pEGFP-N1-Mxi1-0重组质粒的构建与表达

目的:构建Max作用蛋白1-0(Max interacting protein1-0,Mxi1-0) 的真核表达载体,在小鼠胚胎成纤维细胞(NIH/3T3)中表达,以期为深入研究Mxi1-0的作用及机制奠定基础。方法:通过RT-PCR方法从人肿瘤细胞HepG2中获得Mxi1-0基因的编码片段,连接至增强绿色荧光蛋白真核表达载体(pEGFP-N1)构建成pEGFP-N1-Mxi1-0。经酶切和测序鉴定重组质粒的正确性;采用脂质体转染技术将重组质粒瞬时转染NIH/3T3细胞,经荧光显微镜观察和Western blot方法检测Mxi1-0表达,免疫荧光法检测Mxi1-0在NIH/3T3细胞内的定位情况。结果:经双酶切和核酸序列测序鉴定证实含Mxi1-0的重组真核表达载体pEGFP-Mxi1-0构建成功。重组质粒瞬时转染NIH/3T3细胞后,检测到Mxi1-0的成功表达,并证实Mxi1-0主要定位于NIH/3T3细胞质中。结论:成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-Mxi1-0,并检测到Mxi1-0的表达,实验证明Mxi1-0定位于NIH/3T3细胞质中。     

Limk1不同突变体HA融合表达载体构建及在细胞内定位

目的：构建LIM激酶（Limk）1不同突变体的HA融合表达载体,并在真核细胞中表达,观察这些突变体在细胞内定位.方法：利用聚合酶链式反应（PCR）扩增Limk1全长序列,构建HA-Limk1真核表达质粒;利用定点突变策略对HA-Limk1进行核定位信号（NLS）缺失突变,命名为Limk1-NLS（del）;用合成两条互补序列退火获得目标片段插入载体的策略构建Limk1-NLS;将2表达质粒转染HepG2细胞,细胞免疫荧光方法以及核质分离后用western-blot检测其在细胞中定位.结果：经测序鉴定Limk1及其不同突变体序列正确,在HepG2细胞中高表达;其中HA-Limk1在细胞质、细胞核均有表达,Limk1-NLS （del）主要定位于细胞质,Limk1-NLS主要定位于细胞核.结论：成功构建了Limk1全长及不同突变体的HA融合表达载体,初步明确突变体在细胞内的定位.     

MK2不同突变体的构建、表达及细胞内定位的研究

目的:为了研究MAPK激活蛋白激酶2 (MAPK-activated protein kinase 2, MK2)细胞内定位与其功能的关系,构建了MK2不同突变体的绿色荧光蛋白融合表达载体并观察这些突变体在细胞内的定位情况. 方法:将克隆在绿色荧光蛋白载体pEGFP-C2上的野生型MK2(WT)通过定点突变技术构建其无活性突变体MK2(320A)和活性突变体MK2(320E),转染NIH3T3细胞,并在荧光显微镜下观察其细胞内定位情况.结果:各种MK2不同突变体经测序鉴定正确后,在NIH3T3细胞中得到高量表达.融合蛋白发出的绿色荧光表明,在静息状态下,MK2(WT)主要分布于细胞核内,MK2(320E)主要分布于细胞质内,而MK2(320A)在细胞核和细胞质中都有分布.在受到紫外线(UV)刺激后,MK2(WT)和MK2(320A)移位出核,而MK2(320E)的细胞内定位则没有发生明显的改变.结论:成功构建了绿色荧光蛋白标记的MK2不同突变体并在真核细胞中进行了表达,观察到不同突变体对MK2细胞内定位的影响.     

