人Ⅱ型免疫缺陷病毒gag基因在大肠杆菌中的表达

目的：表达ＨＩＶ－２基因工程ｇａｇ抗原。方法：将编码ＨＩＶ－２型ｇａｇ的部分和全部ｐ５５ｇａｇ１／２基因,克隆到载体ｐＥＴ－１７ｂ后,分别在Ｅ．Ｃｏｌｉ ＢＩ２１中表达。结果;表达产物为５１和６１ｋＤ融合蛋白,并可与ＨＩＶ－２病人血清发生特异性反应。     

应用PRPL串联启动子表达HIV-2gag蛋白

探讨ＨＩＶ－２ｇａｇ非融合蛋白的表达。方法：应用ＤＮＡ重组技术,将ＨＩＶｇａｇ基因全序列（ｇａｇ）和部分（ｇａｇ’）ｃＤＮＡ片段克隆到ｐＢＶ２２０载体ＰＲＰＬ串联启动子下游,构建成ＨＩＶ－２ｇａｇ重组表达载体ｐＢＶ－ｇａｇ和ｐＶＢ－ｇａｇ’,在大肠杆菌中表达。结果：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示,ＰＢＶ－ｇａｇ’在２１ｋＤ处可见一明显的客外蛋白带,经薄层扫描分析占菌体总蛋白的６．１％,蛋白印迹结果证明,表达     

人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIv-1)gag前体蛋白片段在大肠杆菌中的表达、纯化及鉴定

人类免疫缺陷病毒Ⅰ型（ＨＩＶ－１）核心抗体的检测对于ＨＩＶ－１感染者的筛选及确证分析，感染病人的预后分析都具有重要的意义。为此需要获得大量重组核心蛋白。本文利用新型原核表达载体ｐＤＯＧ，在大肠杆菌中高效表达了人类免疫缺陷病毒Ⅰ型（ＨＩＶ－１）ｇａｇ基因片段。表达载体利用ＬＰＲ启动子以及Ｔ７噬菌体基因１０（ｇ１０）的核糖体结合位点（ＲＢＳ）来有效起始表达基因的翻译。表达片段ＰＧ１包括ｐ１７Ｃ－端１３ａａ、整个ｐ２４以及ｐ１５Ｎ－端７４ａａ。与ＰＧ１相比ＰＧ２片段不含有ｐ１７序列，并缺失了ｐ２４Ｎ－…     

人免疫缺陷病毒Ⅰ型包膜糖蛋白gp120基因在大肠杆菌中的高效表达

目的提高人免疫缺陷病毒Ⅰ型（ＨＩＶ－１）包膜糖蛋白ｇｐ１２０基因在原核系统中的表达量。方法采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术扩增出５６０ｂｐ的ＨＩＶ－１ＬＡＶ株ｇｐ１２０Ｎ端基因片段，经ＥｃｏＲⅠ及ＳａｌⅠ酶切后插入高效表达载体ｐＥＴ２８ａ，得到重组质粒ｐＥＴ１２０，并转化表达宿主菌ＢＬ２１（ＤＥ３），经诱导高效表达出ＨＩＶ－１ｇｐ１２０基因片段。结果间接酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ实验表明，表达产物具有良好的抗原性及特异性。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分析结果表明，ｇｐ１２０表达量占总菌体蛋白的５０％。结论在原核系统中高效表达了ＨＩＶ－１ｇｐ１２０基因     

汉坦病毒S基因的分段表达及其表达产物的鉴定

用含ＰＲＰＬ启动子的原核表达载体ＰＧＥＸ－４Ｔ系统，构建了含汉坦病毒７６－１１８株Ｓ基因全长片段（１．３ｋｂ）及部分片段（１．１ｋｂ和０．７ｋｂ）的表达载体ｐＧＥＸ－ＨａｎＳ，并大肠杆菌中分别进行了表达，用１８析具有不同特异性的抗汉坦病毒ｍＡｂ以ＥＬＩＳＡ夹心法对上述表达产物进行了检测，结果表明，重组基因组全长片段的表达产物（ＮＰ）与其中１３株抗汉坦病毒组特异性和Ｉ型特异性ＮＰ的ｍＡｂ均可发生反应     

