应用滚环扩增研究肝癌组织中的HBV cccDNA

目的：运用滚环扩增（rolling circle amplification,RCA）分离肝癌患者组织中乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA,cccDNA）,研究pre-S区的缺失。方法：对RCA技术的特异性和灵敏度进行了研究,并应用该技术扩增13对癌组织和癌旁组织中HBV cccDNA,对pre-S区的缺失进行了研究。结果：RCA能够高效,特异的扩增组织中10拷贝/μl HBV cccDNA;26例样本中,22例样本的HBV cccDNA能够被RCA撤增测序,其中有8例样本（8/22,36.4%）在pre-S区域存在着缺失,pre-S2缺失比例高于 pre-S1（8/8 vs. 2/8,P=0.007）。结论：首次发现肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）组织中HBV cccDNA存在着pre-S区的缺失,有助于深入理解cccDNA pre-S区缺失与HCC的关系。     

HBV cccDNA检测临床应用研究进展

乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA(hepatitis Bvirus covalently closed circular DNA,HBVcccDNA)是嗜肝病毒复制过程中产生的一种重要复制中间体,在宿主细胞核内积聚,形成HBV cccDNA池,半衰期长,现有抗病毒药物不能清除,是宿主肝细胞持续     

酶切联合巢式PCR法检测外周血单个核细胞中的HBV DNA与HBVcccDNA

目的:检测慢性HBV感染者外周血单个核细胞(PBMCs)中HBV的存在状态.方法:采用巢式PCR法检测慢性HBV感染者PBMCs中的HBV DNA;用Hirt法、绿豆核酸酶、设计跨越单链区和三链区巢式PCR引物,以尽可能去除rcDNA的影响,检测共价闭合环状DNA(eccDNA).结果:采用酶切联合巢式PCR法在慢性HBV感染者PBMCs中可扩增出cccDNA,同时未扩增出rcDNA;120例慢性HBV感染者PB-MCs中HBV DNA,cccDNA阳性检出率分别为62.5%,45.8%,HBV DNA阳性检出率明显高于cccDNA(P<0.01);其中HBeAg阳性组PBMCs中HBV DNA检出率(80.0%)和cccDNA阳性率(45.0%)均明显高于HBeAg阴性组(61.7%,30.0%,P<0.01).结论:酶切联合巢式PCR法检测cccDNA可有效避免roDNA对cccDNA扩增的干扰;结果表明乙肝病毒不仅可感染PBMCs,并可在其中复制;HBcAg阳性者PB-MCs中HBV DNA及cccDNA检出率高.     

外周血HBV cccDNA检测的临床应用

目的通过对乙型肝炎患者外周血单个核细胞及血浆中共价闭合环状DNA（cccDNA）的检测,初步探讨其外周血检测对乙型肝炎诊治的价值。方法将86例确诊为乙型肝炎患者根据病情分为3组,急性乙型肝炎（AHB1、慢性乙型肝炎（CHB）及HBsAg无症状携带者（ASC）组。采集外周血,分别检测ALT、AST、总胆红素（TBIL）、cccDNA、HBV—DNA。结果三组血浆cccDNA检测结果有显著性差异（P〈0．01）。单个核细胞cccDNA7个标本阳性,血浆cccDNA与HBV—DNA、ALT、AST、TBIL相关系数分别为0．817、0．402、0．450、0．221。结论血浆cccDNA在乙型肝炎患者的各个病程有显著性差异,单个核细胞cccDNA储存池确实存在但浓度较低难以检测。血浆cccDNA．与HBV—DNA、ALT、AST相关,但与TBIL无明显相关。     

