PCR及重组DNA技术,获得了重组人白细胞介素6(IL—6)高效表达工程菌。从全菌SDS—PAGE考马斯亮蓝染色后薄层密度扫描分析表达产率为38.6％,分子量为2.1×10~4。以IL—6依赖性的小鼠杂交瘤细胞株B9用MTT法测定表达重组人IL—6的HGF活性为2×10~7U/L菌液。不同菌株表达重组人IL—6研究表明,以E.coli DH5α/pBV IL—6表达产率最高。     

人淋巴毒素cDNA在大肠杆菌表达的研究

目的：在大肠杆菌表达人淋巴毒素ｃＤＮＡ。方法：将本室克隆的人淋巴毒素ｃＤＮＡ亚克隆于原核表达载体ｐＢＶ２２０,温控法诱导重组菌,ＳＤＳＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ检测和鉴定结果,ＭＴＴ比色法测定重组ＬＴ活性。结果：成功地表达了人淋巴毒素重组蛋白;重组蛋白占细菌总蛋白的１２％,并具有细胞毒活性,活性单位相当于２×１０５Ｕ／Ｌ菌液。结论：为重组ＬＴ的大量生产、临床应用,为进一步研究人ＬＴ的生物学功能奠定了基础。     

OPG与MBP融合蛋白在大肠杆菌中的表达

目的 克隆人骨保护素（OPG）成熟肽段编码区基因，并在大肠杆菌中表达。方法 采用RT－PCR法，扩增人OPG成熟肽段编码区cDNA，并克隆入原核表达载体pMAL-c2x中，转化BL21（DE3）PlysS大肠杆菌感受态细胞，经0.1mmol/L IPTG诱导后，收集菌体蛋白，进行SDS－PAGE及Western blot鉴定。结果 获得人OPG成熟肽段编码区cDNA，以构建的原核表达载体pMAL-OPG转化菌株后，可表达人OPG和麦芽糖结合蛋白（MBP）的融合蛋白，相对分子质量（M）为85000。表达产物的蛋白量约为菌体总蛋白的13％。Western blot表明，融合蛋白能与抗人OPG多克隆抗体特异性结合。结论 获得人OPG成熟肽全长cDNA，并在大肠杆菌中以OPC－MBP融合蛋白的形式表达。     

重组人截短型胰岛素样生长因子1在大肠杆菌中的高效表达

目的：建立人截短型胰岛素生长因子１的原核高效表达系统。方法：利用基因重组技术将人人截短胰岛素样生长因子１「Ｄｅｓ（１－３）ＩＧＦ１」的ｃＤＮＡ片段克隆到融合蛋白表达载体ｐＭＴＹ４中,用离子交换层析法纯化蛋白并经ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳,放射免疫检测,Ｎ－末端前１６位氨基酸序列测定及生物活性检测等方法对所获蛋白进行了鉴定。结果;获得含人Ｄｅｓ（１－３）ＩＧＦ１基因的重组质粒,在大肠杆菌中高效表达出含     

金黄色葡萄球菌中毒休克综合征毒素1在大肠杆菌中的分泌型表达

中毒休克综合征毒素１（Ｔｏｘｉｃｓｈｏｃｋｓｙｎｄｒｏｍｅｔｏｘｉｎ－１，ＴＳＳＴ－１）在中毒休克综合征（Ｔｏｘｉｃｓｈｏｃｋｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＴＳＳ）的发病过程中起重要作用。本研究应用ＰＣＲ和ＤＮＡ重组技术，构建了ＴＳＳＴ－１分泌型表达载体ｐＲＴＳ２０并在大肠杆菌细胞周质表达出分子量为２２×１０３的重组ＴＳＳＴ－１，表达量约占周质总蛋白的６％～８％。Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹杂交表明，表达产物具有特异的抗原活性。对ＴＳＳＴ－１生物学特性、结构功能关系有待进一步研究。本文对ＴＳＳＴ－１抗毒素的制备具有一定的参考意义。     

抗-D抗体Fab段基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的：于大肠杆菌表达抗-D抗体Fab段基因，为真核载体表达完整的人抗-D抗体奠定基础。 方法： 将已克隆测序的Fab段基因亚克隆到pComb3噬粒载体，用PCR和限制性内切酶酶切鉴定后于大肠杆菌进行表达，表达产物用SDS-PAGE和ELISA等方法分析。 结果： SDS-PAGE电泳表明重组克隆表达了1条约48 kD的蛋白条带, ELISA结果显示，所表达的抗体和Rh+的人红细胞呈阳性反应，和Rh-红细胞反应为阴性，阴性对照和Rh+及Rh-红细胞反应均为阴性。 结论： 于大肠杆菌表达了具有抗原结合特性的人抗-D抗体Fab段抗体分子。     

人纤溶酶原kringle5功能区基因在大肠杆菌中克隆和表达

目的:构建含有人纤溶酶原kringle5功能区基因的表达质粒,了解在E.coli中表达情况。方法:采用基因工程技术将人纤溶酶原kringle5功能区基因插入载体PBV220E.coRI位点,再转化到E.coliTGI中,SDS-PAGE观察基因表达。结果:构建出表达质粒PBVK5,42℃诱导获得表达。结论:人纤溶酶原kringle5功能区基因表达产物以可溶性蛋白形式存在,表达量占菌体总蛋白9.8%。     

人免疫缺陷病毒Ⅰ型包膜糖蛋白gp120基因在大肠杆菌中的高效表达

目的提高人免疫缺陷病毒Ⅰ型（ＨＩＶ－１）包膜糖蛋白ｇｐ１２０基因在原核系统中的表达量。方法采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术扩增出５６０ｂｐ的ＨＩＶ－１ＬＡＶ株ｇｐ１２０Ｎ端基因片段，经ＥｃｏＲⅠ及ＳａｌⅠ酶切后插入高效表达载体ｐＥＴ２８ａ，得到重组质粒ｐＥＴ１２０，并转化表达宿主菌ＢＬ２１（ＤＥ３），经诱导高效表达出ＨＩＶ－１ｇｐ１２０基因片段。结果间接酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ实验表明，表达产物具有良好的抗原性及特异性。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分析结果表明，ｇｐ１２０表达量占总菌体蛋白的５０％。结论在原核系统中高效表达了ＨＩＶ－１ｇｐ１２０基因     

PL启动子控制的人白细胞介素4表达

利用高效表达载体及人工合成的寡核苷酸接头,构建了一个新的人rIL-4表达克隆pBMhIL4,在pL启动子的控制下,于大肠杆菌中表达完整的人rIL-4蛋白分子。表达产物以包涵体形式存在于大肠杆菌胞浆,SDS-PAGE分析表明表达的人rIL-4约占总菌体蛋白的5～10%,分子量约为15KD。抽提复性后具有较高的生物学活性,以其TCGF样活性检测每升菌液含人IL-4 1×10~6 U,改良的3.5 M盐酸胍加0.25%Triton X100裂解包涵体法具有更高的回收率和生物学活性。