弓形虫表面抗原P35重组蛋白的表达、纯化及鉴定

目的 构建弓形虫R0H株表面抗原P35基因重组表达质粒P35／pGEX-2T，并在大肠杆菌JMl09中进行表达、纯化及鉴定。方法 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术从弓形虫CDNA库中扩增出编码P35抗原的基因片段，克隆入表达载体pGEX-2T，并在大肠杆菌JMl09中融合表达，经GSTmp^TM亲和层析柱纯化出P35重组融合蛋白，以SDS-PAGE电泳鉴定纯度、Western-blot鉴定抗原性。结果成功构建了重组表达质粒P35／pGEX-2T，融合表达产物的分子质量约为70kDa；该蛋白抗原能为谷胱甘肽S转移酶(GST)单克隆抗体及弓形虫感染的兔血清所识别。结论弓形虫表面抗原P35在大肠杆菌中有效表达，纯化蛋白有良好的免疫活性。     

人结核杆菌热休克蛋白65重组卡介苗疫苗的构建、表达及鉴定

目的　构建人结核杆菌热休克蛋白 6 5 (HSP6 5 )重组卡介苗 (BCG)疫苗。方法　用PCR技术从BCG基因组中扩增出抗原 85B (Ag85B)的信号肽DNA序列 ,从 pCMV MTHSP 6 5质粒中扩增出HSP6 5全长基因。利用DNA重组技术将以上两个片段插入质粒 pBCG 2 10 0的人结核杆菌HSP70启动子下游 ,构建一个分泌型的原核穿梭表达质粒pBCG SP HSP6 5。利用电穿孔的方法将该质粒转入BCG中 ,经热诱导后 ,用SDS PAG电泳来观察其表达水平。利用Westernblot来检验HSP6 5的生物学活性。结果　酶切鉴定、PCR和测序分析结果表明 ,所克隆的信号肽DNA片段和热休克蛋白 6 5DNA片段与报道结果完全一致 ,重组体的连接方向正确 ,阅读框与预期完全一致。热诱导后 ,重组BCG表达的 6 5kD (1kD =0 992 1ku)蛋白占菌体总蛋白的 35 6 7% ,占裂解物上清总蛋白的 74 0 9% ,表明重组的HSP6 5基因能在BCG中高效表达 ,表达的蛋白大部分以可溶状态存在。通过Westernblot证实分泌的该蛋白能与结核杆菌HSP6 5的抗体特异性结合。结论　成功构建分泌型原核穿梭表达质粒pBCG SP HSP6 5 ,重组的HSP6 5基因能在BCG中高效表达 ,表达的HSP6 5具有生物学活性 ,重组BCG疫苗构建成功。     

分枝杆菌热休克蛋白65重组质粒的构建与原核表达

目的研究分枝杆菌热休克蛋白65(HSP65)重组质粒的构建与原核表达。方法 HSP65的开放阅读框经聚合酶链反应(PCR)扩增后,经NcoⅠ与NotⅠ内切酶依次酶切,连接至酶切后的原核表达载体PET-28a中,然后将重组质粒转入大肠杆菌BL-21中,PCR筛选阳性克隆,并经DNA测序进一步验证。阳性克隆进一步扩大培养,并进行乳糖诱导,十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳对菌体蛋白进行检测。结果成功扩增出1 623 bp的目的片段HSP65;测序结果显示,该片段与目的序列完全相符,重组子PET-28a/HSP65构建成功;乳糖诱导后的HSP65在大肠杆菌中实现高表达。结论分枝杆菌HSP65蛋白的成功表达,为研究其在抗肿瘤疫苗中的应用奠定了基础。     

淋病奈瑟菌孔蛋白B原核重组质粒的构建、表达与蛋白鉴定

目的克隆和分析淋病奈瑟菌孔蛋白（porinⅠB，PⅠB）的基因序列并表达相应的蛋白质，为淋病奈瑟菌感染的检测和基因工程疫卣的研究与开发建立基础。方法PCR扩增出孔蛋白PⅠBDNA片段后构建出重组质粒pET—PⅠB，并经质粒酶切筛选、DNA测序和异丙基硫-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导大肠埃希菌DE3表达蛋白予以证实。结果所得PⅠB核苷酸序列与GenBank（AF090801）公布的序列相比较，同源性达99．28％，推导氨基酸序列同源性为98．14％。SDS-PAGE检测到40kD大小的融合蛋白。结论淋病奈瑟菌孔蛋白PⅠB原核表达质粒构建正确。     

