STAT3-siRNA对人结直肠癌细胞SW480的干涉作用

【目的】应用经小干扰RNA（shortinterfereRNA，smNA）表达盒介导的RNAj对结直肠癌细胞中的STAT3基因进行干涉作用以研究STAT3-siRNA对STAT3基因表达阳性的结直肠癌细胞凋亡的影响。【方法】用脂质体转染试剂将STAT3-siRNA表达盒（STAT3-siRNA expression cassettes，STAT3-SECs）体外转染至人结直肠癌SW480细胞及人成纤维细胞中。于48h后收集细胞，先经荧光染色方法观察细胞表象变化，再通过流式细胞仪检测人结直肠癌SW480细胞凋亡情况，最后分别提取细胞总RNA，用RT—PCR测定STAT3基因在mRNA水平的表达。【结果】SW480STAT3-SECs组的细胞可见凋亡小体，出现明显的凋亡现象，而其它实验组均未出现明显的凋亡现象。流式细胞术结果显示SW480STAT3-SECs组中凋亡细胞百分比由0．2％增加至26．0％；S期细胞比率由32．3％下降至9．2％。在mRNA水平上，SW480STAT3-SECs组细胞的STAT3基因表达减少了（62．16±12．50）％，显著低于SW480对照组（P〈0.01）。【结论】应用RNAi技术沉默STAT3基因可以降低人结直肠癌SW480细胞中STAT3的表达，诱导细胞的凋亡。     

靶向血管内皮细胞因子受体3小干扰RNA腺病毒表达载体的构建

目的构建靶向血管内皮细胞因子受体3(VEGFR-3)的小干扰RNA重组腺病毒表达载体。方法将构建的靶向VEGFR-3特异性小干扰RNA真核表达载体pGenesil-siRNA的启动子及siRNA序列克隆入穿梭质粒pAdTrack,将质粒线性化处理后转化入pAdEasy。重组腺病毒载体线性化处理后转染HEK293细胞,包装重组腺病毒,并进行PCR鉴定、病毒滴度测定;扩增后感染结肠癌LoVo细胞并进行Western blotting检测VEGFR-3蛋白的表达。结果双酶切鉴定及测序证实pAdTrack-pG-siRNA及pAd-VEGFR3-siRNA质粒构建正确,扩增纯化测定重组病毒pAd-VEGFR3-siRNA的滴度为5.6×109pfu/mL。病毒感染结肠癌LoVo细胞后测定VEGFR-3蛋白表达明显降低。结论靶向VEGFR-3小干扰RNA的腺病毒载体构建成功。     

DLC-1基因重组慢病毒表达载体的构建及其在结直肠癌SW480细胞中的表达

目的：构建携带肝癌缺失基因-1（deleted in liver cancer-1,DLC-1）的重组慢病毒表达载体并实现DLC-1基因在结直肠癌（colorectal cancer,CRC）SW480细胞中的过表达。方法：将DLC-1基因的靶序列与载体质粒pcDNA3.1（+）-GFP连接成重组质粒。重组质粒经双酶切法及基因测序验证构建正确后包装成慢病毒颗粒并计算病毒滴度。重组慢病毒感染SW480细胞,同时设置阴性对照组和空白对照组流式细胞仪（flow cytometry,FCM）检测感染率;real-time PCR及Western blot检测SW480细胞中DLC-1基因表达水平。结果：重组质粒构建正确。重组慢病毒滴度为1×109 TU/ml;对SW480细胞的感染率为90%;DLC-1 mRNA在重组慢病毒组细胞中过表达;重组慢病毒组DLC-1 蛋白的表达水平显著高于阴性对照组（P=0.000）;阴性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义（P=0.902）。结论：成功构建了高滴度的DLC-1基因重组慢病毒,其携带的DLC-1基因能够在CRC SW480细胞中过表达,为后续研究DLC-1基因的表达在CRC的发生、发展中的作用奠定了实验基础。     

STAT3-siRNA表达框架的设计与构建

【目的】设计和构建针对STAT3基因的siRNA表达框架，并在结直肠癌细胞中观察其干扰效果。【方法】GeneBank中查询STAT3基因序列，Oligo 6．0软件设计siRNA靶序列，合成并修饰靶序列后PCR扩增siRNA表达框架，通过脂质体介导，直接将扩增产物转染至结直肠癌细胞SW480中，48h后提取细胞总RNA进行RT—PCR检测干扰效果。【结果】RT-PCR结果显示SW480细胞内靶基因STAT3 mRNA水平下降（62．16±12．50）％。【结论】本实验成功设计并构建的siRNA表达框架能干扰人结直肠癌SW480细胞内STAT3基因的表达。     