HBV感染者外周血单个核细胞中HBV DNA的检测

目的；研究乙型肝炎毒（ＨＢＶ）感染者外周血单个核细胞（ＰＢＭＣｓ）中ＨＢＶ ＤＮＡ的存在及其与血清ＨＢＶ ＤＮＡ的关系。方法：用ＰＣＲ法及斑点杂交法对５０例ＨＢｓＡｇ（＋）的感染者ＰＢＭＣｓ ＨＢＶ ＤＮＡ进行检测。同时用ＰＣＲ法检测感染者血清ＨＢＶ ＤＮＡ。结果：ＰＣＲ法和斑点杂交法分别从３５份和３２份ＰＣＭＣｓ检出率均为６０．０％左右。ＰＣＲ法检测血清ＨＢＶ ＤＮＡ阳性率为３６．０％。结论：Ｈ     

环介导等温扩增(LAMP)试剂盒检测石蜡包埋肝组织中乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)

 目的  建立一种检测石蜡包埋的肝组织中乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)的新方法,并探讨其应用价值和临床意义。方法  提取30例慢性HBV感染患者的石蜡包埋肝组织中的DNA,采用质粒安全ATP依赖性DNA酶(plasmid-safe ATP-dependent DNase,PSAD)消化,去除非cccDNA后,加入引物及Bst DNA酶进行环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),将检测结果与临床实验室资料结合并进行分析,以判断其临床应用价值。结果  30例HBV感染患者中,有17例HBV cccDNA阳性,阳性检测率56.67%。其中肝癌5例、肝硬化4例、重型乙型肝炎5例、慢性乙型肝炎(轻-中度)3例。提示肝组织HBV cccDNA阳性可能与疾病进展密切相关,与血清HBV cccDNA阳性有一定的相关性,与乙型肝炎病毒血清免疫标志物以及肝功能状况无明显相关。结论  LAMP法能检测到石蜡包埋肝组织中的HBV cccDNA,结合临床实验室资料,对判断抗病毒药物疗效及研究乙型肝炎致病机制具有一定的意义。     

HBV感染与宿主基因及病毒DNA甲基化

乙型肝炎病毒(HBV)感染是慢性肝炎、肝硬化及肝癌的重要病因,HBV感染诱导的宿主基因组甲基化及病毒自身DNA甲基化改变可能是病毒感染慢性化及慢性肝病形成的重要发病机制之一,HBV基因组及HBV共价闭合环状DNA的甲基化在调控病毒复制和蛋白表达中起着重要作用。探讨HBV DNA甲基化对于研究病毒的致病机制、指导HBV感染的治疗有重要意义。     

肝组织HBV总DNA和cccDNA阴性参考值的探讨

目的探讨肝组织乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）总DNA（total DNA,tDNA）和共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA,cccDNA）的阴性参考值,为进一步研究实时定量PCR检测肝组织HBV tDNA和cccDNA的应用价值奠定基础。方法分别有88例HBsAg阳性/抗-HBc阳性、20例HBsAg阴性/抗-HBc阳性和19例HBsAg阴性/抗-HBc阴性慢性肝炎患者入选本研究。肝组织β-globin DNA、HBV tDNA和cccDNA采用实时荧光定量PCR检测,单个肝细胞HBV tDNA和cccDNA含量（copies/cell）=HBV tDNA实测值（copies）/β-globin DNA实测值（copies）和HBV cccDNA实测值（copies）/β-globin DNA实测值（copies）。肝组织HBVtDNA和cccDNA含量的计算单位定义为log_（10）copies/10~6cell。统计分析采用SPSS 13.0软件。结果肝组织HBVtDNA和cccDNA鉴别HBsAg阳性/抗-HBc阳性与HBsAg阴性/抗-HBc阴性慢性肝炎的ROC曲线下面积分别为0.909和0.891（P=0.000和0.000）,最佳截断值分别为5.772和4.883 log_（10） copies/10~6cells;鉴别HBsAg阳性/抗-HBc阳性与HBsAg阴性/抗-HBc阳性慢性肝炎的ROC曲线下面积分别为0.893和0.857（P=0.000和0.000.）,最佳截断值分别为5.559和4.630 log_（10） copies/10~6cells。就HBsAg阳性/抗-HBc阳性慢性肝炎而言,当肝组织HBV tDNA和cccDNA≥5.699和cccDNA≥4.699 log_（10） copies/10~6cells时,肝组织HBV tDNA与cccDNA含量之间均呈显著正相关（P=0.000和0.000）;当肝组织HBV tDNA〈5.699和cccDNA〈4.699 log_（10） copies/10~6cells时,肝组织HBV tDNA与cccDNA含量之间均无显著相关性（P=0.065和0.880）。结论肝组织HBV tDNA〈5.699和cccDNA〈4.699 log_（10） copies/10~6cells可能是合适的阴性参考值。     

