逆转录病毒介导的小鼠IL-23基因在小鼠结肠癌细胞中的表达及其抗肿瘤活性

目的：获得表达小鼠IL-23(mIL-23)基因的小鼠结肠癌细胞株。方法：应用逆转录病毒载体，将mIL-23基因导入小鼠结肠癌细胞株Colon26，经G418筛选后获得表达mIL-23的阳性细胞克隆(Colon26／IL-23)。用PCR和RT—PCR检测目的基因的表达，用ELISA法检测mIL-23的产生及mIL-23诱导的小鼠脾细胞IFN-γ的产生，用MTT比色法检测Colon26／IL-23细胞和Colon26细胞的体外增殖，将Colon26／IL-23细胞接种于BALB／c小鼠的右侧背部皮下，观察其致瘤性结果：建立了可表达mIL-23基因的小鼠结肠癌细胞株。分泌至培养上清中的IL-23，可诱导小鼠脾细胞产生IFN-γ在体外Colon26／IL-23细胞的生长与Colon26细胞无明显不同，但其在体内的致瘤性下降，具有抗瘤作用。结论：Colon6／IL-23细胞可分泌IL-23并证明其具有抗瘤活性。     

CD23表达与B细胞增殖分化的研究进展

本文探讨了生理和病情况下Ｂ细胞表面ＣＤ２３的表达，分析了其表达与Ｂ淋巴细胞增殖分化的关系，总结了影响Ｂ细胞表达ＣＤ２３的各在子的作用特点及其可能机制，同时归纳了（可溶怀ＣＤ２３ｓＣＤ２３）的生物学作用及其介导的信号传递途径的研究进展。本文还探讨了要的Ｂ细胞表面ＣＤ２３的表达与Ｂ细胞体外长期存活的分子生物学机制。     

IL-10对U937细胞CD14、CD11b、CD23和HLA-DR表达的影响

Ｋ２〗ＩＬ１０是１９８９年Ｆｉｏｒｅｎｔｉｎｏ等首先发现的一种免疫负调因子,由Ｔｈ２细胞产生,可抑制Ｔｈ１细胞产生ＩＦＮγ［１］。又发现它对单核巨噬细胞、Ｔ细胞、ＮＫ细胞和Ｂ细胞等都有免疫调节作用,但ＩＬ１０对原始细胞免疫调节的研究还很少。Ｕ９３７细胞是一种人原始单核系白血病细胞,代表了单核细胞分化的早期阶段［２］。本文观察了ＩＬ１０对Ｕ９３７细胞固有和ＩＦＮγ诱导下ＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２３和ＨＬＡＤＲ表达的影响。１　材料和方法１－１　细胞系　人原始单核系Ｕ９３７细胞在含１０％…     

膜CD23相关分子及其介导的蛋白磷酸化研究

将ＣＤ２３单克隆抗体包被的琼脂糖４Ｂ株和ＲＰＭＩ－８８６６细胞及活化的Ｂ淋巴细胞蛋白抽提液混合，与ＣＤ２３共沉淀出１７ＫＤａ和１１０ＫＤａ两种ＣＤ２３相关多肽。细胞经胰蛋白酶处理后１１０ＫＤａ的多肽消失。渗透化ＲＰＭＩ－８８６６细胞和活化Ｂ细胞在ＣＤ２３单克隆抗体刺激下，使一组胞内蛋白产生磷酸化。其中ＲＰＭ１－８８６６细胞出现１７ＫＤａ、４８ＫＤａ、５２ＫＤａ、５６ＫＤａ和６０ＫＤａ等五种磷酸化蛋白，Ｂ细胞还多一种３６ＫＤａ的磷酸化蛋白。     

小鼠IL-23基因的克隆和在逆转录病毒中的表达

从肿瘤组织 (含有活化的淋巴细胞 )提取总RNA ,经逆转录多聚酶链反应 (RT PCR )获得小鼠IL 2 3cDNA。经DNA测序分析 ,证实该片段与GeneBank记载的IL 2 3cDNA序列一致。将该目的基因插入LXSN逆转录病毒载体 ,并转染大肠杆菌DH5α中扩增 ,再感染 ψ2 (ecotropic )和PA317(amphotropic )两种包装细胞 ,经G4 18筛选后获得表达IL 2 3分子的PA317阳性细胞克隆。通过用PCR、RT PCR及Northernblot技术检测目的基因表达 ,结果表明 ,成功地将鼠IL 2 3cDNA插入逆转录病毒载体 ,经转染两种包装细胞产生了高表达IL 2 3的PA317细胞克隆。该克隆细胞产生的逆转录病毒可进一步用于转染肿瘤细胞 ,为制备肿瘤疫苗奠定了基础     

