基于多能干细胞的Alport综合征的microRNA差异性表达与碱基编辑功能分析

目的 分析Alport综合征(AS)的诱导多能干细胞(iPSCs)全基因微小核糖核酸(microRNA)的表达谱,筛选出具有差异性表达的microRNA与发生碱基突变的microRNA.方法 收集1例AS患者与1例健康人的尿液,从尿液中分离尿肾脏管细胞,尿肾脏管细胞分化诱导成iPSCs.运用高通量测序方法对iPSCs的microRNA进行测序与表达量测定,比较分析两人microRNA的表达差异,寻找具有特异性的microRNA靶点.同时,将mi-croRNA序列与miRBase数据库(http://www.mirbase.org/)中已知成熟microRNA序列进行比对,比较两标本mi-croRNA碱基编辑数量,找出发生了碱基突变的microRNA.结果 在两人标本中发现30个microRNA具有显著的差异性表达,其中19个microRNAs表达上调,11个microRNA表达下调.has-miR-3117-3p的倍比值(log2 Ratio)为7.79,在表达上调的microRNA最具有特异性;has-miR-544b的倍比值为-9.09,在表达下调的microRNA最具有特异性.同时在两标本中共有208个microRNA发生了碱基突变,其中104个microRNA,AS患者发生碱基编辑概率比健康人大;77个microRNA,健康人发生碱基编辑概率比AS患者大.结论 AS患者与健康人肾脏组织中的microRNA存在差异性,AS发生碱基编辑引起基因突变的microRNA比健康人更常见.这些差异性表达的microRNAs与microRNA碱基突变的概率可能在AS发病机制中起重要作用.     

特发性膜性肾病的治疗观察

膜性肾病是成人肾病综合征中最为常见的病理类型之一[1] 。其典型的病理特点为上皮下免疫复合物沉积而致毛细血管基底膜增厚 ,约 2 0 %～ 2 5 %。膜性肾病可由继发性因素引起 ,治疗其原发病或去除致病因素后可缓解。本文前瞻性观察了本院经肾活检确诊 ,并长期治疗随访的特发性膜性肾病患者的预后 ,发现对Ⅱ期效果较好 ,现报告如下。1　对象与方法1.1　病例选择本院自 1997年 12月～ 2 0 0 0年 12月经肾脏病理学诊断为特发性膜性肾病者 18例。所有患者均符合以下条件 :(1)光镜下可见肾小球基底膜不同程度的增厚 ,伴 /不伴钉突的形成 ;(2 )排…     

特发性膜性肾病的治疗

特发性膜性肾病（IMN）是成人原发性肾小球疾病的常见病理类型之一。典型病理特征为上皮下免疫复合物沉积致毛细血管基底膜增厚。目前IMN的治疗颇有争议,本文对其治疗现状做一综述。1特发性膜性肾病的临床特点膜性肾病（MN）临床上主要表现为肾病综合征或大量蛋白尿,70%-80%呈肾病程度蛋白尿,5%-10%伴有肾功能不全,高血压及血尿发生率较少。MN常见于成人,约占成人肾病综合征的33%,儿童患者少见。     

特发性膜性肾病的诊治进展

<正>特发性膜性肾病(idiopathic membranous nephropathy,IMN)是成年人肾病综合征常见的致病因素,占成人肾病综合征(neprotic syndrome,NS)的25%～40%,在我国约占原发性肾小球疾病的10%,是国内外NS主要的病理类型之一,约占膜性肾病(membranous nephropathy,MN)的66%。IMN主要的病理特征是肾小球脏层上皮细胞下免疫复合物沉积,后期出现肾小球基底膜弥漫增厚,上     