中国版纳猪MHCI类P1分子全长的原核表达与纯化

目的：获得原核表达的中国版纳猪ＳＬＡＩ类Ｐ１蛋白质分子。方法：ＰＣＲ扩增去信号肽的ＳＬＡＩ类Ｐ１ｃＤＮＡ序列，亚克隆至ｐＧＥＭＴ载体，测序。将亚克隆的Ｐ１　ｃＤＮＡ片段插入表达载体ｐＥＴ４２ｂ（＋），构建重组表达质粒ｐＥＴ－４２ｂ（＋）／ｓｌａ－ｐｌ，转化Ｅ·ｃｏｌｉ表达菌 ＢＬ２１－ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）－ＲＩＬ，ＩＰＴＧ诱导 Ｐ１－８ ｘ ｈｉｓ融合蛋白表达，经包涵体洗涤，８ ｍｏｌ／Ｌ尿素变性溶解，Ｎｉ２＋亲和层析，梯度透析后，定量保存。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ鉴定目的蛋白的表达与纯化。结果：目的蛋白（分子量３９．５ ｋＤ）表达量占细菌总蛋白 １５％，每升表达菌获得纯度９５％的目的蛋白 ４０ ｍｇ～６０ｍｇ。结论：成功建立猪 ＳＬＡ分子全长原核表达、纯化体系，为建立间接识别猪移植抗原ＳＬＡＩ类分子的人Ｔ细胞系及表位分析打下基础。     

人免疫缺陷病毒Ⅰ型包膜糖蛋白gp120基因在大肠杆？…

目的 提高人免疫缺陷病毒Ⅰ型（ＨＩＶ－１）包膜糖蛋白ｇｐ１２０基因在原核中的表达量。方法 采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术扩增出５６０ｂｐ的ＨＩＶ－１ＬＡＶ株ｇｐ１２０Ｎ端基因片段，经ＥｃｏＲⅠ及ＳａｌⅠ酶切后插入高效表达载体ＰＥＴ２８ａ得到重组质粒ｐＥＴ／１２０，并转化表达宿主菌ＢＬ２１（ＤＥ３），经诱导高效表达出ＨＩＶ－１ｇｐ１２０基因片段。结果 间接酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）及Ｗｅｓｔｅｒ     

重组HIV-1腺病毒伴随病毒的构建及表达

目的 构建带有ＨＩＶ－１ ｇａｇ或ｇｐ１２０基因的重组腺病毒伴随病毒ＡＡＶ－ＨＩＶ ｇａｐ或ＡＡＶ－ＨＩＶ ｇｐ１２０。方法 共转染法获取重组ＡＡＶ－ＨＩＶ;免疫酶法检测病毒滴度。结果 测定制备的重组腺病毒伴随病毒ＡＡＶｇａｇ４２,ＡＡＶＧＰ４２,ＡＡＶｇｒＲｊ６,病毒滴度在１０＾４～１０＾５范围。结论 构建了带有ｇａｇ和ｇｐ１２０基因的重组ＡＡＶ－ＨＩＶ,可以感染真核细胞并有较高的表达,可以用于做靶细胞,为发展新型的ＨＩＶ－１重组ＡＡＶ病毒载体活疫苗打下基础。     

重组HIV—1 Gag／Env融合抗原在大肠杆菌中的 …

在大肠杆菌中,利用ｐＤＯＧ载体来源的表达载体ｐＤＧａｇＥｎｖ,高效表达了相对分子质量（Ｍｒ）为４６５００（ｐ４６）的重组ＨＩＶ－１Ｇａｇ／Ｅｎｖ融合抗原（Ｇａｇ２０９￣４３７＋Ｅｎｖ４７４￣５１８＋Ｅｎｖ５４８￣６７５）。表达产物同时还包括：Ｍｒ￣２８５００,Ｍｒ￣２２０００与Ｍｒ￣１９０００３种（ｐ２８,ｐ２２和ｐ１９）蛋白。此４种表达产物均存在于包涵体中,不能被８ｍｏｌ／Ｌ尿素溶解。Ｗｅｓｔｅ     

A组轮状病毒外壳蛋白VP4的原核表达

选用原核表达载体ｐＧＥＸ２Ｔ，该载体表达谷胱苷肽－Ｓ转移酶融合蛋白，将完整的Ａ组轮状病毒外壳蛋白基因插入ｐＥＧＸ２Ｔ中，在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上没有明显的表达条带，而将部分ＶＰ４基因和６３１个碱基，插入ｐＧＥＸ２Ｔ，在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ中有明显的表达条带。     