CD46 RNAi对CD59介导的T细胞信号转导的作用研究

目的构建携带针对CD46基因的pSUPER retro RNAi逆转录病毒载体,研究糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白CD59与CD46在介导T细胞信号转导中的相关性。方法将能转录产生靶向CD46小发夹RNA(shRNA)的寡核苷酸序列,克隆入逆转录病毒载体pSUPER retro,转化大肠杆菌JM109并转染Jurkat细胞。将Jurkat细胞分为未转染的Jurkat细胞组(Ⅰ组)、转染空质粒的Jurkat细胞组(Ⅱ组)、转染CD59干扰质粒的Jurkat细胞组(Ⅲ组)及转染CD46干扰质粒的Jurkat细胞组(Ⅳ组)。用RT-PCR、Western blot技术检测各组细胞中的CD59、CD46基因的表达水平。用噻唑蓝(MTT)比色法检测CD46与CD59联合作用对4组Jurkat细胞的增殖效应。结果重组载体经PCR及限制性内切酶酶切鉴定初步成功后送测序,结果表明序列正确,构建成功,稳定转染后,Ⅳ组细胞CD46分子的表达被成功抑制,Ⅲ组细胞CD59分子的表达被抑制。Ⅰ组和Ⅱ组细胞CD46与CD59单抗联合作用后,增殖能力明显高于Ⅲ组、Ⅳ组(P<0.05);但Ⅰ组和Ⅱ组,Ⅲ组和Ⅳ组之间无差异。结论 CD59可增强CD46对T细胞信号转导的效应。     

用PCR技术建立CD23全基因的无性繁殖系

参照国外已发表的ＣＤ２３ｃＤＮＡ全基因序列，自行设计并合成一对ＤＮＡ引物（２５ｍｅｒ和１８ｍｅｒ），以ＣＤ２３阳性细胞株ＨＦＢｄ２／３ＤＮＡ为模板，应用ＰＣＲ技术，成功地扩增了ＣＤ２３ｃＤＮＡ全基因（９８７ｂｐ，含人工设计的酶切点），并定向克隆入原核表达载体ｐＢＶ２２０，构建了ｐＢｖ２２０－ＣＤ２３全基因重组体，经６种限制性内切酶酶切鉴定，结果与已发表序列的酶切图谱完全一致，初步证实为ＣＤ２３全基因。这将为今后ＣＤ２３基因的序列测定和表达，进一步在基因水平上探讨ＣＤ２３的生物学功能提供了物质基础。     

逆转录病毒载体介导的HSVtk基因表达及提高重组逆转录病毒滴度的研究

目的 探讨逆转录病毒载体介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVtk)基因表达及提高逆转录病毒滴度的措施。方法 将HSVtk基因插入逆转录病毒载体pRevTRE中,构建重组逆转录病毒载体。通过微乒乓感染法导入包装细胞PA317中,以潮霉素B筛选克隆细胞,浓缩克隆细胞上清制备重组逆转录病毒。在不同时间及不同丁酸钠浓度下,检测分析经筛选获得阳性克隆靶细胞中有无HSVtk基因的表达及如何获得高滴度的重组病毒液。结果 成功构建了重组逆转录病毒载体RevTRE／tk,制备的重组病毒感染靶细胞后有HSVtk基因的表达。结论 通过微乒乓感染法在包装细胞PA317培养30h和10mmol／L丁酸钠浓度下,经冷冻超速离心能获得携HSVtk基因的高滴度逆转录病毒颗粒,为其基因治疗的应用及研究奠定了基础。     

FAK-shRNA重组逆转录病毒载体的构建及稳定表达细胞株的筛选

目的: 研究利用RNA干扰技术,以黏附斑激酶(FAK)为靶基因,构建FAK-shRNA重组逆转录病毒载体,将其导入包装细胞Phoenix中,筛选出稳定产生FAK-shRNA病毒的细胞克隆,以病毒上清感染并筛选FAK表达沉默的细胞株,观察其对相关蛋白表达的影响。方法: 体外合成能转录产生靶向FAK短发夹RNA(shRNA)的寡核苷酸并定向克隆入pSuper.retro逆转录病毒载体,以脂质体法转染Phoenix细胞株,待筛选稳定克隆成功后收获病毒上清,感染人肝癌细胞株HCC-LM3,以嘌呤霉素筛选得到抑制FAK表达的稳定细胞株后用Western boltting鉴定FAK表达的抑制效果及相关蛋白表达情况。结果: 构建了重组逆转录病毒载体pSuper-FAK并抑制了人肝癌HCC-LM3细胞内FAK蛋白的表达。在下调FAK表达的细胞株中p-Akt和p-MAPK1/2表达明显受到抑制。下调FAK的细胞株迁移和侵袭能力下降,细胞周期多被阻止在G₀/G₁期,细胞凋亡增多,增殖率明显下降。结论: 重组逆转录病毒载体pSuper-FAK转染包装细胞Phoenix后,其产生的FAK-shRNA病毒可以抑制HCC-LM3细胞内的FAK蛋白表达并抑制Akt及MAPK1/2磷酸化。下调FAK后可以对肿瘤细胞的生物学行为产生明显影响。     