乙型肝炎病毒cccDNA检测方法的建立及初步应用

目的：建立和应用聚合酶链反应法（PCR）检测慢性乙型肝炎患者肝组织中乙型肝炎病毒（HBV）共价闭合环状DNA（cccDNA）。方法：应用选择性PCR的方法检测30例乙肝患者肝组织中cccDNA,同时验证此方法的特异性。结果：31例慢性乙型肝炎患者肝组织中,10例HBVcccDNA阳性,阳性率为32.3%。HBV cccDNA阳性组的ALT、HBVDNA、和HBeAg水平均明显高于阴性组（P〈0.01和P〈0.05）。结论：该方法操作简单,特异性好,可用于测定肝组织中HBV cccDNA,用于了解乙肝患者病情和传染性强弱以及评价抗乙肝病毒药物的疗效。     

一种高特异性和灵敏性的HBV cccDNA检测方案研究

目的建立一种TaqMan探针的实时PCR检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA(cccDNA)方案。方法根据rcDNA与cccDNA结构差异,在缺口两侧设计引物,应用TaqMan探针分析,加入1种可以去除rcDNA和部分扩增产物的依赖ATP的内切酶(Plasmid-Safe ATP-dependent DNase)。结果通过高速离心获得病毒单质颗粒验证了该方案的特异性;通过克隆和酶切得到3.2 kb的环状DNA验证了方案的灵敏性。乙肝患者血清、肝组织cccDNA占总HBV DNA的比例分别为0.03%～0.81%、0.4%～28.0%。结论成功地建立了以TaqMan探针检测血清和肝组织HBV cccDNA的实时PCR检测方法。     

血清乙肝病毒cccDNA检测的临床分析

目的:探讨血清中乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)全序列的PCR检测与HBV复制及肝细胞损伤的临床相关性?方法:用长链PCR方法对乙型肝炎患者血清进行HBV cccDNA全序列直接扩增,同时检测血清中乙型肝炎病毒前S1(PreS1)抗原和丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性?结果:cccDNA和PreS1抗原在乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)阳性血清中检出率分别为43.94%(29/66)和83.33%(55/66),在HBeAg阴性血清中的检出率分别为13.33%(4/30)和30.00%(9/30);cccDNA阳性血清的PreS1抗原阳性率和ALT活性升高分别为90.91%(30/33)和93.94%(31/33),cccDNA阴性血清的PreS1抗原阳性率和ALT活性升高分别为53.97%(34/63)和41.27%(26/63)?结论:血清中cccDNA的检出与PreS1抗原?HBeAg的表达以及肝细胞损伤呈高度相关性?     

体外培养细胞内乙肝病毒共价闭合环状DNA检测方法的建立

目的：建立一种体外培养细胞内乙肝病毒（hepatitis B virus,HBV）共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA,cccDNA）的检测方法。方法：Southern blot 检测HBV复制中间体,以确认HepAD38、HepG2.2.15和P+P-细胞是否支持HBV复制;用Hirt法分别提取细胞内的去蛋白DNA（protein-free DNA,PF DNA）,经加热变性处理,EcoRⅠ酶切,然后用Southern blot检测HBV cccDNA;用同样方法检测不同培养时间的HepAD38细胞内cccDNA,观察培养时间对cccDNA积累量的影响。结果：用Southern blot可在HepAD38、HepG2.2.15和P+P-细胞中检测到HBV复制中间体;Hirt法提取物经变性和酶切处理,可有效地将cccDNA与其他形式HBV DNA区分开;HepAD38、HepG2.2.15和P+P-细胞内均可检测到HBV cccDNA;HepAD38细胞在铺满后继续培养的时间较长时,其细胞内cccDNA的量较多。结论：成功建立了体外培养细胞内HBV cccDNA检测方法,该方法结合Hirt提取法和地高辛探针Southern blot方法,能可靠、准确地检测HBV cccDNA。     