PRAK不同突变体的构建、表达及细胞内定位的研究

目的:构建p38调节/激活蛋白激酶(PRAK)不同突变体的绿色荧光蛋白融合表达载体,并在真核细胞中表达后,观察这些突变体在细胞内的定位情况.方法:将克隆在绿色荧光蛋白载体pEGFP-C2上的野生型PRAK通过定点突变技术构建其无活性突变体PRAK(T182A)、活性突变体PRAK(T182D)、无激酶活性突变体PRAK(KM)、核定位信号缺失突变体PRAK(NLSm)及核输出信号缺失突变体PRAK(NESm),随后转染NIH3T3细胞,并在荧光显微镜下观察其表达和细胞内定位情况.结果:经测序鉴定各种PRAK不同突变体正确无误后,在NIH3T3细胞中得到高量表达;融合蛋白发出的绿色荧光表明,在静息状态下,野生型PRAK(WT)、PRAK(182A)、PRAK(182D)、PRAK(KM)和PRAK(NESm)主要分布于细胞核内,而PRAK(NLSm)在细胞中均匀分布;在受到NaAsO2刺激后,PRAK(WT)和PRAK(KM)移位出核,而PRAK(182A)、PRAK(182D)和PRAK(NESm)失去了移位出核的能力,PRAK(NLSm)则与刺激前无明显差异.结论:成功构建了PRAK不同突变体的绿色荧光蛋白融合表达载体并在真核细胞中进行了表达,且不同的突变体能够影响PRAK的细胞内定位.     

α1-抗胰蛋白酶真核表达载体的构建及其细胞内定位

目的 构建鼠α1-抗胰蛋白酶(AAT)的真核表达载体,观察其在NIH 3T3细胞中的表达及定位情况.方法 提取BALB/c小鼠肝脏组织的总RNA,通过RT-PCR扩增得到AAT编码序列.然后将该编码序列克隆到带有血凝素(HA)标记的载体pcDNA3-HA上,随后转染NIH 3T3细胞,在荧光显微镜下观察结果.结果 重组质粒经PCR、酶切和测序鉴定证明构建正确.转染实验发现,该质粒能够在NIH 3T3细胞中表达,表达产物主要定位在细胞质中.结论 成功构建带HA标签的AAT真核表达载体.该载体能在哺乳动物细胞中有效表达并正确定位,为下一步深入研究AAT在细胞内的相关生物学功能提供了一个重要工具.     

阴道毛滴虫Rab1a重组蛋白的表达和细胞内定位

目的制备阴道毛滴虫(Trichomonasvaginalis,Tv)Rab1a重组蛋白及其多克隆抗体,并对TvRab1a蛋白进行阴道毛滴虫的细胞内定位。方法将我们已构建的pQE80L/TvRab1a重组表达质粒转入大肠埃希菌E.coliM15,在IPTG诱导下表达重组蛋白,经Ni-NTA亲和柱层析后获得纯度较高的TvRab1a的重组蛋白;用经复性处理的重组蛋白免疫动物,获得TvRab1a重组蛋白抗血清,免疫印迹WesternBlot鉴定抗血清。采用荧光免疫细胞化学对TvRab1a蛋白进行细胞内定位。结果WesternBlot分析显示,TvRab1a重组蛋白可与豚鼠的抗TvRab1a血清反应,同时该抗血清在滴虫提取蛋白中检测到与预测TvRab1a分子量一致的条带;免疫荧光化学检测发现TvRab1a分布于细胞核周围的高尔基复合体与内质网。结论获得的抗TvRab1a蛋白的多抗血清可用于TvRab1a基因功能的研究;TvRab1a功能场所位于高尔基复合体与内质网。     

与乳腺癌细胞共培养的人成纤维细胞特异蛋白-1表达上调及意义

目的探索乳腺癌间质成纤维细胞对乳腺癌作用的分子机制,研究与人乳腺癌细胞共培养的人成纤维细胞特异蛋白-l(fibroblast-specific protein-1,FSP-l)的表达及对乳腺癌生长的影响。方法 Transwell方法共培养人乳腺癌细胞株MDA-MB-231和人成纤维细胞株ESF;实时RT-qPCR检测共培养的MDA-MB-231和ESF细胞FSP-1mRNA水平;免疫荧光流式细胞仪检测共培养MDA-MB-231和ESF细胞FSP-1蛋白表达水平;Cell Counting Kit-8(CCK-8)检测MDA-MB-231细胞的增殖;免疫荧光激光共聚焦显微镜观察荷瘤裸鼠乳腺癌组织FSP-1的表达,检测FSP-1对荷瘤裸鼠肿瘤体积的影响。结果 MDA-MB-231细胞和ESF细胞共培养可上调ESF细胞表达FSP-1并促进MDA-MB-231细胞增殖;ESF+MDA-MB-231组MDA-MB-231细胞表达FSP-1,但在MDA-MB-231组未检测到FSP-1蛋白表达;荷瘤裸鼠MDA-MB-231细胞和ESF细胞共生长的癌组织高表达FSP-1并促进肿瘤生长。结论与人乳腺癌细胞共培养可上调人成纤维细胞FSP-1的表达并促进乳腺癌生长。     