大鼠BMP-7基因慢病毒载体构建及其在肝星状细胞中的表达

目的 构建携带大鼠BMP-7基因的慢病毒载体并实现该基因在肝星状细胞株HSC-T6中的稳定高表达,为进一步研究BMP-7的抗肝纤维化功能奠定基础。方法 从大鼠细胞基因中提取并用PCR方法扩增BMP-7目的基因,构建BMP-7重组表达载体Lenti-copGFP/puro-BMP7,脂质体法将重组慢病毒载体和包装质粒混合物共转染293TN工具细胞,包装产生慢病毒颗粒。慢病毒感染H1299细胞,根据细胞绿色荧光蛋白（GFP）的表达水平测定病毒滴度。将HSC-T6细胞分为空白组、空病毒对照组及BMP-7慢病毒感染组,分别用Real-Time PCR和Western blotting方法检测BMP-7 mRNA和蛋白的表达。结果 PCR扩增检测阳性菌落和测序证实,成功构建大鼠BMP-7基因重组慢病毒载体。倒置荧光显微镜下观察可见,H1299细胞呈绿色荧光,并测得病毒滴度为1×104 ifμ/μL。重组慢病毒感染HSC-T6后,Real-time PCR和Western blotting方法分别检测到BMP-7 mRNA和蛋白均稳定高表达。BMP-7慢病毒感染组与空病毒对照组比较,差异有统计学意义（P<0.01）;空病毒对照组与空白组比较,差异无统计学意义（P<0.05）。结论 成功构建了带有大鼠BMP-7基因的慢病毒载体,并实现其在HSC-T6的稳定高表达。     

大鼠BMP-7基因慢病毒载体构建及其在肝星状细胞中的表达

目的 构建携带大鼠BMP-7基因的慢病毒载体并实现该基因在肝星状细胞株HSC-T6中的稳定高表达,为进一步研究BMP-7的抗肝纤维化功能奠定基础.方法 从大鼠细胞基因中提取并用PCR方法扩增BMP-7目的基因,构建BMP-7重组表达载体Lenti-copGFP/puro-BMP7,脂质体法将重组慢病毒载体和包装质粒混合物共转染293TN工具细胞,包装产生慢病毒颗粒.慢病毒感染H1299细胞,根据细胞绿色荧光蛋白（GFP）的表达水平测定病毒滴度.将HSC-T6细胞分为空白组、空病毒对照组及BMP-7慢病毒感染组,分别用Real-Time PCR和Western blotting方法检测BMP-7 mRNA和蛋白的表达.结果 PCR扩增检测阳性菌落和测序证实,成功构建大鼠BMP-7基因重组慢病毒载体.倒置荧光显微镜下观察可见,H1299细胞呈绿色荧光,并测得病毒滴度为1×104 ifμ/μL.重组慢病毒感染HSC-T6后,Real-time PCR和Western blotting方法分别检测到BMP-7 mRNA和蛋白均稳定高表达.BMP-7慢病毒感染组与空病毒对照组比较,差异有统计学意义（P〈0.01）;空病毒对照组与空白组比较,差异无统计学意义（P〈0.05）.结论 成功构建了带有大鼠BMP-7基因的慢病毒载体,并实现其在HSC-T6的稳定高表达.     