不典型膜性肾病与特发性膜性肾病的临床特征与病理改变比较

目的比较不典型膜性肾病（AMN）与特发性膜性肾病（IMN）的临床特征与病理改变,以助于鉴别诊断。方法选取临床资料完整、初发初治AMN患者79例（AMN组）,IMN患者134例（IMN组）。比较两组患者一般资料及临床表现、实验室检查结果、肾脏病理学检查结果。结果与IMN组比较,AMN组患者年龄较小、肾病综合征发生率较高（均P＜0.05）。两组患者性别、体重、BMI及高血压、急性肾损伤、血栓和栓塞发生率比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。与IMN组比较,AMN组患者尿RBC、24h尿蛋白定量、尿NAG、血清D-二聚体较高,血清白蛋白较低（均P＜0.05）。两组患者血清TC、TG、血尿酸、Cr、ANA阳性率、HBsAg阳性率、HBeAg阳性率、IgG、IgA、IgM、C3、C4、CRP、eGFR比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。两组患者肾小球硬化比例比较差异无统计学意义（P＞0.05）,但AMN组患者肾小管间质急性、慢性病变均较重（均P＜0.05）。AMN组患者肾组织IgA、IgM、C4、C1q、IgG1、IgG2、IgG3阳性率均高于IMN组（均P＜0.05）,IgG4、PLA2R阳性率均低于IMN组（均P＜0.05）。AMN患者在系膜区、基底膜部位比IMN患者更易出现电子致密物沉积（P＜0.05）。结论AMN患者在临床特征和病理改变上均与IMN存在差异,提示AMN的发病机制及疾病预后可能不同于IMN。     

特发性膜性肾病的中医治疗进展

综述特发性膜性肾病的中医治疗概况,从两个方面论述,辨证论治和单方、单药的用法.对于特发性膜性肾病的中医治疗临床研究仍停留在初级阶段.     

特发性膜性肾病的治疗进展

特发性膜性肾病的治疗措施一直存在争议,近年来免疫抑制剂及钙调磷酸酶阻滞剂类药物备受关注并取得了一定进展,另外随着对该病发病机制研究的进展,一些针对病因治疗的非免疫抑制剂药物也越来越受到关注。2011年颁布的改善全球肾脏病预后组织临床实践指南是在归纳并总结多年循证医学证据基础上得出的,对临床治疗特发性膜性肾病方案的选择具有指导意义。     

特发性膜性肾病的免疫治疗进展

特发性膜性肾病(IMN)是一种病因不明的自身免疫性疾病,其发病机制及临床干预方案一直是国内外学者研究的重点,针对IMN的各类免疫治疗方案在提高临床疗效和减少不良反应方面有很大优势.本文就IMN的免疫治疗进展作一述评.     

Illumina高通量测序分析人结肠恶变组织黏膜菌群变化

目的分析结肠腺瘤及腺癌患者的正常组织和恶变组织黏膜菌群特征,试图寻找癌变过程中黏膜菌群变化趋势。方法研究对象为广东医学院附属南山医院消化内科就诊的5例腺瘤和2例腺癌患者,肠镜下取微量的结肠黏膜组织,每例患者收集病变组织和病变旁5~10 cm处的正常组织,用试剂盒提取基因组DNA,PCR扩增16S r RNAV3~V4区,对PCR产物进行二代Illumina高通量测序,通过COPE软件分析和统计样品序列数目,在0.97相似度下利用QIIME(v1.8.0)软件将序列聚类为用于物种分类的OTUs(Operational taxonomic units),进一步分析结肠正常组织和恶变组织的黏膜菌群物种丰度及结构组成特点。结果 14个样本共得到3 306个OTUs,测序深度不一;腺癌患者结肠正常组织黏膜菌群多样性指数高于恶变组织,腺瘤患者的两组指数比较没有一致规律。14个样本的共有菌门为6个,7例患者的黏膜菌群均以厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)以及变形菌门(Proteobacteria)为主,在2例腺癌患者恶变组织的黏膜菌群中,梭杆菌门(Fusobacteria)比正常组织显著增多,占30%以上,成为了优势菌门,而在5例腺瘤患者的两组黏膜菌群比较中均没有此现象。在纲和属的分类水平上,梭杆菌纲(Fusobacteriia)和梭杆菌属(Fusobacterium)仍然在腺癌患者恶变组织和正常组织中存在显著性差异,均明显增多且成为黏膜定植的优势菌。结论腺瘤到腺癌演变过程中,黏膜定植菌群的多样性变化未出现明显趋势,但根据梭杆菌的变化特点推测其可能是因癌症发生发展导致了数量的增多,而并非是结肠癌发生的病原学因子。     