人釉原蛋白的原核表达、纯化及鉴定

目的构建含人釉原蛋白(hAm)成熟肽基因的重组原核表达质粒,在大肠杆菌中表达重组人釉原蛋白,鉴定经纯化获得的融合蛋白。方法利用限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ将hAm基因插入原核表达载体PGEX4T1,对重组表达质粒PGEX4T1-hAm进行双酶切和测序鉴定。选择测序正确的质粒转化E.coli.RosettaTM,用终浓度0.3 mmol/L的IPTG诱导表达带有亲和标记谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的重组hAm。经亲和层析纯化获得融合蛋白GST-hAm,并通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定原核表达的重组hAm。结果重组质粒经双酶切和测序鉴定证实插入序列准确无误。在大肠杆菌RosettaTM中经IPTG诱导表达并纯化得到的融合蛋白GST-hAm,经SDS-PAGE鉴定分子量约为46000,主要以包涵体形式存在,与预测一致;Western blotting证实该融合蛋白能被特异性抗hAm多克隆抗体识别。结论成功构建含有hAm成熟肽基因的重组原核表达质粒,表达的融合蛋白GST-hAm可通过纯化获得,经鉴定为hAm。大量纯化的hAm成熟肽的获得为开展其功能研究奠定了基础。     

弓形虫微线体蛋白1部分基因原核表达重组质粒pWR450-1-MIC1的构建、鉴定及测序

目的：构建弓形虫ZS2分离株pWR450-1-MIC1原核表达重组质粒，为进一步表达及免疫做准备。方法：用PCGENE软件分析MIC1基因可能的TB抗原表位，自行设计引物，用聚合酶链反应（PCR）技术从弓形虫ZS2分离株的基因组DNA中扩增编码微线体蛋白1（MCC1）的基因片段，经酶切，连接，重组入pWR450-1原核表达载体，再经含氨苄培养基筛选，酶切，PCR鉴定和测序。结果：从ZS2分离株基因组DNA中扩增出特异的MIC1基因片段，克隆成功pWR450-1－MIC1重组质粒，测序表明MIC1这部分基因与RH株相应碱基序列完全一致。高度保守，为下一步表达及免疫奠定基础。     

人釉原蛋白的原核表达、纯化及鉴定

目的 构建含人釉原蛋白(hAm)成熟肽基因的重组原核表达质粒,在大肠杆菌中表达重组人釉原蛋白,鉴定经纯化获得的融合蛋白.方法 利用限制性内切酶EcoR I和Sal I将hAm基因插入原核表达载体PGEX4T1,对重组表达质粒PGEX4T1-hAm进行双酶切和测序鉴定.选择测序正确的质粒转化E.coli.RosettaTM,用终浓度0.3 mmol/L的IPTG诱导表达带有亲和标记谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的重组hAm.经亲和层析纯化获得融合蛋白GST-hAm,并通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定原核表达的重组hAm.结果 重组质粒经双酶切和测序鉴定证实插入序列准确无误.在大肠杆菌RosettaTM中经IPTG诱导表达并纯化得到的融合蛋白GST-hAm,经SDS-PAGE鉴定分子量约为46 000,主要以包涵体形式存在,与预测一致;Western blotting证实该融合蛋白能被特异性抗hAm多克隆抗体识别.结论 成功构建含有hAm成熟肽基因的重组原核表达质粒,表达的融合蛋白GST-hAm可通过纯化获得,经鉴定为hAm.大量纯化的hAm成熟肽的获得为开展其功能研究奠定了基础.     

昆虫杆状病毒表达系统中人骨形成蛋白3的表达及鉴定

探索人骨形成蛋白在昆虫杆状病毒系统中的表达规律。方法将ｈＢＭＰ３全长ｃＤＮＡ克隆入转移载体ＢａｃＰＫ８中,酶切鉴定后,将此载体与病毒ＤＮＡ经脂质体包裹转染昆虫细胞,重组病毒经蓝白选后,提取其ＤＮＡ进行ＰＣＲ反应,鉴定目的基因。收集重组病毒感染５ｄ的细胞进行免疫荧光及电子显微镜观察。结果克隆了目的基因的重组载体经内切酶消化后,琼脂糖电泳示有相应大小的目的基因片段切下,ＰＣＲ电泳结果见有目的基因片段的     

干扰AFP蛋白表达的shRNA表达载体的构建及活性鉴定

目的:利用含报告基因EGFP的pGenesil-1质粒构建干扰AFP蛋白表达的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达的载体,并进行活性鉴定.方法:设计表达短发夹RNA的互补DNA序列,经退火成双链,克隆至带有U6启动子的质粒载体pGenesil-1中,构建重组质粒,转化大肠杆菌DH5α菌株,扩增,提取质粒,酶切鉴定后测序分析.构建正确的重组质粒经脂质体转染HepG2细胞,检测转染率和培养细胞上清的AFP含量变化,确定重组质粒的活性.结果:构建了靶向AFP蛋白的2个shRNA重组质粒载体pGenesil-1-siAFP1和pGenesil-1-siAFP2.酶切鉴定和测序分析,shRNA编码序列与设计的片段完全一致,经酶切凝胶电泳证实载体构建成功.重组质粒有效转染HepG2细胞并显著抑制AFP表达.结论:成功构建具有活性的、能够表达shRNA靶向干扰AFP蛋白的2个重组质粒载体.     