Lenti-CXCR4-siRNA慢病毒对SW480结肠癌细胞株生长与侵袭的影响

【目的】探讨Lenti-CXCR4-siRNA慢病毒对结肠癌细胞株SW480生长、迁移与侵袭的抑制作用。【方法】应用我们已构建的Lenti-CXCR4-siRNA慢病毒转染SW480细胞,检测CXCR4 RNA干扰对CXCR4 RNA和蛋白的抑制作用,MTS法检测能否抑制细胞增殖,Transwell小室评价对细胞迁移和侵袭的影响。【结果】重组Lenti-CXCR4-siRNA慢病毒转染SW480细胞可见绿色荧光。SW480、阴性对照组及Lenti-CXCR4-siRNA慢病毒组CXCR4 RNA表达水平分别为0.54±0.06、1.00±0.03和0.11±0.04(P=0.001);CXCR4蛋白相对表达量分别为0.60±0.03、0.72±0.03和0.18±0.02(P<0.001);MTS OD值分别为1.38±0.04(P=0.005)、1.28±0.05(P=0.026)和0.92±0.06;迁移实验细胞数分别为32.0±6.8、32.6±1.7和0.75±0.71(P<0.001);侵袭实验细胞数分别为29.1±10.3、30.4±6.1和0.63±0.74(P<0.001)。【结论】重组Lenti-CXCR4-siRNA慢病毒可高效抑制SW480细胞CXCR4 RNA和蛋白表达水平,遏制细胞增殖,降低肿瘤细胞迁移和侵袭能力。     

慢病毒介导的shRNA靶向干扰nestin鼻咽癌稳定细胞株的建立

摘要：目的检测nestin基因在8种鼻咽癌细胞中的表达差异,寻找高表达的细胞株。构建nestin基因的shRNA表达载体,
建立nestin稳定干扰的鼻咽癌细胞株。方法应用Real-time PCR和免疫荧光技术检测nestin在鼻咽癌细胞株中的表达水
平。构建带GFP的重组靶向nestin shRNA慢病毒表达质粒,筛选阳性克隆,测序鉴定。293T细胞包装病毒,收集病毒上
清,测定滴度。经Real-time PCR内源筛靶,选择最佳靶点。将重组慢病毒感染5-8F细胞,Western blotting 和Real-time
PCR检测nestin的表达。结果在8种鼻咽癌细胞株中,5-8F细胞中nestin表达较高。PCR和测序验证重组质粒构建成
功。慢病毒感染5-8F细胞后,与阴性对照组和空白组相比,nestin的mRNA和蛋白水平明显受到抑制。结论成功构建了
干扰nestin的慢病毒重组质粒,并建立了稳定靶向干扰nestin表达的5-8F鼻咽癌细胞株。
     

人甘油激酶慢病毒干涉载体的构建和表达

目的构建人甘油激酶(GK)基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,获得稳定下调GK表达的慢病毒。方法将具有干涉效果的siRNA序列克隆入慢病毒核心质粒pSicoR中,并转染293T细胞进行病毒包装,用慢病毒感染293T细胞并应用FACS测定病毒滴度。以GK干涉慢病毒感染人肝细胞系L02细胞后,应用Western blotting方法检测GK的表达。结果成功构建GK干涉慢病毒pSicoR-GK载体并获得慢病毒颗粒,病毒滴度检测可达3×107pfu/ml,GK蛋白质表达水平下调至对照的约20%。结论成功构建人GK基因RNAi慢病毒,为后续GK生物学功能研究奠定基础。     

核糖体蛋白S3a RNA干扰重组慢病毒载体的构建及其对细胞凋亡的影响

目的 构建表达小鼠核糖体蛋白S3a 特异性RNA干扰重组慢病毒载体(Lenti-shmRPS3a),分析其对细胞凋亡的影响。方法 设计针对小鼠RPS3a mRNA 4条干扰序列,合成相应的发夹序列,连接入慢病毒载体系统 pLLU2G-eGFP中构建重组质粒,将重组质粒与辅助包装质粒共转染293T细胞组装病毒,检测病毒滴度。病毒感染RAW264.7细胞后,RT-PCR和Western blot检测干扰效果,流式细胞术分析其对凋亡的影响。结果 PCR和测序证明成功构建出Lenti-shmRPS3a慢病毒载体,病毒滴度为6-9×10₇TU/ml;RT-PCR表明Lenti-shmRPS3a的沉默效率高达72.64%、Western Blot证明RPS3a蛋白水平表达降低;流式细胞术证明感染了Lenti-shmRPS3a慢病毒载体的细胞凋亡率较对照组明显升高。结论 表达小鼠核糖体蛋白S3a shRNA慢病毒载体能有效沉默RPS3a基因表达,促进细胞凋亡。     