HIV核心抗原p24原核系统的高效表达、纯化及活性鉴定

目的　在原核表达系统中对HIVp2 4抗原基因进行克隆和高效表达、纯化并鉴定其活性。方法　利用PCR技术从HIV-1全基因质粒 (B2N)中扩增p2 4抗原基因 ,并克隆入T载体中。通过酶切消化后连接到表达载体pRSET上 ,用此连接产物转化大肠埃希菌BL2 1,经IPTG诱导 ,表达p2 4抗原。利用固定化金属离子 (Ni2 )配体亲和层析技术从表达蛋白中纯化目的蛋白。并运用双酶切技术、SDS-PAGE电泳、WesternBlot(WB)及ELISA法分别对插入基因片段的正确性、表达产物的活性及特异性进行检测。结果　PCR产物约为 6 90bp ,与预期p2 4抗原全基因片段大小一致。重组质粒T-p2 4和pRSET-p2 4经BamHⅠ和HindⅢ双酶切 ,其插入的外源基因片段均为 6 90bp。将纯化前与纯化后的蛋白作SDS PAGE电泳 ,均可见一条约 2 4× 10 3的外源基因表达带 ,与计算的相对分子质量相符。经WB和ELISA试验 ,证明基因工程表达的p2 4抗原具有较高的特异性及活性。结论　成功构建了HIVp2 4表达载体pRSET-p2 4 ,并在原核细胞中高效表达 ,其表达产物具有良好的特异性及活性     

利用新型表达载体一步获得HIV-1核壳蛋白p24纯品

目的 利用新型原核表达载体获得人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)核壳蛋白p24纯品。方法 采用聚合酶链反应(PCR)技术扩增出HIV-1 HXB2株gag开放阅读框架的内壳蛋白p24的基因片段，将目的基因片段插入到新型表达载体pTXB中构建成重组表达质粒pTXB-p24。表达产物的纯品通过几丁质珠(chitin beads)的亲和与柱上DTT的剪切而得到。用SDS-PAGE和HPLC分析所得纯品的大小和纯度，用Western blot和胶体金实验检测其抗原性。结果 构建的重组表达质粒pTXB-p24经IPTG诱导得到C端融合Intein-CBD的p24蛋白，该蛋白通过几丁质珠(chitin beads)的亲和与柱上DTT的剪切得到纯化的非融合的p24重组蛋白。HPLC分析表明其纯度可达96％，胶体金结果显示纯化的p24可与HIV-1阳性患者的血清反应，具良好的抗原性。结论 利用新型原核表达载体可一步获得纯度为96％的非融合p24抗原纯品，为大规模生产该蛋白提供了可靠的保证。     

VLDL-R配体结合结构域的克隆与表达

目的构建含VLDL-R配体结合结构域融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌中进行表达与纯化。方法利用PCR技术扩增LBR1-8的DNA片段,将其克隆至原核表达载体pET28a( )中,随后将阳性重组质粒转化到大肠埃希菌Rosetta中,利用IPTG诱导蛋白表达并优化其表达条件,表达产物经Ni -NTA亲和层析柱纯化回收,并采用SDS-PAGE和Western印迹对目的蛋白进行分析和鉴定。结果构建的重组表达质粒经PCR,酶切和DNA测序鉴定与预期的结果一致,含有重组质粒的表达宿主经过IPTG诱导成功表达了LBR1-8,并经优化确定了最佳的诱导表达条件。结论成功构建pET28a( )-LBR1-8表达质粒,表达并经纯化得到了LBR1-8。     

人TRIM 5α基因改构体的表达、纯化及其体外免疫活性研究

构建TRIM5α改构体TRIM5αH(R328-332)的原核表达载体pET28a。转化大肠杆菌BL21 codon plus(DE3),获得重组表达质粒pETTRIM5αH(R328 332),30℃下经IPTG诱导,该融合蛋白在大肠杆菌BL21 codon plus(DE3)中表达。获得的重组的蛋白再经过纯化,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白,并用免疫其沉淀和ELISA等对重组蛋白进行功能研究。结果构建的重组质粒在大肠杆菌中获得表达,经纯化后的重组pETTRIM5αH(R328 332)蛋白纯度可达90%以上,并且证实其在体外与HIV-1gag有结合作用。     