重组人bFGF蛋白的克隆、表达、纯化及鉴定

【目的】构建人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）基因的原核表达载体,并对其进行诱导表达和蛋白质纯化,以获得大量重组人bFGF蛋白。【方法】人工合成bFGF基因,进行测序分析,将该基因克隆入原核表达载体pET22b中,转化感受态细胞大肠杆菌RPX,经IPTG诱导表达重组bFGF蛋白,对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western blotting检测分析。【结果】成功构建了人重组bFGF表达质粒pET22b-rhbFGF,表达的蛋白经SDS-PAGE电泳分析,分子量约在18×103Da处出现了一条新生的蛋白条带,经灰度扫描检测,表达量约占菌体总蛋白的28%,纯化后的蛋白质灰度扫描检测,纯度为95%。【结论】成功构建了重组人bFGF原核表达载体,并成功纯化了该基因的原核表达产物,为下一步人bFGF的产业化打下了基础。     

赖型钩体DNA重组质粒rpDJt及其表达蛋白P68对豚鼠的免疫保护研究

为了进一步鉴定赖型钩体ＤＮＡ重组质粒ｒｐＤＪｔ及其纯化表达蛋白质Ｐ６８的免疫保护作用，采用随机、双盲和对照法对５０只豚鼠进行了３次和６个部位主动免疫接种，并于接种后３０天以强毒力、大剂量活钩体攻击。结果：Ｐ６８组存活率１００％（７／７）；ｒｐＤＪｔ组存活率７７％（１０／１３）；ｐＴ７－７组（无重组质粒）存活率２５％（３／１０）；全钩灭活疫苗组存活率９３％（１３／１４）。作者认为该质粒的表达蛋白质Ｐ６８可作为钩体基因工程亚单位疫苗的候选抗原。     

小鼠B7-H4重组蛋白的表达及鉴定

目的:构建小鼠B7-H4胞外区基因的真核表达载体,转染酵母细胞以表达mB7-H4,并检测其生物学活性.方法:以mB7-H4的重组质粒为模板,在克隆引物上加入Xho I和EcoR I酶切位点,并用PCR方法扩增得到mB7-H4胞外区的基因片段,经Xho I和EcoR I双酶切后接入酵母表达载体Ppic9上,构建成Ppic9-mB7-H4重组质粒.经双酶切和核酸测序鉴定,将该重组质粒转染至酵母细胞,用PCR、Western Blot及ELISA等方法检测重组基因的表达,并鉴定表达蛋白的生物学活性.结果:转染Ppic9-mB7-H4重组质粒的酵母细胞内表达mB7-H4,诱导表达的mB7-H4能有效抑制CD3单抗活化的T淋巴细胞的增殖(相对抑制率为28.3%)和IL-2(相对抑制率为68.8%)、IL-4(相对抑制率为78.8%)、IL-10(相对抑制率为67.6%)、IFN-γ(相对抑制率为77.7%)等细胞因子的分泌.结论:成功构建了mB7-H4真核表达系统,并获得了有生物学活性的mB7-H4分子.     

NME1重组腺病毒构建及表达鉴定

目的：应用 AdEasyTM 腺病毒载体系统构建含人 NME1基因的重组腺病毒,检测 NME1基因在肺癌细胞的表达。方法从人肝脏标本克隆带有 KpnⅠ,XhoⅠ双酶切位点的 NME1cDNA,利用细菌体内同源重组法将 NME1正向连接至腺病毒载体上,测序鉴定正确后,于 QBI-293A 细胞中包装扩增,TCID 50法检测重组腺病毒滴度,重组腺病毒转染至肺癌细胞 GLC-82,检测 NME1在细胞内表达。结果肝脏组织克隆出470bp 条带,测序与 NME1编码序列相符,测得重组腺病毒滴度为10^10 TCID 50/ mL ,免疫实验显示 NME1在 GLC-82细胞成功表达。结论成功构建含人 NME1基因的重组腺病毒并转染肺癌细胞,检测到 NME1在肺癌细胞中正常表达。     