鸭肝损伤模型血清中鸭乙肝病毒cccDNA的动态检测

目的 探讨在不同程度肝损伤的DHBV感染麻鸭外周血中能否检测出DHBVcccDNA.方法 选择持续感染DHBV的2月龄上海麻鸭24只随机分均分为4组,分别以(1)A组:D-氨基半乳糖(D-GalN)2.2 g/kg+脂多糖(LPS)100 μg/kg;(2)B组:D-GalN+LPS+10 ml/kg的CCl4灌胃2次;(3)C组:D-GalN+LPS+15 ml/kg的CCl4灌胃2次;(4)NC组:生理盐水处理作为正常对照组(NC组).在处理后0、24、36和48 h进行血清ALT、DHBV载量和DHBV cccDNA检测,最后处死动物取肝组织评价肝损伤程度,并检测肝组织中的总DHBV DNA和DHBV cccDNA.结果 NC组鸭肝脏无明显病理改变,A组、B组和C组鸭则分别出现点状坏死至大片肝坏死的肝损伤,3组之间的肝损伤程度分级差异有统计学意义(P＜0.01).B组和C组在处理后48 h分别有1只和4只鸭死亡.NC组和A组各检测时点血清中均未检测到DHBV cccDNA;B组和C组在处理后36 h分别有2只和3只鸭血清中检测到DHBV cccDNA,含量在(0.32～1.72)×104拷贝/ml之间,在处理后48 h两组各有1只鸭血清中仍可以检测出DHBV cccDNA.Logistic逐步回归分析显示血清中DHBVcccDNA的检出率与肝损伤程度评分有关(P=0.0029),而与血清DHBV载量、ALT水平以及肝组织中的总HBV DNA和DHBV cccDNA 含量无关.结论 在肝组织发生严重损伤时,血清中可以出现DHBV cccDNA,血清中DHBV cccDNA的检出与肝组织损伤程度显著相关.     

HBV感染者PBMC培养上清液IL-18水平的监测及意义

关于HBV感染者外周血单个核细胞(PBMC)培养上清液IL18的检测报道较少,且都局限于慢性乙型肝炎及HBsAg携带者,而急性肝炎目前未见报道。MaruyamaT等报道,IL18在PBMC中的表达与病情活动直接相关,随着病情缓解IL18的表达下降,在活动期,IL18的表达水平趋于正常。我们检测了急性乙型     

原位聚合酶链反应检测肝细胞内乙型肝炎病毒共价闭合环状的DNA表达

目的 探讨乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA(HBV-cccDNA)在慢性乙肝患者肝细胞中的表达及意义.方法选取活动性乙型肝炎及乙型肝炎后肝硬化患者肝穿或重症乙肝患者尸检肝组织标本50例,经10%甲醛固定,石蜡包埋,连续切片,用0.05%多聚赖氨酸处理后使用.分别设立无引物、无地高辛标记引物、无TaqDNA聚合酶PCR反应体系及非乙肝患者肝组织共10例作为阴性对照.采用原位PCR技术进行HBV-cccDNA检测.结果HBV-cccDNA在乙肝患者肝细胞中阳性表达以核型为主,呈蓝紫色,在肝细胞中总阳性表达率为60%～85%;偶见于细胞浆中,对照组均为阴性.结论原位PCR可以在肝细胞原位检测出HBV-cccDNA,阳性信号以核型为主.提示HBV-cccDNA主要存在于细胞核中,为乙肝病毒持续感染及复制的根源.     