大鼠β细胞素蛋白的表达、纯化及生物学活性鉴定

目的:获得大量重组大鼠β细胞素并检测其活性。方法:用PCR法从大鼠肾组织中扩增534bp的β细胞素基因片段,并按读框克隆到原核表达载体pET28a( )中。以构建的重组质粒pET28a-rBTC转化大肠杆菌BL-21(DE3)菌株,在IPTG诱导下表达β细胞素蛋白,表达产物用SDS-PAGE和Westernblot检测。采用镍柱亲和层析法纯化目的蛋白。结果:经IPTG诱导后,在大肠杆菌中可表达相对分子质量Mr为20000的目的蛋白。目的蛋白主要以包涵体的形式表达;表达量约占菌体蛋白总量的20%～30%。表达的目的蛋白与抗His标签抗体具有良好的反应性。结论:大鼠β细胞素基因在PET表达系统中得到高效表达;蛋白复性后能有效地促进NIH3T3细胞的体外增殖。     

人可溶性DC-SIGN的原核表达及鉴定

目的构建可溶性DC-SIGN（sDC-SIGN）原核表达载体,获得不含标签蛋白的sDC-SIGN蛋白。方法采用PCR方法,从含人DC-SIGNcDNA的重组质粒pGM-DC-SIGN扩增DC-SIGN胞外区基因片段,插入原核表达载体pET17b,构建重组表达载体pET17b-sDC-SIGN,经酶切图谱和测序鉴定,转入E.coliBL21（DE3）诱导表达蛋白,用抗人DC-SIGN抗体-Sepharose4B亲和层系纯化表达产物,以SDS-PAGE和Westernblot鉴定。结果从重组质粒pGM-DC-SIGN扩增获得1300bp目的基因片段,构建重组表达质粒pET17b-sDC-SIGN,其酶切图谱和序列与预期相符。纯化表达产物sDC-SIGN,鉴定其分子质量为38000,Westernbolt证明其可与抗人DC-SIGN抗体特异性结合。结论获得了能高效表达重组人sDC-SIGN的大肠杆菌菌株和不带任何标签蛋白的sDC-SIGN蛋白,为深入研究sDC-SIGN的功能奠定了基础。     

Ⅰ型人免疫缺陷病毒gag-gp120嵌合基因核酸疫苗的构建与鉴定

目的：构建含Ⅰ型人免疫缺陷病毒(HIV-1)gag—gp120嵌合基因核酸疫苗的表达质粒。方法：将gag和gp120连接后的嵌合基因插入到真核表达载体pVAX1中，构建真核表达质粒pVAXGE。用脂质体法将构建的重组质粒转染Hela细胞72h后，取转染的Hela细胞进行RT—PCR检测和和Dot—ELISA分析。结果：重组质粒转染细胞的总RNA中，可扩增出目的基因的转录产物。Dot-ELISA的结果显示，目的基因在Hela细胞内得到表达。结论：成功地构建了表达gag—gp120嵌合基因的核酸疫苗质粒，为HIV—1核酸疫苗的制备奠定基础。     

日本血吸虫TGF-β受体Ⅰ基因胞外段的克隆与表达

目的获得日本血吸虫TGF-β受体I胞外段（SjTβRIout）的序列,行原核克隆和表达,并分析其蛋白的免疫学功能。方法应用cDNA末端快速扩增技术（rapid amplification of cDNA ends,RACE）方法获得SjTβRI基因cDNA部分序列,用RT-PCR方法扩增SjTβRI胞外段（SjTβRIout）基因,构建pET28a（＋）重组原核表达载体,并测序鉴定。将质粒转入大肠埃希菌,IPTG诱导表达,并使用Ni离子亲和层析并透析处理获得纯化重组蛋白。使用纯化蛋白与弗氏佐剂共同免疫SD大鼠获得抗血清,使用ELISA方法检测血清中SjTβRIout特异抗体IgG含量。结果成功构建SjTβRIout原核表达载体。测序鉴定显示SjTβRIout包含399bp,编码133个氨基酸,并且与曼氏血吸虫TGF-β受体I的同源性较高。重组蛋白经SDS-PAGE分析,显示其相对分子质量约为20000,与目的基因编码蛋白的预测分子量相符。经重组蛋白免疫的SD大鼠产生高效价（〉1：100000000）的抗原特异性IgG抗体。结论首次获得pET28a（＋）-SjTβRIout的重组蛋白,并且证明其具有良好的免疫原性。