抗凋亡蛋白Fortilin基因的克隆、表达与鉴定

目的在大肠杆菌中表达一种新近发现的抗凋亡蛋白Fortilin。方法用RT-PCR方法,从肺腺癌细胞中扩增出编码Fortilin蛋白的基因(GenBank中编码该蛋白的基因名为TPT1),克隆入pGEX-4T-1表达载体;重组质粒转入E.coliBL21(DE3),诱导表达Fortilin蛋白,并对表达产物进行免疫印迹鉴定。结果经双酶切及核酸序列分析鉴定,重组质粒pGEX-4T-1/TPT1成功构建,诱导后能高效表达可溶性Fortilin融合蛋白,SDS-PAGE及Western-blot验证该蛋白,表达的融合蛋白分子量为45000,与预期理论值相符。结论Fortilin蛋白在大肠杆菌中以融合蛋白形式进行表达,可提高其在宿主细胞中的稳定性和可溶性,且在大肠杆菌中获得高效表达,获得了充足的活性蛋白,这为进一步了解该蛋白的生物学功能,研究其抗凋亡机制奠定了基础。     

重组L-蛋氨酸γ-裂解酶基因原核表达载体构建及初步鉴定（摘要）

目的构建原核表达载体,筛选高表达克隆,提取蛋氨酸酶蛋白,为深入研究蛋氨酸酶体内外抗肿瘤作用做前期准备．方法化学法合成METase基因,将所得基因插入原核表达载体PGEX-4T-1,得到重组质粒并转化人大肠杆菌．通过蛋氨酸诱导筛选高表达克隆．用SDS—PAGE初步检测蛋白．结果重组质粒经PCR检测、酶切、测序证实与预期一致．重组的质粒在蛋氨酸的诱导下表达大量的蛋氨酸酶,并经SDS—PAGE检测,表达产物的分子量同预期结果相符．     

分泌性表达融合蛋白CFP10-ESAT6重组卡介苗构建研究

目的构建分泌表达融合蛋白CFP10-ESAT6的重组卡介苗。方法采用基因拼接（Gene SOEing）法，体外扩增结核杆菌CFP10-ESAT6融合基因，插入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pBCG3000，构建重组穿梭表达质粒pBCG3000-CFP10-ESAT6，用电穿孔法将pBCG3000-CFPIO-ESAT6质粒转化BCG细胞，得到重组卡介苗，热诱导表达CFPIO—ESAT6融合蛋白，SDS—PAGE电泳观察CFP10-ESAT6融合蛋白的表达，Western blot鉴定其生物活性。结果经PCR、酶切及测序鉴定，证实成功构建重组质粒pBCG3000-CFP10-ESAT6，经热诱导表达出约22kDa的CFP10-ESAT6蛋白，可分别被鼠抗ESAT6血清、鼠抗CFP10血清识别。结论分泌性表达融合蛋白CFP10-ESAT6的重组卡介苗构建成功。     

弓形虫表面抗原SAG2重组蛋白的表达及纯化

目的在大肠埃希氏菌（E．coli）中表达弓形虫表面抗原2（SAG2）,纯化制备重组蛋白rSAG2。方法采用聚合酶链反应（PCR）技术从弓形虫基因组中扩增出SAG2编码基因片段,以pMD-18T质粒作TA克隆,序列测定后亚克隆入表达载体pGEX-4T-2,并转化E．coliJMl09感受态菌,IPTG诱导表达rSAG2蛋白,重组rSAG2蛋白采用B—PER谷胱甘肽巯基转移酶（GsT）融合蛋白纯化试剂盒纯化并进行SDS—PAGE与免疫印迹（Western—blot）鉴定。结果SAG2编码基因扩增片段大小为469bp;测序结果显示,克隆的SAG2基因序列与GenBank中弓形虫RH株的同源序列（序列号GI：161925）完全一致;所诱导表达的含GST的融合rSAG2蛋白大小约43kDa,纯化后的rSAG2经SDS—PAGE电泳显示一条纯化条带;蛋白免疫印迹结果显示rSAG2能够被兔弓形虫感染血清所识别。结论在大肠埃希氏菌中融合表达了弓形虫SAG2重组蛋白,纯化的rSAG2蛋白具有一定的免疫活性。     

改良型TAT-VP3融合蛋白的表达、纯化及鉴定

目的表达改良型TAT-VP3融合蛋白,并对其进行纯化.方法利用IPTG温控诱导改良型TAT-VP3融合蛋白表达,并经GST亲和层析纯化,目的蛋白进行SDS-PAGE和Western bolt鉴定.结果改良型TAT-VP3融合蛋白经温控诱导后得到稳定表达,经SDS-PAGE鉴定可见相对分子质量42 kD的特异性目的条带,经GST亲和层析纯化后,得到了纯度较高的目的蛋白.Western bolt验证了表达蛋白的特异性.结论已成功表达及纯化出改良型TAT-VP3融合蛋白,为进一步研究其免疫原性和抗肿瘤活性奠定了基础.