外周血单个核细胞HBV的复制状态与干扰素-γ表达和分泌的关系

目的: 研究HBV侵犯外周血单个核细胞(PBMC)及对IFN-γ表达和分泌的影响.方法: 慢性HBV感染者60例,巢式PCR检测PBMC中HBV共价闭合环状DNA(cccDNA);ELISA法检测血清IFN-γ水平;实时定量RT-PCR方法检测PBMC中IFN-γmRNA的表达水平.结果: 48.3%(29/60)的患者PBMC中检测到cccDNA;血清IFN-γ水平低于对照组(P＜0.05);PBMC中IFN-γmRNA表达水平低于对照组(P＜0.01);PBMC中cccDNA阳性组IFN-γ表达和分泌水平低于cccDNA阴性组(P＜0.01).结论:HBV慢性感染者PBMC中IFN-γ表达和分泌水平降低.     

同一HBV感染者外周血单个核细胞与肝组织中HBV DNA

用聚合酶链反应(PCR)及Southern印迹杂交检测了16例慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者外周血单个核细胞(PBMCs)及肝组织中HBV DNA.有13例同时在PBMCs及肝组织中检出HBV DNA,1例仅在PBMCs中检出,1例只在肝组织中检出。结果表明,在慢性HBV感染过程中PBMCs可同时被感染。     

人工肝支持系统对重型乙型肝炎患者血清中HBV cccDNA影响的初步研究

目的：建立HBVcccDNA荧光定量PCR方法并检测重型乙型肝炎患者人工肝血浆置换治疗前后血清中HBVcccDNA含量。初步探索人工肝支持系统对重型乙型肝炎患者血清中HBVcccDNA的影响。方法：以50例重型乙型肝炎患者人工肝血浆置换治疗前后血清作为检测标本,对血清中总HBVDNA、HBVcccDNA含量进行定量检测。用SAS8．0统计软件对结果进行统计学分析。结果：成功建立定量检测HBVcccDNA方法并证实在重型乙型肝炎患者血清中存在HBVcccDNA。在人工肝血浆置换前后总HBVDNA及HBVcccDNA含量明显降低（P〈0．05）。总HBVDNA与HBVcccDNA之间有较好的相关性忙0．78,P〈O．01）。总HBVDNA水平与PT（r=0．37,P〈O．01）、AIJT（r=0．29,P〈0．05）、AST（r=-0．39,P〈0．01）水平有一定的相关性;HBVcccDNA水平与PT（r=0．34,P〈0．05）、ALT（r=0．34,P〈0．05）、AST（r=0．40,P〈0．01）水平有一定的相关性。结论：总HBVDNA及HBVcccDNA在一定程度上能够反映肝细胞坏死程度;血浆置换术后病毒含量明显降低,为进一步研究重型乙型肝炎治疗途径及发病机制打下基础。     

慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞及肝组织中HBVcccDNA的相关性

目的：通过对慢性乙型肝炎患者肝组织及外周血单个核细胞（PBMC）中乙肝病毒共价闭合环状DNA（HBVcccDNA）的特异性定量检测,探讨两者的相关性和临床可行性。方法：取本院慢性乙型肝炎患者肝组织穿刺标本20份,在肝穿刺当天抽取患者外周抗凝血5mL,标本经相应处理后行HBVcccDNA检测。结果：20份慢性乙型肝炎患者肝组织标本中有18份HBVcccDNA检测为阳性,最大值为5．61×10^5copy／μg,最小值为3．26×10^3copy／μg,平均为1．79×10^4copy／μg。20份血浆中PBMC中HBVcccDNA检测均为阴性。结论：在慢性乙型肝炎患者肝纽织中可检测到HBVcccDNA,但未能在PBMC中检测到HBVcccDNA,因此PBMC不能支持HBV的复制。