基于16s rRNA高通量测序分析糖尿病足骨髓炎感染骨组织中的病原微生物

目的 利用16s rRNA高通量测序技术分析糖尿病足骨髓炎(DFO)感染骨组织中病原微生物特点,为临床感染病原菌的鉴定及治疗提供快速、准确的方法.方法 收取2016年9月~2017年4月于本科室住院的16例DFO患者清创术中获取的感染骨标本,分别利用16s rRNA高通量测序技术和血培养分析仪进行病原微生物的鉴定,分析16s rRNA测序结果中DFO的菌群特点,并与培养结果相比较.结果 16s rRNA测序显示DFO骨组织病原微生物多样性较大,分布较为均匀,共获得优势菌属20种,占所有菌属的87.00%,其中Prevotella是丰度最大的菌属.两种鉴定方法结果均显示DFO病原菌以革兰氏阴性菌为主.与培养法相比,16s rRNA测序阳性率较高(100%vs 88.24%),平均每个样本病原菌数较多(12.56 vs 1.50),革兰氏阴性菌所占的比例较高(67.16%vs 50.00%).此外,16s rRNA测序结果覆盖了除Escherichia coli、Serratia marcescens及Enterobacter cloaca外的所有培养病原菌结果,甚至有高达13种菌属不存在于培养结果,其中Anaerococcus、Veillonella、Bacteroides、Fusobacterium、Porphyromonas、Finegoldia、Prevotella、Peptostreptococcus、Parvimonas、Peptoniphilus和Bulleidia均为专性厌氧菌或严格厌氧菌,而培养结果中并无厌氧菌的出现.但培养结果显示,DFO中多重耐药菌的比例高达58.33%.结论 16s rRNA高通量测序能较好展示DFO骨组织中菌群微生态的多样性及丰度特点.DFO骨组织病原微生物多样性大,分布均匀,但优势菌属分布离散,以革兰氏阴性菌为主.与培养法相比,16s rRNA测序对病原菌的鉴定简单而准确,尤其在对革兰氏阴性菌和厌氧菌鉴定方面有显著的优势,可快速而准确地指导DFO感染治疗.     

食管癌中microRNA表达的研究进展

microRNA是一类小的非编码蛋白质的RNA,17～25个核苷酸长度,在物种进化中相当保守,其功能通过与靶基因mRNA的3′-UTR配对起负调控基因表达作用,从而调节细胞的代谢、增殖、分化和凋亡等过程.目前认为microRNA在食管癌的发生、发展过程中,起到与癌基因或抗癌基因相似的作用.本文对microRNA功能、microRNA表达与食管癌的关系,以及研究microRNA表达的研究方法等进行综述.     

高通量测序筛选结核分枝杆菌耐药株差异基因

目的比较结核分枝杆菌中敏感株、多耐药株、广泛耐药株三者间基因表达的差异,为进一步针对耐药菌株的研究提供方向。方法从深圳市第三人民医院收集敏感株、多耐药株、广泛耐药株各1株,提取菌株RNA,然后构建cDNA文库,使用Genome Analyzer IIx高通量测序仪进行全基因组测序,经过筛选比对后得到测序结果 ,再比较3个菌株间的基因表达差异。结果高通量测序后共得到基因3 968个。将耐药株与敏感株的基因进行比较,选取表达差异高于10倍的基因,筛选得到多耐药株差异基因16个、广泛耐药株差异基因10个。这些表达差异基因大部分与毒素-抗毒素系统、PE/PPE家族蛋白、金属转运蛋白相关。还在多耐药株中发现了一系列高表达的前噬菌体基因及噬菌体整合相关的基因。结论通过高通量测序筛选得到一系列耐药株差异表达基因,为未来对耐药菌株的研究提供依据。     

高通量基因测序对血清学筛查临界风险孕妇的应用价值

目的：探讨对于血清学筛查临界风险的孕妇应用高通量基因测序价值。方法选择2012年5月至2015年5月在常州市妇幼保健院产前诊断中心就诊的1066例血清学筛查临界风险的孕妇,在知情同意的原则下抽取孕妇外周血,提取血浆中胎儿游离DNA ,制备文库,采用Illumina NextSeq500测序平台对其进行测序分析,对测序提示的染色体异常患者行羊膜腔穿刺,羊水细胞培养后染色体G显带核型分析。结果1066例样本中,高通量基因测序提示15例染色体非整倍体异常,经知情同意,13例孕妇自愿接受羊水产前诊断,其中7例羊水G带核型结果与测序结果一致,包括4例21三体,1例18三体,1例47,XXX ,1例47,XXY ,其余6例G带核型正常。结论高通量基因测序可作为血清学筛查临界风险孕妇的有效补充检测手段。     