β-catenin慢病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

【目的】构建β—catenin慢病毒载体,转染骨髓间充质干细胞并予以鉴定。【方法】β—catenin曼病毒载体转染骨髓间充质干细胞,在倒置荧光显微镜下观察转染效率,并进行RNA提取及PCR扩增,检测目的基因表达情况,进行CCK—8实验检测转染后细胞的增殖活性。【结果】当感染复数为25时,感染后96 h观察干细胞的感染效率大约为80%。PCR检测到β—eatenin的mRNA在骨髓间充质干细胞中过表达。慢病毒对细胞的增殖有一定的抑制作用,但β—catenin对细胞增殖有促进作用。【结论】β—catenin慢病毒载体成功转染大鼠骨髓间充质干细胞,为进一步研究β—catenin在MSCs中的作用奠定了基础。     

干扰ADAM17表达可降低人结肠癌细胞对西妥昔单抗耐药

目的研究ADAM17的表达与结肠癌SW480细胞对西妥昔单抗耐药相关性。方法通过Western blot法检测结肠癌细胞 系ADAM17的表达情况,筛选出高表达ADAM17的结肠癌细胞株做为目标细胞株;采用siRNA片段干扰结肠癌细胞ADAM17 的表达,Western blot验证干扰效果;100 μg/mL的西妥昔单抗处理细胞24 h后,FITC/PI染色,流式细胞仪检测细胞凋亡情况; Transwell实验检测ADAM17不同表达状态下的结肠癌细胞的迁移能力;运用Western blot法,检测在ADAM17不同表达状态 下的结肠癌细胞EGFR、AKT的磷酸化水平。结果人结肠癌SW480 细胞株中ADAM17 表达较高（P<0.05）。siRNA-1 和 siRNA-2干扰片段可显著降低SW480株ADAM17表达（P<0.05）。ADAM17表达被干扰后的SW480细胞对西妥昔单抗敏感性 显著上升（P<0.05）。干扰ADAM17 表达后,在西妥昔单抗药物作用下SW480 细胞迁移能力显著降低（P<0.05）。干扰了 ADAM17 表达后,SW480 细胞实验组的p-EGFR、p-AKT较对照组组显著降低（P<0.001）。结论干扰ADAM17 表达可抑制 EGFR-AKT通路激活从而减少人结肠癌SW480细胞对西妥昔单抗耐药。     

苦参碱对胰腺癌PC-3细胞凋亡及Bcl-2和bax表达的影响

目的探讨苦参碱对人胰腺癌PC-3细胞增殖和凋亡及凋亡相关基因Bcl-2和bax的影响,为苦参碱在抗肿瘤临床应用提供理论基础。方法应用MTT法检测苦参碱对人胰腺癌PC-3细胞增殖的影响,流式细胞仪检测苦参碱对PC-3细胞凋亡的影响,RT-PCR检测苦参碱对PC-3细胞Bcl-2和bax表达的影响。结果 MTT结果显示苦参碱对PC-3细胞的生长抑制作用呈现明显的浓度依赖性和时间依赖性（P〈0.01）。苦参碱能诱导PC-3细胞凋亡（P〈0.01）。苦参碱能明显的抑制PC-3细胞Bcl-2基因mRNA的表达;诱导bax基因mRNA的表达（P〈0.01）。结论苦参碱呈现浓度依赖性和时间依赖性抑制PC-3细胞的生长,诱导细胞凋亡,其作用与抑制PC-3细胞Bcl-2和bax基因mRNA的表达密切相关。     

人CDH22基因RNAi慢病毒载体的构建及稳定干扰CDH22基因的表达

目的 构建人CDH22基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,有效沉默大肠癌细胞的CDH22基因表达,为研究CDH22在大肠癌转移中参与的信号转导机制提供研究基础.方法 利用在线软件设计人CDH22基因shRNA序列,合成、退火形成双链寡核酸后克隆到pENTRTM/U6载体的黏性末端,测序.得到的阳性重组子再与慢病毒载体进行重组,获得真核表达慢病毒干扰载体.在脂质体的介导下将慢病毒包装辅助质粒和CDH22基因重组慢病毒载体导入293FT细胞包装病毒,测定病毒滴度,感染大肠癌细胞SW480,杀稻瘟菌素筛选获得稳定干扰CDH22基因的细胞亚系.结果 成功构建CDH22真核表达慢病毒干扰载体并获得相应的慢病毒,病毒滴度为8×105U/ml.荧光定量PCR结果表明,所获得的细胞克隆11中CDH22 mRNA水平的表达显著降低.结论 成功构建出CDH22基因慢病毒RNAi表达载体,并获得CDH22基因稳定干扰的大肠癌细胞亚系,为研究CDH22在大肠癌转移中的作用机制提供了研究基础.     