补体成分 C3及其缺失突变体蛋白的表达及与 CLIC1蛋白共定位的研究

目的：研究补体成分 C3及其缺失突变体 C3（1-840）、C3（824-1663）在真核细胞内的表达及与氯离子通道蛋白（CLIC1）的共定位。方法构建 pcDNA3．1-C3-FLAG、pcDNA3．1-C3（1-840）-FLAG、pcDNA3．1-C3（824-1663）-FLAG 三个真核表达质粒（缺失突变体根据 C3的结构域及其裂解断裂位置设计）,并分别转染至 HEK 293T 细胞中, Western blot 检测表达情况;上述质粒分别瞬时单转至 COS7细胞和分别与 GFP-CLIC1共转至 COS7细胞内,观察共定位情况。结果成功构建带 FLAG 标签的 C3基因及其两个缺失突变体[C3（1-840）、C3（824-1663）]的真核表达载体, Western blot 结果显示它们在 HEK 293T 细胞中均能成功表达;免疫荧光显示它们在 COS7细胞中均主要分布于细胞质,且三个真核表达载体中只有 C3（824-1663）与 CLIC1有共定位。结论补体 C3及其缺失突变体 C3（1-840）和 C3（824-1663）在 HEK 293T、COS7细胞中均能高效表达,且主要分布在细胞质内,C3（824-1663）与 CLIC1蛋白有共定位。     

Max作用蛋白1⁃0在氧糖剥夺诱导SH⁃SY5Y细胞凋亡中的作用

目的：探讨Max作用蛋白1?0（max action protein 1?0,Mxi1?0）在氧糖剥夺（oxygen?glucose deprivation,OGD）诱导SH?SY5Y细胞凋亡中的作用。方法：利用Western blot检测SH?SY5Y细胞在OGD条件下Mxi1?0和线粒体自噬相关蛋白LC3?Ⅱ、p62、Tom20的表达水平。Mxi1?0 siRNA转染SH?SY5Y细胞,以CCK?8法和Annexin V/PI染色法检测Mxi1?0在OGD诱导细胞凋亡中的作用。结果：OGD条件下,SH?SY5Y细胞中Mxi1?0的表达先上升后下降。OGD处理使线粒体自噬相关蛋白LC3?Ⅱ表达升高,p62和Tom20蛋白表达下降。OGD条件下,Mxi1?0沉默可抑制OGD诱导的线粒体自噬,增强OGD诱导的SH?SY5Y细胞凋亡。结论：Mxi1?0通过增强线粒体自噬拮抗OGD诱导的SH?SY5Y细胞凋亡。     

特发性肺纤维化病人肺成纤维细胞过度表达单核细胞趋化蛋白-1

目的研究凝血酶对正常人肺成纤维细胞（normalhuman lung fibroblasts,N-LF）和特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis,IPF）病人肺成纤维细胞（F-LF）单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）表达的影响。方法 N-LF和F-LF细胞分别培养于96孔培养板内,凝血酶诱导4和24h后,收集上清液并用ELISA方法检测MCP-1蛋白水平。结果凝血酶可诱导N-LF和F-LF细胞释放MCP-1,但F-LF细胞的MCP-1分泌水平远远高于N-LF细胞。结论人肺成纤维细胞在肺纤维化过程中过度合成和释放MCP-1,凝血酶可进一步促进其过度表达MCP-1。     