CD23特异性配体对B细胞增殖及分化的影响

ＣＤ２３特异性配体（抗ＣＤ２３ＭｃＡｂ和ＩｇＥ免疫复合物）与表达ＣＤ２３分子的活化Ｂ细胞共育，然后分析其对Ｂ细胞增殖和分化的影响。结果表明，抗ＣＤ２３单抗及ＩｇＥ免疫复合物（ＩｇＥＩＣ）对Ｂ细胞增殖呈促进和抑制双向调节效应，即：在高浓度（ＣＤ２３单抗〉０．１６μｍ／ｍｌ，ＩｇＥＩＣ〉２．５μｇ／ｍｌ）时呈剂量依赖性抑制，而在某一适当浓度范围内ＣＤ２３ＭｃＡｂ在（０．００２５～０．０５μｇ／ｍｌ，Ｉ     

稳定表达人巨细胞病毒蛋白pUL23细胞系建立及其功能研究

目的:建立稳定表达人巨细胞病毒UL23基因的HELF细胞系,研究病毒蛋白在宿主细胞内行为,为进一步研究人巨细胞病毒蛋白pUL23的功能提供依据。方法:通过PCR技术从人巨细胞病毒基因组中扩增出UL23基因,通过分子克隆技术构建重组逆转录病毒表达载体pLEGFP-N1-FLAG-UL23。将该载体导入Am-phoPackTM-293细胞,收获重组逆转录病毒,然后感染HELF细胞,HELF经持续G418抗性筛选后获得稳定表达UL23基因的细胞系。采用激光共聚焦显微镜观察病毒蛋白在细胞内的定位。结果:RT-PCR、Western blotting结果证实病毒基因UL23能够整合到宿主细胞基因组中,并能在宿主细胞中稳定表达病毒蛋白。共聚焦显微镜观察到病毒蛋白pUL23定位于细胞质,处于细胞核周边。结论:利用逆转录病毒载体介导的基因转移技术,成功构建了稳定表达UL23基因的转基因细胞系。该病毒蛋白在宿主细胞质中的定位,提示病毒蛋白发挥功能的空间位于细胞核周边,有利地推进了人巨细胞病毒蛋白pUL23功能研究的进程。     

Homotypic aggregation of murine B lymphocytes is independent of CD23

CD23 is a low-affinity receptor for IgE (Fc?RII). Functions attributed to CD23 not involving IgE suggest that it interacts with ligands other than IgE. CD21 has recently been described as a counter ligand for CD23. A number of lines of evidence have implicated CD23 as an adhesion molecule in human B cells. We have investigated the role of CD23 in homotypic B cell aggregation in the mouse, using lipopolysaccharide plus interleukin-4-induced aggregation as a model system. In this system high levels of aggregation are accompanied by a massive up-regulation of CD23 expression. However, in contrast to what has been observed in human B cells, we find no evidence of a role for CD23 in homotypic adhesion of murine B cells.     

CD23 and CD21 function as adhesion molecules in homotypic aggregation of human B lymphocytes

We have previously found that interleukin-4 and CD40 monoclonal antibodies (mAb) are strong potentiatiors of homotypic B cell aggregation which is dependent on LFA-1. We show here that CD23 mAb were also able to inhibit aggregation to a similar extent as LFA-1 antibodies. This inhibition was restricted to the MHM6 epitope of CD23 and antibodies to other epitopes [Epstein-Barr virus (EBV) CS-1, EBV CS-2, EBV CS-5 and mAb 25] or occupation of the Fc-binding site by IgE had no or a slightly enhancing effect on aggregation. When testing two antibodies to CD21, the recently defined ligand for CD23, one of these (BU32) was found to be inhibitory whereas the other (THB5) had no effect. By combining antibodies to LFA-1 and CD23, aggregation was often completely inhibited. These data suggest that LFA-1/ICAM-1 and CD23/CD21 are the major molecules involved in homotypic aggregation of human B cells.     