AQP-5对结直肠癌细胞生长的影响及机制

目的 探讨水通道蛋白-5(AQP-5)对细胞增殖及凋亡影响及可能的机制.方法 体外常规培养人结直肠癌COLO 205和SW480细胞,取对数生长期的细胞用于实验.通过siRNA技术抑制内源性AQP-5的表达,并经免疫荧光、PCR检测AQP-5-siRNA转染效率,利用MTT法检测细胞增殖能力,Annexin V-FITC/PI和TUNEL检测细胞凋亡情况,RT-PCR和Western blot检测Bax、Bcl-2表达变化.结果 在COLO 205和SW480细胞株中,转染AQP-5-siRNA后AQP-5表达下调达90%.MTT分析结果显示,与转染NS-siRNA组相比,转染AQP-5-siRNA组的细胞增殖抑制率显著增加(P<0.05);流式细胞分析结果发现,与NS-siRNA组细胞相比,转染AQP-5-siRNA后细胞凋亡率显著增加(P<0.05);荧光实时定量RT-PCR和蛋白质印迹法检测结果显示:与转染NS-siRNA组相比,转染AQP-5-siRNA明显提升Bax/Bcl-2 mRNA和蛋白的表达.结论 AQP-5-siRNA可体外促进结直肠癌细胞凋亡,其机制可能与Bax/Bcl表达有关.     

PRL-3基因RNA干扰慢病毒载体的构建及在SW480细胞中的表达

目的 构建PRL-3基因慢病毒干扰载体及建立PRL-3基因稳定干扰的结直肠癌细胞亚系.为PRb-3基因功能研究奠定基础.方法 设计PRL-3基因特异性RNAi靶序列,与pENTRTM/U6线性载体定向连接,构建pENTRTM/U6真核入门表达载体.通过与pENTRTM/U6 entry clone与pLenti6/BLOCK-iTTM-DEST载体进行重组,获得pLenti6/BLOCK-iTTM-DEST真核表达慢病毒干扰载体.利用包装细胞293FT获得重组的慢病毒,感染大肠癌细胞株SW480细胞,杀稻瘟菌素筛选获得稳定干扰PRL-3基因的细胞亚系.结果 成功构建PRL-3 pLenti6/BLOCK-iTTM-DEST真核表达慢病毒干扰载体并获得相应的慢病毒,病毒悬液的滴度为6×105U/L.RT-PCR、Western blotting结果 表明,克隆1 PRL-3mRNA及蛋白显著降低.结论 成功构建人PRL-3基因特异性的慢病毒干扰载体,获得PRL-3基因稳定干扰的大肠癌细胞亚系.     

3种不同survivin基因启动子驱动Apoptin表达的重组慢病毒构建及体外抑瘤效果比较

目的构建3种不同长度的survivin基因启动子融合6×his标签Apoptin cDNA的重组慢病毒载体,经鉴定后行慢病毒包装并感染人结直肠癌细胞(SW480),体外实验观察并比较抑瘤效果。方法克隆3种不同长度的人survivin基因启动子(160、270、987 bp)和Apoptin-6×his cDNA,将其分别连接到pMD18-T载体并在该载体上完成survivin基因启动子和Apoptin基因组装。将组装好的表达盒构建入polyA改造后的慢病毒载体FG12中,利用三质粒包装系统包装成慢病毒。为观察重组慢病毒的抑瘤效果,以最适MOI值感染SW480肿瘤细胞后第5天及第30天,利用AnnexinV-PE/7-AAD凋亡试剂盒和流式细胞术检测细胞凋亡和周期变化,Western blot检测Apoptin-6×his表达。结果成功构建3种重组慢病毒载体,经包装浓缩后获得高滴度病毒,可以有效地感染目的细胞(感染效率大于80%)。体外结果提示病毒感染的SW480可以正确表达Apoptin-6×his蛋白,并能在感染后第30天出现明显的凋亡/坏死。其中,含有270 bp启动子的慢病毒抑瘤作用更为明显。结论采用270 bp survivin启动子,apoptin基因构建的重组慢病毒在靶细胞中显示出较好的抑瘤效果。