Mu2蛋白亚细胞结构定位及其相互作用蛋白的筛选

目的：采用果蝇S2细胞表达FLAG-Mu2蛋白,观察其亚细胞结构定位并纯化鉴定FLAG-Mu2质粒蛋白复合物,为Mu2蛋白的研究提供依据。方法：FLAG-Mu2转染果蝇S2细胞后表达FLAG-Mu2融合蛋白,共聚焦激光扫描显微镜下观察FLAG-Mu2蛋白的亚细胞定位,并通过核浆分离蛋白提取实验观察细胞核提取物中FLAG-Mu2蛋白的表达情况;采用免疫沉淀技术沉淀FLAG-Mu2复合物,并对其进行纯化及质谱测序以确定蛋白复合物的组分。结果：共聚焦激光显微镜下观察,FLAG-Mu2蛋白主要表达于细胞核中。核浆分离蛋白提取检测,融合蛋白相对分子质量约为140 000,主要存在于细胞核提取物中。纯化FLAG-Mu2蛋白复合物并进行蛋白质质谱分析,FLAG-Mu2复合物中可能含有pif1A、CG31782、mip120、CG31690和G protein-sa60A。结论：FLAG-Mu2蛋白在果蝇S2细胞中主要定位于细胞核,FLAG-Mu2蛋白复合物中有5种可能的蛋白组分。     

Max二聚化蛋白1（Mad1）真核表达载体的构建及其对胃癌细胞增殖和迁移能力的影响

目的：构建Max二聚化蛋白1 (Max dimerization protein 1,Mad1) 的真核表达载体,研究Mad1对胃癌细胞增殖和迁移能力的影响。方法：利用DNA重组技术将Mad1基因克隆至pEGFP-N1载体,构建成pEGFP-N1-Mad1重组真核表达载体。经酶切和测序鉴定后,采用脂质体转染技术将重组质粒瞬时转染人胃癌AGS细胞, RT-PCR及Western blot检测Mad1基因和蛋白的表达。荧光显微镜观察Mad1在AGS细胞内的定位情况。CCK-8和Transwell实验研究Mad1对胃癌AGS细胞增殖和迁移能力的影响。结果：成功构建携带Mad1基因的真核表达载体pEGFP-N1-Mad1。将重组质粒瞬时转染AGS细胞后,RT-PCR和Western blot检测到Mad1 基因和蛋白的表达。Mad1基因表达产物定位于AGS细胞核中。CCK-8和Transwell实验结果显示,转染Mad1的AGS细胞与转染空载体的AGS细胞、及正常AGS细胞相比,细胞增殖活力和迁移能力明显降低。 结论：成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-Mad1,研究表明Mad1可以抑制胃癌AGS细胞的增殖和迁移。     

肌营养不良蛋白及其衍生物的表达与定位的研究

目的 研究肌营养不良蛋白( DG)及其衍生物α-DG、β-DG在真核细胞内的表达与定位. 方法 构建pcDNA3. 1-DAG1-FLAG、pcDNA3. 1-DAG1α-FLAG 和 pcDNA3. 1-DAG1β-FLAG 3个真核表达质粒,并分别转染至HEK 293T细胞中;提取总蛋白, Western blot检测表达情况;分别转染至COS7细胞,在荧光显微镜下观察细胞定位情况. 结果 成功构建了带有DAG1、DAG1α、DAG1β 基因的真核表达载体,且在HEK 293T细胞中都能有效表达,在COS7 细胞中主要分布于细胞质. 结论 DG 及其衍生物 α-DG、β-DG 在 HEK 293T、COS7细胞中均有表达,主要分布在细胞质内,为进一步了解DAG1的功能提供了细胞学基础.     