Soluble CD40 ligand induces expression of CD25 and CD23 in resting human tonsillar B lymphocytes

In this report, we describe the dose-dependent increase in both CD25 and CD23 levels on resting human B cells in response to CD40 ligation, as mediated by soluble CD40 ligand (sCD40L) or anti-CD40 antibody. In combination with interleukin (IL)-4, sCD40L had limited additive effects on CD25 expression, but significantly enhanced CD23 expression on tonsillar B cells. Interferon-γ (IFN-γ) exerted no inhibitory effect upon increases in CD25 or CD23 driven by CD40 ligation with sCD40L or anti-CD40 antibody. These data suggest that the induction of CD25 and CD23 genes by IL-4 is mediated, at least in part, by an IFN-γ-sensitive component, whereas gene activation driven via CD40 ligation involves signaling pathways which are not sensitive to IFN-γ.     

Function of CD23 in the response of human B cells to antigen

Co-ligation of antigen receptor and complement receptor 2 (CD21) in the B cell membrane is important in the immune response to T-dependent antigens. Four CD21 ligands have so far been identified, but only the activated products of the third component of complement (C3) are known to augment the immune response to specific antigens. The most recently discovered ligand for CD21 is CD23. We have generated a CD32⁺ CD23⁺ fibroblast cell line which presents a surrogate antigen (anti-IgM) to human tonsil B cells in vitro. Incubation with these cells causes a 10- to 100-fold reduction in the threshold concentration of anti-IgM required for B cell proliferation. Anti-CD19 further enhances the response to antigen and induces proliferation in the absence of anti-IgM. Addition of soluble CD21 totally inhibits the effect of CD23, suggesting that CD21 mediates synergistic signaling by CD23.     

转染人BTLA基因细胞株的建立及其生物学功能的初步研究

目的:构建B、T淋巴细胞衰减子(BTLA)基因转染的细胞作为免疫原,并探讨该基因转染细胞在体外的生物学功能。方法:通过RT-PCR法从经PHA活化的人外周血T细胞中克隆出人BTLA编码区全长基因,经EcoR I和BamHI双酶切后插入逆转录病毒载体pEGZ-Term中构建成重组载体pEGZ-Term/BTLA。用脂质体法以重组逆转录病毒载体转染293T细胞,并用Zeocin抗生素进行长期筛选;流式细胞术分析BTLA在基因转染细胞膜上的表达;通过MTT法和流式细胞术探讨基因转染细胞在体外对T淋巴细胞增殖与活化的影响。结果:流式细胞术检测表明BTLA基因转染的293T细胞膜上能稳定地高表达人BTLA蛋白。BTLA基因转染的293T细胞和T细胞体外共培养显示,与未转染的293T细胞相比,该基因转染的细胞能部分地抑制抗人CD3单克隆抗体(mAb)刺激的T细胞增殖;流式细胞术和ELISA法分析揭示,该基因转染的细胞能够下调T细胞表面活化标志CD25的表达并降低IFN-γ和IL-10的分泌。结论:获得稳定高表达人BTLA基因转染的细胞株。该细胞株在体外对抗人CD3 mAb刺激的T细胞的增殖与活化具有部分地抑制作用。     

稳定表达CD200的U937细胞株的建立

目的：构建稳定表达CD200蛋白的人单核细胞系U937细胞株,为研究该基因的作用机制奠定基础。方法：用电转染基因法将含有人CD200 cDNA的真核表达载体pcDNA3-CD200质粒和pcDNA3质粒分别转入人单核细胞系U937细胞中,经G418筛选,转染阳性细胞连续传代培养,并应用RT-PCR及流式细胞术检测CD200 mRNA和蛋白表达情况。结果：经G418筛选,U937细胞全部死亡,转染pcDNA3质粒和pcDNA3-CD200重组质粒的U937细胞存活,并可连续传代培养30代;转染pcDNA3-CD200重组质粒的U937细胞RT-PCR检测有一特异性扩增带;流式细胞术检测CD200表达结果显示：转染pcD-NA3-CD200重组质粒的U937细胞CD200表达阳性细胞率（77.20%）显著高于转染pcDNA3质粒（3.20%）和U937细胞组（2.10%）（F=133996.40,P〈0.01）;各代间差异无显著性（F=1.03,P〉0.05）。结论：用基因转染法成功地建立了稳定表达CD200蛋白的人单核细胞株U937-pcDNA3-CD200。