唐氏综合征胎儿21号染色体上新微小RNA基因的鉴定和功能分析

目的：利用Solexa高通量深度测序技术鉴定21号染色体上新的微小RNA(miRNA)基因,为阐明21号染色体功能、探索唐氏综合征(DS)患者新的治疗靶点提供依据。方法：收集5例经染色体核型分析诊断为DS胎儿的脐带血和3例正常胎儿脐带血,分析染色体核型;提取胎儿脐带血单个核细胞总RNA,构建小RNA文库,采用Solexa高通量深度测序、计算机分析、Stem-loop RT-PCR法鉴定 miRNA基因并分析其生物学功能。结果:血染色体核型分析,5例DS胎儿脐带血显示DS标准核型,3例正常胎儿脐带血显示正常核型;在DS胎儿脐带血中共发现21个新miRNA,其中仅1个候选miRNA来源于21号染色体,位于21号染色体的“DS关键区域”,命名为“miR-nov21”,后者在DS胎儿脐带血单个核细胞中表达水平高于正常胎儿。生物学功能分析,miR-nov21可调节211个靶基因共215个位点,与基因的表达、细胞分化的调节、胚胎形态的发生和心脏的发育有关。结论: 21号染色体“DS关键区域”存在1个新的miRNA基因--miR-nov21。     

一种高通量自动化血浆miRNA文库构建方法及其跨批次性能评估

 目的 建立一种适用于低起始量血浆样本的高通量(96样本/批次)、自动化miRNA文库构建方法,并系统评估该方法的可靠性与跨批次一致性。方法 基于PerkinElmer公司的NEXTFLEX^? small RNA-seq试剂盒和Sciclone^? NGSx液体工作站,建立自动化miRNA文库构建方法。制备3类血浆参考物质(分别来自健康男性、健康女性和糖尿病患者)模拟临床血浆样本,并使用自动化建库方法进行4个批次文库构建实验。从miRNA检出种类、绝对定量、不同样本间相对定量及差异表达分析等层面评估方法性能及跨批次一致性。结果 miRNA检出种类一致性：批次内和批次间并交比(Jaccard index)分别为0.61和0.62;miRNA表达水平绝对定量一致性：批次内和批次间Pearson相关系数平均值均为0.96;两个不同样本间相对定量水平在不同批次间的相关系数平均值为0.74,且超过60%的差异表达miRNA可在多个批次中检出。结论 本研究建立了一种高通量自动化血浆miRNA文库构建方法,具有良好的批次内性能和跨批次一致性,可用于大型队列血浆miRNA文库构建实验。     

多重PCR靶向富集结合高通量测序筛查结直肠癌中MMR基因的突变

 目的  探讨多重PCR靶向富集结合高通量测序技术在结直肠癌 (colorectal cancer,CRC)中检测错配修复 (mismatch repair,MMR)基因种系突变的应用。方法  收集17例CRC患者和14例正常人的血液并提取基因组DNA;设计和优化寡聚核苷酸探针,使其能对5个基因MLHl、MSH2、PMS1、PMS2和MSH6的73个外显子序列进行有效的PCR扩增和富集;应用多重PCR技术靶向富集样本MMR基因的外显子序列;扩增产物进行文库构建和高通量测序,检测MLHl、MSH2、PMS1、PMS2和MSH6基因的突变情况。结果  31个样本共得到2.7Gb的数据,平均reads数为287 048,测序数据中平均82.18%可与参考序列进行比对,外显子序列平均覆盖度为99.9%,平均测序深度为2 282。在MMR基因的外显子区域共发现13种非同义单核苷酸变异 (single nucleotide variation,SNV)、2种同义 SNV,其中MSH6的c.G3205C:p.G1069R为未见报道SNV。检测结果经Sanger法测序验证,结果一致。结论  多重PCR靶向富集结合高通量测序技术是一套通量高、速度快、费用低、准确性高的MMR基因突变筛查方法。     

小鼠肝脏特异的微RNA真核表达载体的构建及鉴定

目的利用分子克隆技术,构建微RNA(microRNA,miRNA)真核细胞载体.方法人工合成小鼠肝脏特异的微RNA(miR-122)前体基因序列,并添加酶切位点及polyT转录终止序列,经退火处理后形成双链结构,插入小干涉RNA(small interfering RNA,siRNA)表达载体pAVU6 27中,经酶切鉴定和测序证实后,构建成为miR-122真核表达载体(pAVU6 27-mir122).结果合成的基因序列完全正确并成功克隆到真核表达载体pAVU6 27上.结论 miR-122真核表达载体的构建,为进行真核细胞转染及miR-122表达的研究奠定了基础.