小鼠FGFR1/MIP3a-Fc融合基因真核表达载体的构建及表达

目的 构建小鼠成纤维细胞生长因子受体1/巨噬细胞炎性蛋白3a-Fc融合基因(FGFR1/MIP3a-Fc)的真核表达质粒,并在293T细胞中的表达。方法 设计合成FGFR1/MIP3a融合基因引物,用PCR方法扩增获得FGFR1/MIP3a基因片段,用内切酶消化后插入pc DNA3.1(+)/Fc(Mouse Ig G2a)质粒中,构建FGFR1/MIP3a-Fc融合基因表达质粒;经PCR鉴定、酶切鉴定以及测序鉴定后,将该融合基因表达质粒瞬时转染293T细胞,用ELISA法检测其在293T细胞的表达。结果 经PCR、酶切鉴定以及测序证实,FGFR1/MIP3a-Fc融合基因表达质粒构建成功;ELISA检测FGFR1/MIP3a-Fc融合基因表达质粒能够在293T细胞中表达。结论 FGFR1/MIP3a-Fc融合基因表达质粒构建成功,该质粒能够在293T细胞中表达。     

人HCCR蛋白表达载体的构建、表达及其蛋白纯化

目的:构建人HCCR蛋白表达载体,并探讨其体外表达及表达产物的纯化。方法:培养人肝癌细胞,提取总RNA,反转录合成cDNA第一链,以此cDNA为模板经PCR合成插入片段,连接至载体pMBP-C,转化到大肠杆菌Top10F′中,进行诱导表达。表达产物通过Ni-NTA螯合层析进行纯化。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,Westernblot和电喷雾电离串联飞行时间质谱(ESI-TOFMS)鉴定表达产物。结果:构建的表达载体经限制性内切酶酶切分析和DNA测序,证明所构建的质粒含有HCCR基因。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳发现该重组质粒经IPTG诱导后表达一种新的蛋白,这种蛋白不存在于诱导后的空载体表达产物中,表达产物经Westernblot和蛋白质谱鉴定含有HCCR蛋白的部分肽段。结论:成功构建了HCCR蛋白表达载体并进行体外表达及纯化。     

人RACK1蛋白在HEK-293 T和BL21细胞中的表达及COS7细胞的定位

目的构建可以表达有活性的蛋白激酶 C 受体(RACK1)的重组质粒,检测其在细胞内的表达与定位情况。方法设计上下游引物,以RACK1全长cDNA序列为模板, PCR扩增出 RACK1序列,分别构建到载体 pcDNA3.1和pGEX-5X-3。转染pcDNA3.1-FLAG-RACK1到人胚胎肾细胞(HEK-293T)和非洲绿猴肾成纤维细胞(COS7细胞),转化pGEX-5X-3-RACK1到大肠杆菌 BL21感受态细胞中表达, Western blot法和考马斯亮蓝染色法检测RACK1表达情况,免疫荧光法研究其细胞内定位。结果成功构建了 pcD-NA3.1-FLAG-RACK1和GEX-5X-3-RACK1重组质粒。 West-ern blot证明了其在HEK-293T细胞中的表达,考马斯亮蓝染色显示其在BL21菌株也能大量表达,免疫荧光显示RACK1在COS7的细胞核与细胞质中均有分布。结论人RACK1在HEK-293T细胞和BL21菌株中均能有效表达,在COS7细胞的胞质、胞核均有分布,为进一步研究人RACK1基因的功能奠定了基础。     

人类胞内氯离子通道蛋白3在原核细胞及真核细胞内的表达

目的研究人类胞内氯离子通道蛋白3(CLIC3)在真核细胞中的定位和表达,及其GST融合蛋白在原核细胞中的表达。方法以含人CLIC3的全长cDNA序列的质粒为模板,PCR扩增CLIC3片段,构建真核表达载体pcDNA3.1-CLIC3-FLAG,检测其定位及表达;构建原核表达载体pGEX-5X-3-CLIC3,转化到大肠杆菌 BL21菌株,IPTG诱导融合蛋白GST-CLIC3表达。结果细胞免疫荧光结果表明 CLIC3在COS7细胞质和细胞核中均有分布;Western blot结果显示CLIC3在HEK-293T细胞中能有效表达;考马斯亮蓝染色结果表明融合蛋白GST-CLIC3在BL21菌株中能有效表达。结论人类的CLIC3蛋白COS7、HEK-293T及大肠杆菌BL21菌株均能有效表达,为进一步了解CLIC3的功能奠定了一定的基础。